Aislamiento de Ácidos Nucleicos de levadura

Isolating Nucleic Acids from Yeast

JoVE Science Education
Biology I: yeast, Drosophila and C. elegans

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JoVE Science Education Biology I: yeast, Drosophila and C. elegans

Isolating Nucleic Acids from Yeast

3.2: Drosophila Maintenance

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06:49 min

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May 10, 2013

Overview

Una de las muchas ventajas de utilizar levadura como un modelo de sistema es que grandes cantidades de biomacromoléculas, incluyendo los ácidos nucleicos (ADN y ARN), pueden ser purificadas de las células cultivadas.

Este video dirigirá a los pasos necesarios para llevar a cabo la extracción de ácidos nucleicos. Vamos a empezar por esbozar brevemente el crecimiento y la cosecha y lisis de las células de la levadura, que son los pasos iniciales comunes para el aislamiento de biomacromoléculas todos. A continuación, hablaremos de dos métodos de purificación único para la separación de ácidos nucleicos: Unión de columnas y separación de fases. Además, le mostraremos varias maneras en que estos métodos se aplican en el laboratorio, incluyendo la preparación de ácidos nucleicos por técnicas de biología molecular como PCR y southern Blot, cuantificación de la expresión génica en respuesta a estímulos ambientales y purificación de grandes cantidades de proteínas recombinantes.

Procedure

Hoy nos mostrará usted cómo purificar ácidos nucleicos de Saccharomyces cerevisiae, también conocido como levadura. Pueden incluir los ácidos nucleicos ADN o ARN. Este video hablará sobre el aislamiento de estas moléculas de las células de levadura por cromatografía y separación de fases.

Aunque muchos métodos existen para purificar los ácidos nucleic de la levadura, la mayoría de ellos comparte los mismos pasos iniciales.

Las células de levadura se propagan primero seleccionando una sola Colonia de una placa y inocular en medio YPD. La mezcla debe cultivarse durante la noche a 30 ° C en agitación o rotación incubadora.

Células de levadura se deben cosechar en la fase de registro medio de crecimiento para optimizar el rendimiento. Levadura en la fase logarítmica de crecimiento tendrá generalmente una densidad óptica o &quo; OD &quo; valor de 0.5-1 cuando se mide a una longitud de onda de 600 nm. Una vez que las células han alcanzado la densidad óptica adecuada, son centrifugados para formar un pellet y serán suspendidas en tampón de lisis para que las células están quebradas se abren.

Uno de los aspectos más difíciles de aislar los ácidos nucleic de la levadura está interfiriendo con sus resistentes paredes celulares. Las paredes celulares pueden ser destruidas con una combinación de técnicas enzimáticas y físicas. La destrucción de la pared celular hace que la levadura formar células de esferoide llamadas Esferoplastos que pueden lisis mediante técnicas de lisis celular estándar.

Esferoplastos son típicamente lisis con detergentes químicos como dodecil sulfato de sodio SDS, que Lisan las membranas celulares. Las células también pueden ser homogeneizadas. Por ejemplo, granos de cristal pueden añadirse a las células y las células homogeneizadas con un vórtex. O las paredes celulares puede interrumpirse con el sonido de ultra alta frecuencia, utilizando un sonicador para ayudar en el proceso de lisis.

Como se ha mencionado todos los procedimientos de purificación de ácidos nucleicos en levadura tendrá pasos similares para crecer, cosecha y lisis de la levadura las células, sin embargo una vez que las células son sometidas a lisis, varios métodos pueden utilizarse para aislar los ácidos nucleicos. Los ácidos nucleicos puede ser purificados a través de enlace de la columna o separación de fases.

ADN y ARN están mejor aislados usando el enlace de la columna de sílice. Los ácidos nucleicos se unen a la columna a través del intercambio de aniones y puede eluidos de la columna una vez separada de otros componentes celulares.

Separación de la fase utiliza el principio que soluciones con diferentes propiedades pueden utilizarse para purificar o concentrar ciertas proteínas o ácidos nucleicos basan en su solubilidad. La adición de cloroformo distingue una mezcla de componentes de la célula en dos diferentes fases, la acuosas y orgánicas. La fase orgánica contienen proteínas mientras que la fase de aqueos contiene ácidos nucleicos. Entonces puede precipitar el ADN de la fase orgánica con la adición de etanol.

Los ácidos nucleicos puede ser aislados de la levadura utilizando un protocolo de enlace de la columna. En primer lugar, las células son crecidas y cosechadas por centrifugación.

El sobrenadante se extrae y se descarta mientras el precipitado celular se resuspendió en que contiene la enzima tampón, agitarse y se incubó hasta que las paredes celulares son digeridas. Digestión de la pared celular y formación del spheroplast pueden verificarse con microscopia cuando optimizar tratamiento enzimático. Después de la digestión de la pared celular, se añade tampón de lisis a las células y la mezcla se agitó.

Las células sometidas a lisis deben centrifugarse para aclarar la mezcla de residuos, dejando el DNA y pequeñas partículas y proteínas solubles en el sobrenadante. El sobrenadante es cargado en una columna de sílice y los ácidos nucleicos se permite entonces atan después de centrifugación, que eliminará una mayor parte de las impurezas solubles.

Pasos de lavado se realizan con etanol o tampón salino alto para eliminar las impurezas residuales de ácidos nucleicos dependientes. Finalmente, el DNA o el RNA es eluted con agua o un tampón bajo en sal. Asegúrese de usar un tampón o el agua que está libre de las enzimas DNasa y Rnasa.

Ácidos nucleicos aislados de la levadura tienen una variedad de usos dependiendo de su objetivo experimental específico. ADN aislado de la levadura puede ser utilizado para una serie de técnicas de biología molecular diferentes incluyendo: PCR, southern Blot o digestión de la enzima de restricción.

