IHC de larvas de Drosophila

<em>Drosophila</em> Larval IHC

JoVE Science Education
Biology I: yeast, Drosophila and C. elegans

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

JoVE Science Education Biology I: yeast, Drosophila and C. elegans

Drosophila Larval IHC

3.2: Drosophila Maintenance

17,843 Views

•

08:29 min

•

May 10, 2013

Overview

Inmunohistoquímica (IHC) es una técnica utilizada para visualizar la presencia y localización de proteínas en los tejidos. Las larvas de Drosophila son particularmente susceptibles de IHC debido a la facilidad con que puede ser procesados para la tinción. Además, las larvas son transparentes, lo que significa que los tejidos pueden ser visualizados sin necesidad de disección.

En IHC, las proteínas se detectan en última instancia con los anticuerpos que se unen específicamente a “epitopes” dentro de la proteína de interés. Para preservar estos epítopos, los tejidos deben ser fijados antes de la tinción. Además, a fin de anticuerpos penetrar en las membranas, las células deben permeabilized con detergentes. Este artículo de video ofrece una vista detallada de los reactivos, instrumentos y procedimientos necesarios para la tinción de tejidos larvales disecados, incluyendo fijación, bloqueo y pasos de tinción. También es una demostración de tejido técnicas de montaje para microscopía de fluorescencia. Finalmente, se proporcionan ejemplos de la amplia gama de aplicaciones de estas técnicas (y algunas variaciones sobre ellos).

Procedure

Drosophila melanogaster es un organismo modelo ampliamente estudiado debido a su versatilidad y facilidad de uso.

Inmunohistoquímica en preparaciones de larvas de Drosophila es un método valioso que puede proporcionar información sobre la presencia, localización y colocalización de proteínas.

Este video cubre los métodos esenciales para la disección, fijación, bloqueo y montaje del tejido larvas de Drosophila y ejemplos de sus aplicaciones.

Inmunohistoquímica es modificado de un proceso que utiliza anticuerpos para apuntar, enlazar y visualizar, en definitiva, las proteínas específicas en el tejido.

Inmunohistoquímica de la larva de Drosophila depende de disección adecuada, que exige precisión y puntualidad debido a la sensibilidad de los tejidos larvales.

La disección se realiza típicamente en tampón fosfato salino, o “PBS” para abreviar.

Sobre extracción de órganos se colocan temporalmente en PBS – una solución salina con el mismo pH como el pH interno de la larva.

Después de la disección el siguiente paso en Drosophila larva IHC es fijación.

La fijación es un proceso donde el tejido se coloca en una solución basada en formaldehído diluida, que conserva el tejido.

Esta solución de fijación impide la degradación enzimática de las proteínas en el tejido.

Tras fijación, varios pasos de lavado producen durante todo el proceso de inmunotinción con PBS conteniendo Triton-X, llamado SAFT.

Triton-X100 proporciona una pequeña cantidad de detergente que sirve como un interruptor de tensión superficial y permeabilizes la célula, permitiendo que los anticuerpos y otros reactivos para entrar.

Después de la fijación y el lavado, el tejido está listo para bloquear.

Solución de bloqueo contiene proteínas que se unen al tejido y ocupan sitios de Unión inespecíficos que de lo contrario serían cumplir los anticuerpos específicos del destino. El bloqueo ayuda a evitar que la señal de un falso positivo de la proteína.

Tras bloquear el tejido está preparado para la tinción.

La coloración incorpora altamente específico anticuerpo «primario» que se une a una proteína Diana llamada antígeno.

Un “secundario” anticuerpos conjugados a una molécula de los periodista une al anticuerpo primario.

La molécula de los periodista emite una señal localizada que puede ser visualizada, que a menudo es fluorescente en la naturaleza.

Tras el paso de incubación de cada anticuerpo, anticuerpo exceso se lava para eliminar los anticuerpos que han consolidado un.

Después del proceso de tinción, la muestra debe ser montada.

Para ver los resultados de la coloración, el tejido debe ser cuidadosamente montado en diapositivas.

Se utiliza un reactivo grueso o medio de montaje para encajonar el tejido.

La muestra es entonces lista para ser vista bajo el microscopio.

Ahora que hemos pasado a través de los principios de inmunohistoquímica de Drosophila , estamos listos para ver cómo se hace.

En este video nos centraremos en los reactivos, instrumentos y procesos utilizados en la inmunohistoquímica del principio de cerebro larvas de Drosophila con fijación.

