Question 1

¿Cómo funciona la interferencia de ARN para silenciar genes en C. elegans?

Accepted Answer

El ARN bicatenario entra en las células de C. elegans después de la ingestión. La enzima Dicer cliva el ARNds en ARN de interferencia corta (siRNA), de 21-23 nucleótidos de largo. El siRNA se asocia con el complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC) y se une al ARNm diana mediante apareamiento complementario de bases, lo que conduce a la degradación del ARNm y a la reducción génica.

Question 2

¿Cuál es el primer paso para preparar bacterias para experimentos de ARNir?

Accepted Answer

Transforme el plásmido que codifica su dsRNA objetivo en la cepa HT115(DE3) de E. coli, que carece de ARN polimerasa III y contiene un gen de polimerasa de ADN T7 inducible por IPTG. También transforme bacterias con un plásmido vacío como control. Extienda las bacterias transformadas en placas de agar LB que contienen tetraciclina y carbenicilina, luego incube durante la noche a 37°C.

Question 3

¿Por qué es importante la sincronización de los gusanos antes del tratamiento de RNAi?

Accepted Answer

La sincronización de las etapas de desarrollo asegura que las diferencias fenotípicas observadas resulten de la reducción génica en lugar de la variación del desarrollo. Transfiera los gusanos L4 a placas RNAi durante la noche a 20°C para que se conviertan en adultos jóvenes, luego muévalos a nuevas placas durante 6-8 horas para que pongan huevos. Esto produce una progenie sincronizada de desarrollo para el análisis.

Question 4

¿Cómo utilizan los investigadores el RNAi para realizar pantallas genéticas inversas?

Accepted Answer

Las pantallas genéticas inversas eliminan genes conocidos de una biblioteca y evalúan los resultados fenotípicos para descubrir la función de los genes. Los investigadores cultivan bacterias que expresan dsRNA para muchos genes de C. elegans en placas de múltiples pocillos y los alimentan a los gusanos. Los efectos fenotípicos revelan funciones normales de genes in vivo y pueden automatizarse para el análisis de alto rendimiento de miles de genes.

Question 5

¿Qué sucede durante la fase de preparación del cultivo bacteriano?

Accepted Answer

Seleccione una sola colonia bacteriana y añádila a 1 ml de caldo LB con 100 μg/ml de ampicilina. Incube durante la noche a 37°C con agitación. Luego añada 5 ml de caldo LB fresco con ampicilina e incube durante 4-6 horas a 37°C. Este cultivo se añade entonces a placas de gusanos RNAi y se incuba durante la noche a 37°C para crear un césped bacteriano.

Question 6

¿Qué fenotipos pueden observarse al analizar gusanos tratados con RNAi?

Accepted Answer

Comparar gusanos RNAi knockdown con controles y observar las diferencias en tamaño, etapa de desarrollo, morfología y patrones de localización de proteínas marcadas con fluorescencia. Los científicos también pueden evaluar efectos en el tiempo de desarrollo, como genes que retrasan el desarrollo cuando se eliminan, u otros genes involucrados en procesos biológicos desarrollo y de órganos.

Question 7

¿Cómo se prepara un portaobjetos de microscopio para visualizar C. elegans?

Accepted Answer

Pegue dos portaobjetos de vidrio con cinta adhesiva como espaciadores. Coloque un portaobjetos limpio entre ellos y pipete 150 μl de agar fundido al 4% sobre él. Cubra con un portaobjetos perpendicular, luego separe suavemente. Agregue 10 μl de azida sódica anestésica al disco de agar, transfiera los gusanos usando una puntilla de platino, agregue un cubreobjetos y observe bajo un microscopio.

RNAi en C. elegans - Cuestionario de evaluación