Question 1

¿Cuáles son las dos principales moléculas de ADN requeridas para comenzar la clonación molecular?

Accepted Answer

La clonación molecular requiere un inserto—el fragmento de ADN que deseas copiar, que puede provenir de procariotas, eucariotas o ser creado artificialmente—y un vector, típicamente ADN plasmídico que se replica en células huésped. El vector lleva sitios de reconocimiento para enzimas de restricción y contiene un origen de replicación y un gen de resistencia a antibióticos para la selección.

Question 2

¿Cómo ayuda un vector plasmídico a identificar bacterias transformadas con éxito?

Accepted Answer

Los plásmidos contienen un gen de resistencia a antibióticos que permite que las bacterias que llevan el plásmido sobrevivan en medios que contienen antibióticos. Cuando las bacterias transformadas se cultivan en agar con antibióticos y se incuban durante la noche a 37°C, solo sobreviven las colonias con el plásmido, lo que hace que la selección con antibióticos sea un método de selección efectivo para la transformación exitosa.

Question 3

¿Cuál es el propósito de la purificación en gel en el procedimiento de clonación molecular?

Accepted Answer

La purificación en gel separa y aísla la digestión de la enzima de restricción Fragmentos de ADN después de deseada. Para los plásmidos, este paso elimina el plásmido circular no cortado que aparece como una mancha de alto peso molecular, dejando solo el plásmido linealizado listo para la ligación con el inserto. Esto asegura un ADN limpio y puro para los pasos subsiguientes.

Question 4

¿Por qué es importante planificar una estrategia de clonación antes de comenzar el procedimiento?

Accepted Answer

La planificación garantiza que selecciones sitios de restricción ausentes de tu inserto para evitar cortarlo durante la digestión. También debes verificar que tus sitios elegidos existan en el sitio de clonación múltiple del plásmido. Esta estrategia previene intentos fallidos de clonación y ahorra tiempo al identificar problemas potenciales como la necesidad de una ligación de extremos romos antes de comenzar.

Question 5

¿Cuál es la proporción óptima de inserto a vector para las reacciones de ligación de ADN?

Accepted Answer

Se recomienda una proporción inserto-vector de 3 a 1 para Reacciones de ligación de ADN. Esta proporción asegura una auto-ligación mínima del vector por sí solo. Después de la configuración sobre hielo, la ligación se incuba entre 14-25°C durante 1 hora hasta una noche para permitir que la ADN ligasa una el inserto y el plásmido.

Question 6

¿Cómo se utiliza la secuenciación para verificar la clonación molecular exitosa?

Accepted Answer

La secuenciación sirve como el paso final de verificación para confirmar que el gen de interés ha sido clonado correctamente en el plásmido. Después de que la digestión con enzimas de restricción confirma la presencia del inserto en un gel, las bacterias se expanden y los plásmidos se purifican. La secuenciación luego verifica que la secuencia del inserto coincida con el fragmento de ADN deseado.

Question 7

¿Cuáles son algunas aplicaciones prácticas de la clonación molecular en la investigación?

Accepted Answer

La clonación molecular permite la creación de bibliotecas de cDNA a partir de ARNm, la reconstrucción de vías biosintéticas mediante la reorganización de grupos génicos entre cepas bacterianas, la generación de bibliotecas de mutantes utilizando polimerasas propensas al error y la incorporación de genes reportadores como la proteína fluorescente verde en plásmidos para visualizar la expresión génica y la infección viral.

Clonación molecular - Cuestionario de evaluación