El proceso que estamos siguiendo utiliza todo el cerebro y se conoce como Monte toda la coloración.

Mientras que el procedimiento de disección difiere dependiendo del tipo de tejido utilizado para el experimento, los principales pasos de IHC siguen siendo los mismos por lo que podrá saltarse el paso de fijación.

Una vez completada la disección del cerebro larvas, quitar PBS con una pipeta.

Añadir fijador e incubar según el protocolo específico, para cerebros 23 min.

Tras fijación, lavar las muestras cuatro veces en SAFT.

Incubar las muestras en solución para por lo menos 30 min temperatura de bloqueo.

Utilizando las diluciones apropiadas, incubar en la solución de anticuerpo primario durante la noche a 4 ° C.

Después de la incubación lavar cerebros cuatro veces previamente en SAFT con una punta de pipeta a temperatura ambiente.

Incubar las muestras en el anticuerpo secundario durante la noche a 4 ° C en la oscuridad para impedir el blanqueo de los fluoróforos.

Una vez más, lavar cerebros cuatro veces en SAFT.

Equilibre los cerebros en el medio de montaje durante una hora.

Después de equilibrar la transferencia los cerebros en una diapositiva con una pipeta de p200 con la punta cortada.

Coloque los espaciadores alrededor de la muestra para evitar que se aplaste.

Coloque un cubreobjetos sobre las muestras.

Sellar los bordes de deslizamiento con esmalte de uñas. Cerebros larvales están listos para ser visualizado con inmunohistoquímica

Ahora que hemos cubierto la inmunohistoquímica del cerebro de Drosophila , Veamos algunas formas alternativas de aplicación de procedimientos de IHC.

Alternativas técnicas de disección y fijación pueden utilizarse para preparar larva Drosophila para la proyección de imagen.

En este experimento, los investigadores quieren saber cómo las células generan formas específicas.

Lo hacen trazando las morfologías de larvas traqueales células terminales.

Los investigadores, aprovechando una línea mutante de mosca que expresa GFP.

La expresión de GFP es inducida por exposición al calor en baño de agua

Las larvas son seleccionadas bajo un microscopio de disección con fluorescencia.

Vuela emitiendo fluorescencia indica activación con éxito de GFP.

Estas moscas son sometidas a una forma alternativa de fijación por calor; la disección no es necesaria.

Después de usar el software para ayudar a la localización, morfología celular de ramas traqueales y lumen se identifica.

El ovario del Drosophila es un excelente modelo para entender cómo las células madre interactuar con su entorno celular.

IHC de Drosophila ovarios comienza por identificar las hembras de Drosophila por presencia de ovarios contra testículos, que son evidentes en los machos.

Recogido las larvas hembra se transfieren a pocillos individuales donde se disecan cuidadosamente para obtener una estructura conocida como la grasa corporal, que alberga los ovarios.

Cuerpos grasos son fijos y manchados, y luego – después de colocar el tejido en diapositivas – los ovarios están separados del tejido de la grasa corporal. Después de montaje y visualización de las diapositivas, tinción fluorescente revela la ubicación de las células somáticas y células de germen primordiales en el ovario larval.

Inmunohistoquímica de las larvas de Drosophila tiene muchos paralelos a IHC pupa y adulto.

Por ejemplo, los investigadores pueden utilizar IHC para buscar en retinas de Drosophila en diferentes etapas de desarrollo: larvas, pupa y adulto, lo que ilustra la diferencia entre los procedimientos de inmunohistoquímica pupas, larvas y adultos.

Los resultados muestran las distintas etapas de desarrollo de retinas de Drosophila .

Inmunohistoquímica de la larva de Drosophila es una herramienta con una gran cantidad de aplicaciones y variaciones. En este video cubrimos los procedimientos para larvas de immunostaining, incluyendo disección, fijación, tinción y montaje. ¡Gracias por ver!

Transcript

Drosophila melanogaster is a widely studied model organism due to its versatility and facility of use.

Immunohistochemistry performed on Drosophila larval preparations is an invaluable method that can provide information on the presence, location, and the co-localization of proteins.

This video will cover the essential methods for the dissection, fixation, blocking, and mounting of Drosophila larval tissue and examples of their applications.

Immunohistochemistry is a process that uses modified antibodies to target, bind, and ultimately visualize specific proteins in tissue.

Immunohistochemistry of Drosophila larva hinges on proper dissection, which demands accuracy and timeliness due to the sensitivity of larval tissue.

Dissection is typically done in phosphate buffered saline, or “PBS” for short.