Cambios en la expresión génica pueden identificarse por un proceso conocido como análisis de microarrays, que utiliza arrays gene como esta.

Si tenemos dos cultivos de levadura, uno expuesto al peróxido de hidrógeno y un control, mRNA puede ser aislado de estas culturas y cruzado por hibridación en microarrays diapositivas. Las diapositivas son analizadas y pueden ser identificados los genes que son modificados por el estrés oxidativo.

En este video, los investigadores hacen uso de un sistema robótico para preparar una biblioteca de mutantes de todo el genoma de levadura, que se utilizan para evaluar la función del gene. Debido a las secuencias de inserción diseñado específicamente, llamado código de barras genético, en genes de ADN genómico de cepas mutantes puede extraído de 4.000 a 6.000 personas simultáneamente y sometido a análisis de microarrays o secuenciación. Basado en la abundancia relativa de las secuencias de código de barras, se puede determinar la aptitud de cada mutante en varias condiciones experimentales.

Sólo has visto video de Zeus en aislar los ácidos nucleic de la levadura. Ahora debe comprender los aspectos básicos de la purificación de los ácidos nucleic tales como preparar levadura células por lisis y cómo llevar a cabo diferentes procedimientos de extracción y aislamiento. ¡Como siempre, gracias por ver!

Transcript

Today we will be showing you how to purify nucleic acids from Saccharomyces cerevisiae, also known as baker’s yeast. Nucleic acids can include DNA or RNA. This video will discuss the isolation of these molecules from yeast cells by phase separation and chromatography.

Though many different methods exist to purify nucleic acids from yeast, most of them share the same initial steps.

Yeast cells are first propagated by selecting a single colony from a plate and inoculating into YPD media. The mixture should be grown overnight at 30 °C in a shaking or rotating incubator.

Yeast cells should be harvested in the mid-log phase of growth to optimize yield. Yeast in the log phase of growth will usually have an optical density or “OD” value of 0.5-1 when measured at a wavelength of 600 nm. Once cells have reached the appropriate optical density, they are centrifuged to form a pellet, and resuspended in lysis buffer so that cells are broken open.

One of the most challenging aspects of isolating nucleic acids from yeast is disrupting its tough cell walls. Cell walls can be destroyed with a combination of enzymatic and physical techniques. The destruction of the cell wall causes yeast to form spheroid cells called spheroplasts that can be lysed via standard cell lysis techniques.

Spheroplasts are typically lysed with chemical detergents such as sodium dodecyl sulfate or SDS, which lyse cellular membranes. Cells can also be homogenized. For instance, glass beads can be added to cells and cells homogenized by vortexing. Or cell walls can be disrupted with ultra-high frequency sound, using a sonicator, to aid in the lysis process.

As mentioned all nucleic acid purification procedures done in yeast will have similar steps for growing up, harvesting, and lysing yeast cells, however once cells are lysed, several different methods can be used to isolate nucleic acids. Nucleic acids can be purified through column binding or phase separation.

DNA and RNA are best-isolated using silica column binding. Nucleic acids will bind to the column through anion exchange and can be eluted from the column once separated from other cellular components.

Phase separation uses the principle that solutions with different properties can be used to purify or concentrate certain proteins or nucleic acids based on their solubility. The addition of chloroform differentiates a slurry of cell components into two different phases, the aqueous and organic. The organic phase contain proteins while the aqueos phase contains nucleic acids. The DNA can then be precipitated from the organic phase with the addition of ethanol.

Nucleic acids can be isolated from yeast using a column binding protocol. First, cells are grown up and harvested by centrifugation.

The supernatant is removed and discarded while the cell pellet is resuspended in enzyme-containing buffer, vortexed, and incubated until cell walls are digested. Cell wall digestion and spheroplast formation can be verified with microscopy when optimizing enzyme treatment. After cell wall digestion, lysis buffer is added to the cells and the mixture is vortexed.

The lysed cells should be centrifuged to clarify the mixture of debris, leaving DNA and small particulates and soluble proteins in the supernatant. The supernatant is loaded onto a silica column and nucleic acids are then allowed to bind following centrifugation, which will remove a bulk of the soluble impurities.

Washing steps are performed with ethanol or high salt buffer to remove residual impurities from the bound nucleic acids. Finally, the DNA or RNA is eluted with water or a buffer low in salt. Be sure to use a buffer or water that is free of the enzymes DNAse and RNAse.

Nucleic acids isolated from yeast have a variety of uses depending on your specific experimental goal. DNA isolated from yeast can be used for a number of different molecular biology techniques including: PCR, southern blotting, or restriction enzyme digestion.

Changes in gene expression can be identified by a process known as microarray analysis, which uses gene arrays like this one.

If we have two yeast cultures, one exposed to hydrogen peroxide and one a control, mRNA can be isolated from these cultures and hybridized on microarray slides. The slides are analyzed and the genes that are modified by oxidative stress can be identified.

In this video, researchers make use of a robotic system to prepare a library of genome-wide yeast mutants, which are used to evaluate gene function. Due to the insertion specifically-engineered sequences, called genetic barcodes, into genes genomic DNA from mutant strains can be extracted from 4,000 to 6,000 individuals simultaneously and subjected to microarray analysis or sequencing. Based on the relative abundance of the barcode sequences, the fitness, of each mutant can be determined under multiple experimental conditions.

You’ve just watched JoVE’s video on isolating nucleic acids from yeast. You should now understand the basic aspects of purifying nucleic acids such how to prepare yeast cells for lysis and how to perform different extraction and isolation procedures. As always, thanks for watching!

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