Clasificación de

El objetivo general de este procedimiento es clasificar los pellet miceliares formados por Streptomyces filamentosos según su tamaño, utilizando un citómetro de flujo COPA para partículas grandes. Esto se logra primero mediante el crecimiento y posterior muestreo de la cepa bacteriana deseada. En el segundo paso, la cepa muestra se mide mediante COPA.

Los datos se analizan luego in silico y los pellets miceliares se clasifican según parámetros definidos por el usuario. En última instancia, estos análisis pueden utilizarse para caracterizar más detalladamente la heterogeneidad del tamaño de los pellets. Aunque este método puede emplearse para Streptomyces, también puede aplicarse a otros organismos como hongos filamentosos. Este procedimiento lo demostrará MaRous Petrus, estudiante de doctorado de nuestro laboratorio.

Primero, cultive las muestras añadiendo 100 mililitros de medio de extracto de levadura y extracto de malta y 0,2 mililitros de cloruro de magnesio 2,5 molar a un matraz erlenmeyer estéril de 250 mililitros, equipado con resortes metálicos enrollados, por cada muestra bacteriana. A continuación, inocule cada matraz con uno por diez a la ocho esporas de Streptomyces para obtener una concentración de esporas de uno por diez a la seis esporas por mililitro y cultive las bacterias a 30 grados Celsius con agitación a 180 RPM. Después de dos días, utilice una pipeta estéril de cinco mililitros para recoger una muestra de cinco mililitros de cada cultivo, agitando suavemente el matraz para distribuir uniformemente las células.

Luego, distribuya cada muestra en tubos cónicos individuales de 15 mililitros. Para evaluar las muestras mediante análisis de copus, asegúrese de que el ordenador de copus más bomba y el láser de argón de 488 nanómetros estén encendidos, y luego abra el software de fuente biológica. Confirme que la botella de fluido de envolvente esté llena y que la botella de desecho esté vacía, y a continuación haga clic en iniciar y ejecutar.

Para activar el láser de argón de 488 nanómetros desde el modo de espera, espere aproximadamente 60 segundos hasta que el láser esté listo. Haga clic, finalice y luego verifique los manómetros. Haga clic en la casilla junto a presión.

Vale, y luego, tras la cebado del sistema de la celda de flujo, confirme que la configuración de retardo esté en 11 y que el ancho esté en siete. Establezca los umbrales en 50 para la señal y en 40 para el tiempo mínimo de vuelo. A continuación, retire el agua residual del vaso de muestra.

Añada aproximadamente 50 mililitros de PBS y luego agregue 0,1 mililitro de una de las muestras de strep demy al vaso. Asegúrese de que el vaso esté bien cerrado y luego haga clic en adquirir para comenzar a recopilar datos. Controle la velocidad de flujo para obtener entre 30 y 50 eventos por segundo cuando se hayan recolectado al menos 2.500 eventos.

Haga clic, detenga y luego almacene para guardar los datos para un análisis estadístico posterior a fin de clasificar los pellet bacterianos de cada muestra. Primero, establezca los límites de clasificación e ingrese los detalles sobre los valores mínimos y máximos de tiempo de vuelo. Alternativamente, seleccione regiones y luego defina la región de puerta para crear un área que permita seleccionar los pellet con las dimensiones y propiedades deseadas.

Coloque un tubo de 50 mililitros para recoger los pellets que cumplan con los parámetros de clasificación. Luego, establezca el número de pellets que se deben clasificar y haga clic en clasificar manualmente para ordenar según los parámetros seleccionados. Después de la clasificación, retire la muestra sobrante y enjuague la copa de muestra con agua dos veces.

Antes de apagar el copus, limpie la copa de muestra con etanol al 70 %. Ahora ejecute el sistema dos veces: una con agua clorada y otra con agua pura, luego vacíe el recipiente de desbordamiento. Después de la limpieza, haga clic en detener para liberar la presión del sistema.

Cuando el motor se detenga, cierre el programa y haga clic en apagar sin purgar. Luego apague la computadora, la copa, el láser y la bomba streptomyces form. Pellets miceliales y cultivos líquidos que tienen una amplia gama de tamaños.

Para analizar la distribución del tamaño de los pellet, una cultura de streptomyces cila color cultivada en líquido de dos días de antigüedad fue sometida a citometría de flujo de partículas grandes utilizando un perfilador copus plus equipado con una boquilla de un milímetro. Aquí se muestra un gráfico de dispersión típico de la salida copus. El eje x representa el tiempo de vuelo.

Cuanto mayor sea el tamaño del agregado, más tiempo tardará en atravesar el haz láser. El eje Y indica la extinción, que representa la densidad óptica del objeto; cada punto corresponde a un solo agregado que pasa a través del haz láser. Al representar los puntos de datos en un histograma, se observó que los tamaños de esta muestra representativa no seguían una distribución normal.

La distribución parecía estar sesgada hacia la derecha en escala logarítmica. Transformar el conjunto de datos tampoco condujo a una distribución normal. Para evaluar si la distribución de tamaños podría explicarse suponiendo una mezcla de dos distribuciones normales, se realizó una modelización matemática de los datos. El modelado indicó efectivamente una población de pelotillas pequeñas, que representaban el 92 % de todas las pelotillas, con un tamaño promedio de 248 micrómetros, y una población de pelotillas grandes, que comprendía el 8 % de todas las pelotillas, con un tamaño promedio de 319 micrómetros.

Aquí se muestra un análisis representativo de microcolonias clasificadas a partir de las poblaciones de pellet grande y pequeño. Los tamaños promedio de pellet de las dos poblaciones se utilizaron para definir los límites de clasificación, con el fin de limitar el ordenamiento de pellets provenientes de la porción solapada de las dos distribuciones de tamaño: los pellets menores a 248 micrómetros se consideraron pertenecientes a la población de pellet pequeño, mientras que los pellets mayores a 319 micrómetros se consideraron pertenecientes a la población de pellet grande. El análisis microscópico de los pellets clasificados confirmó sus tamaños distintos tras seguir este procedimiento.

Se pueden realizar otros métodos como la secuenciación de próxima generación o la proteómica para desentrañar los mecanismos subyacentes de esta heterogeneidad.