Clasificación de Streptomyces Pellets de celda que utilizan un objeto complejo paramétrico Analyzer y Clasificador

El objetivo general de este procedimiento es clasificar los gránulos miceliales formados por estreptomices filamentosos según su tamaño, utilizando un citómetro de flujo COPA de partículas grandes. Esto se logra primero mediante el crecimiento y el posterior muestreo de la cepa bacteriana deseada. En el segundo paso, la cepa de la muestra se mide con coppa.

A continuación, los datos se analizan in silico y los gránulos miceliales se clasifican según los parámetros definidos por el usuario. En última instancia, estos análisis se pueden utilizar para caracterizar aún más la heterogeneidad del tamaño de los gránulos. Aunque este método se puede utilizar para los estreptomíceos, también se puede aplicar a otros organismos como los hongos filamentosos, lo que demostrará este procedimiento MaRous Petrus, estudiante de doctorado de nuestro laboratorio.

En primer lugar, cultive los cultivos añadiendo 100 mililitros de extracto de levadura, medio de extracto de malta y 0,2 mililitros de cloruro de magnesio de 2,5 molares a un matraz Erlenmeyer estéril de 250 mililitros, equipado con muelles metálicos en espiral para cada muestra bacteriana. A continuación, inocular cada matraz con una multiplicada por 10 por las ocho esporas de streptomyces para obtener una concentración de esporas de una por 10 por las seis esporas por mililitro y cultivar las bacterias a 30 grados centígrados con agitación a 180 RPM. Después de dos días, use una pipeta estéril de cinco mililitros para recolectar una muestra de cinco mililitros de cada cultivo mientras agita suavemente el matraz para distribuir uniformemente las células.

A continuación, dispense cada muestra en tubos cónicos individuales de 15 mililitros. Para evaluar las muestras mediante análisis de copus, confirme que la computadora de la bomba copus plus y el láser de argón de 488 nanómetros estén encendidos y, a continuación, abra el software de la fuente biológica. Confirme que la botella de líquido de la vaina está llena y que la botella de residuos está vacía y, a continuación, haga clic en iniciar y ejecutar.

Para cambiar el láser de argonne de 488 nanómetros de modo de espera a encendido después de aproximadamente 60 segundos, el láser estará listo. Haga clic, listo y luego verifique los manómetros. Haga clic en la casilla de verificación junto a presión.

Bien, y luego, después de que el sistema cebe la celda de flujo, confirme que la configuración de retardo esté en 11 y que el ancho esté en siete. Establezca los umbrales en 50 para la señal y 40 para el tiempo mínimo de vuelo. A continuación, retire el agua sobrante del vaso de muestra.

Agregue aproximadamente 50 mililitros de PBS y luego agregue 0.1 mililitros de una de las muestras de estreptococo en la taza. Asegúrese de que la copa esté cerrada correctamente y luego haga clic en adquirir para comenzar a recopilar datos. Gestione la velocidad del flujo para obtener entre 30 y 50 eventos por segundo cuando se hayan recopilado al menos 2.500 eventos.

Haga clic, detenga y, a continuación, almacene para guardar los datos para su posterior análisis estadístico y clasificar los gránulos bacterianos de cada muestra. En primer lugar, establezca los límites de clasificación e introduzca los detalles sobre los valores de tiempo mínimo y máximo de vuelo. Alternativamente, seleccione regiones y luego defina la región de la puerta para crear un área para seleccionar los pellets con las dimensiones y propiedades deseadas.

Coloque un tubo de 50 mililitros para recoger los pellets que cumplan con los parámetros de clasificación. A continuación, establezca el número de gránulos que se van a clasificar y haga clic en ordenar manualmente para ordenar los parámetros seleccionados. Después de la clasificación, retire la muestra sobrante y enjuague el recipiente de muestra con agua dos veces.

Antes de apagar el copus, limpie el recipiente de muestra con etanol al 70%. Ahora ejecute el sistema dos veces. Una vez con agua clorada y una vez con agua corriente, vacíe el recipiente de desbordamiento Después de la limpieza, haga clic en detener para liberar la presión del sistema.

Cuando el motor se detenga, cierre el programa y haga clic en apagar sin purgar. Luego apague la computadora, se forman la copa, el láser y la bomba de estreptomices. Pellets miceliales y cultivos líquidos que tienen una amplia gama de tamaños.

Para analizar la distribución del tamaño de los pellets, se sometió a citometría de flujo de partículas grandes un cultivo de color Streptomyces cila cultivado en líquido de dos días de edad utilizando un perfilador copus plus equipado con una boquilla de un milímetro. Aquí, se muestra un diagrama de dispersión de salida de copus típico. El eje x representa el tiempo de vuelo.

Cuanto más grande es la apelación, más tiempo tarda en pasar el rayo láser. El eje Y indica la extinción, que representa la densidad óptica del objeto, cada punto corresponde a un solo perdigón que pasa a través del rayo láser. El trazado de los puntos de datos en un histograma indicó que los tamaños de esta muestra representativa no se distribuían normalmente.

La distribución parecía estar sesgada hacia el tronco correcto. La transformación del conjunto de datos tampoco condujo a una distribución normal para evaluar si la distribución del tamaño podía explicarse asumiendo una mezcla de dos distribuciones normales, los datos se modelaron matemáticamente. De hecho, el modelado indicó una población de gránulos pequeños que consiste en el 92% de todos los pellets con un tamaño promedio de 248 micrómetros, y una población de gránulos grandes que comprende el 8% de todos los pellets con un tamaño promedio de 319 micrómetros.

Aquí se muestra un análisis representativo de las microcolonias clasificadas de las poblaciones grandes y pequeñas de pellets. Los tamaños promedio de los gránulos de las dos poblaciones se utilizaron para definir los límites de la clasificación, a fin de limitar la clasificación de los gránulos de la parte superpuesta de las dos distribuciones de tamaño: los gránulos menores de 248 micrómetros se consideraron de la población de gránulos pequeños, mientras que los gránulos mayores de 319 micrómetros se consideraron de la población de gránulos grandes. El análisis microscópico de los gránulos clasificados confirmó sus distintos tamaños siguiendo este procedimiento.

Se pueden realizar otros métodos, como la secuenciación de próxima generación o la proteómica, para desentrañar los mecanismos subyacentes de esta heterogeneidad.