Upon extraction organs are temporarily placed in PBS – a saline solution with the same pH as the internal pH of the larva.

After dissection the next step in Drosophila larva IHC is fixation.

Fixation is a process where tissue is placed in a diluted formaldehyde-based solution, which preserves tissue.

This fixing solution prevents the enzymatic breakdown of proteins in tissue.

Following fixation, several washing steps occur throughout the immunostaining process using PBS containing Triton-X, called PBST.

Triton-X100 provides a small amount of detergent that serves as a surface tension breaker and permeabilizes the cell, allowing antibodies and other reagents to enter.

After fixation and washing, the tissue is ready for blocking.

Blocking solution contains proteins that bind to tissue and occupy non-specific binding sites to which the target-specific antibodies would otherwise adhere. Blocking helps to prevent a false positive protein signal.

After blocking the tissue is prepared for staining.

Staining incorporates highly-specific “primary” antibody that binds to a target protein called an antigen.

A “secondary” antibody conjugated to a reporter molecule binds the primary antibody.

The reporter molecule emits a localized signal that can be visualized, which is often fluorescent in nature.

Following each antibody incubation step, excess antibody is washed off to remove any antibodies that have bound nonspecifically.

After the staining process, the sample must be mounted.

In order to see the results of staining, the tissue must be carefully mounted onto slides.

A thick reagent or mounting medium is used to encase the tissue.

The sample is then ready to be viewed under the microscope.

Now that we’ve gone through the principles of Drosophila immunohistochemistry, we’re ready to see how it’s done.

In this video we’ll focus on the reagents, tools, and processes used in the immunohistochemistry of the Drosophila larval brain beginning with fixation.

The process we are following uses the entire brain and is known as whole mount staining.

While the dissection procedure differs depending on the tissue type used for the experiment, the major steps of IHC remain the same so we’ll skip to the fixation step.

Once dissection of larval brains is complete, remove PBS with a pipette.

Add fixative and incubate for according to your specific protocol, for brains use 23 min.

Following fixation, wash samples four times in PBST.

Incubate samples in blocking solution for at least 30 min room temperature.

Using the appropriate dilutions, incubate in primary antibody solution overnight at 4 °C.

After the incubation period wash brains four times in PBST with a pipette tip at room temperature.

Incubate the samples in secondary antibody overnight at 4 °C in the dark to prevent the fluorophores from bleaching.

Again, wash brains four times in PBST.

Equilibrate the brains in mounting medium for one hour.

After equilibration transfer the brains to a slide using a p200 pipette with the tip cut off.

Place spacers around the sample to prevent it from being crushed.

Place a coverslip over the samples.

Seal the slip edges with nail polish. Larval brains are now ready to be visualized with immunohistochemistry

Now that we’ve covered the immunohistochemistry of Drosophila brains, let’s go through some alternative ways of applying IHC procedures.

Alternative dissection and fixation techniques can be used to prepare Drosophila larva for imaging.

In this experiment, researchers want to learn how cells generate specific shapes.

They do this by tracing the morphologies of larval tracheal terminal cells.

The researchers take advantage of a mutant fly line that expresses GFP.

The GFP expression is induced by exposure to heat in a water bath

Larvae are selected under a dissection microscope with fluorescence.

Flies emitting fluorescence indicate successful activation of GFP.

These flies are submitted to an alternative form of fixation by heat; no dissection is necessary.

After using software to assist tracing, cellular morphologies of tracheal branches and lumen are identified .

The Drosophila ovary is an excellent model for understanding how stem cells interact with their cellular environment.

IHC of Drosophila ovaries begins by identifying Drosophila females by presence of ovaries versus testes, which are apparent in males.

Collected female larvae are transferred to individual wells where they are carefully dissected to obtain a structure known as the fat body, which houses the ovaries.

Fat bodies are fixed and stained, and then – after placing the tissue on slides – the ovaries are separated from fat body tissue. After mounting and visualizing the slides, fluorescent staining reveals the location of somatic cells and primordial germ cells in the larval ovary .

Immunohistochemistry of Drosophila larvae has many parallels to pupal and adult IHC.

For example, researchers can use IHC to look at Drosophila retinas at different developmental stages: larval, pupal, and adult, thereby illustrating the difference between pupal, larval, and adult immunohistochemistry procedures.

Results show the various stages of development of Drosophila retinas.

Immunohistochemistry of Drosophila larva is a tool with a large amount of applications and variations. In this video we covered the procedures for immunostaining larvae including dissection, fixation, staining, and mounting. Thanks for watching!