Técnicas de microinyección en el pez cebra
Microinyección de embriones de pez cebra permite a los investigadores a soluciones directamente en el desarrollo animal, con el fin de estudiar la función genética y dinámica de desarrollo. Se utilizan con frecuencia los embriones desde la fase de 1 a 4 células de inyección. Porque hay membranas de separación de las células y la yema de huevo en esta primera etapa, soluciones que se inyecta en una célula o en la yema se extenderán uniformemente en todo el organismo. Mediante la microinyección, genes de producción de proteína pueden ser expresados o apagados, dependiendo del tipo de material inyectado. Este video se demuestran preparación de pipeta, colección embrionaria, el procedimiento de microinyección y discutir algunas de las formas de que esta técnica se utiliza en los laboratorios de hoy.
Primero, vamos a cubrir los principales componentes del sistema de microinyección: el estereoscopio, microinyector, soporte de pipeta y amalgamas dentales.
La microinyectora ofrece volumen preciso a través de pulsos de presión de aire, que puede ser ajustado por el usuario. El titular de la pipeta asegura la pipeta para su uso durante el procedimiento y lo conecta a la línea aérea del inyector. Por lo general, el titular de la pipeta se coloca en un micromanipulador. Este instrumento permite al investigador hacer pequeños y precisos ajustes en la ubicación de la pipeta durante el procedimiento de inyección. Un pedal está conectado al inyector y permite al investigador mantener el uso de sus manos mientras que al mismo tiempo activar el pulso de presión para la entrega de material de inyección. Finalmente, el estereoscopio permite al investigador ver los embriones y se centran en la localización de la pipeta durante el procedimiento de microinyección.
Antes de empezar microinyección, agujas de cristal deben ser preparadas. Agujas de microinyección deben ser de un tamaño constante para permitir la entrega precisa de material de inyección. Un extractor de pipeta ayuda a asegurar bien y sharp pipetas se preparan cada vez. El tirador calienta un tubo capilar de vidrio y ejerciendo fuerza que tira en el tubo, dando por resultado dos agujas de la pipeta.
Bajo el microscopio, con unas pinzas, la punta se corta de manera que permite un volumen constante de líquido para ser entregado, mantiene todavía la agudeza de la aguja para perforar el embrión de pez cebra.
Rojo de fenol, un colorante utilizado para ayudar a visualizar el procedimiento de la inyección, se puede mezclar con la solución de la inyección para detectar inyección acertada en el embrión.
Las agujas pueden cargarse con la solución de la inyección desde el lado de punta vía acción capilar, o pueden ser rellenados con una jeringa microloader. Una vez que se carga la aguja para la inyección, puede ser insertado en el soporte de pipetas en el micromanipulador.
Después de que las agujas de inyección estén listas, se ajustan los ajustes de presión y tiempo de microinyectora para calibrar cada aguja, que garanticen que un volumen constante se entrega a cada embrión. Bajo el estereoscopio, se inyecta una pequeña cantidad de solución en una gota de aceite mineral en una diapositiva. El tamaño de la gota se mide y se puede calcular el volumen que la aguja se dispersa. Posteriormente, la presión de la microinyectora puede ajustarse más y repite el proceso hasta que una gota del tamaño deseado se obtiene regularmente.
Una vez que las agujas están preparadas y calibradas, embriones obtenidos y arreglados para la inyección.
Embriones deben ser colocados cuidadosamente y sostenidos inmóviles durante la inyección por una cámara de microinyección. Para crear una cámara de microinyección, moldes se colocan en una placa Petri y agarosa fundida se vierte en el plato y se deja endurecer. Una vez que ha solidificado, se retira el molde y se vierte el medio de embrión en la parte superior. Los embriones pueden ser alineados en canales que fueron creadas por el molde utilizando una pipeta de transferencia. Una alternativa a los embriones en agarosa de arreglar es a les en el borde de un portaobjetos de microscopio, por lo que se colocan en una columna para microinyección
Una vez en posición, los embriones están listos para ser inyectados.
Embriones se pueden inyectar en la yema de huevo o de la célula citoplasma. Inyección en la yema de huevo es más sencilla y requiere menos sofisticada técnica de inyección, mientras que la inyección en el citoplasma es más difícil, pero produce resultados más robustos. Para inyectar en la yema de huevo, utilizar el instrumental quirúrgico para mover la aguja que perfora el corión y luego la yema. El pedal es luego aprovechado para provocar el contenido de la aguja para ser expulsados en yema de huevo. Difusión y flujo citoplásmico permite la solución de la inyección fluir en la célula.
Inyección en el citoplasma requiere cuidadosa colocación del embrión, por lo que el citoplasma puede orientarse eficazmente.
Después de la inyección, embriones son transferidos a una nueva placa y se incubó a 28,5 ° C. Con frecuencia se comprueban para eliminar embriones muertos.
Para determinar el éxito de la inyección, los embriones pueden analizarse basado en su aspecto general, la presencia de un marcador fluorescente y buscando cambios en su genoma mediante genotipificación.
Ahora que entiendes cómo inyectar embriones de pez cebra, veamos cómo los científicos pueden utilizar esta técnica para entender la función de los genes.
En primer lugar, los científicos pueden inyectar mRNA sintetizado para sobreexpresar ciertos genes y determinar su función, observando el fenotipo. Esta misma técnica puede utilizarse también para expresar proteínas que destacan acontecimientos moleculares, tales como los cambios citoesqueléticos que ocurren durante el desarrollo.
En segundo lugar, los genes se pueden apagar por la inyección de morfolinos. Morfolinos son análogos estables de ácido nucleico sintético que pueden ser diseñados para atar a las secuencias de mRNA específicos por ácido nucleico estándar base que se aparea y bloquean la traducción. A su vez, esto conduce a la pérdida de la proteína producida por eso mRNA. Este efecto permite a los investigadores a entender el papel de un gen particular en desarrollo al ver cómo el desarrollo se altera en su ausencia.
La inyección puede utilizarse para incorporar ADN extraño en el pez cebra. Mediante la inyección de secuencias que contienen sitios de reconocimiento para enzimas modificadoras de la DNA, los científicos pueden generar eficientemente peces "transgénicos" con genomas modificados, significa que genes extranjeros pasará a las generaciones futuras. Dependiendo del diseño de la secuencia, expresión génica puede limitarse a tejidos específicos o los puntos específicos de tiempo del desarrollo.
Sólo ha visto introducción de Zeus a la microinyección de embriones de pez cebra temprano. Este video ha introducido la configuración de la microinyección, demostró cómo preparar agujas de microinyección, se muestra cómo preparar embriones para microinyección, realizar la técnica de microinyección y algunas aplicaciones de microinyección. ¡Como siempre, gracias por ver!
Una de las principales ventajas de trabajar con el pez cebra (Danio rerio) es que su genética puede ser fácilmente manipulado por microinyección de em…
Microinyección de embriones de pez cebra permite a los investigadores a soluciones directamente en el desarrollo animal, con el fin de estudiar la función genética y dinámica de desarrollo. Se utilizan con frecuencia los embriones desde la fase de 1 a 4 células de inyección. Porque hay membranas de separación de las células y la yema de huevo en esta primera etapa, soluciones que se inyecta en una célula o en la yema se extenderán uniformemente en todo el organismo. Mediante la microinyección, genes de producción de proteína pueden ser expresados o apagados, dependiendo del tipo de material inyectado. Este video se demuestran preparación de pipeta, colección embrionaria, el procedimiento de microinyección y discutir algunas de las formas de que esta técnica se utiliza en los laboratorios de hoy.
Primero, vamos a cubrir los principales componentes del sistema de microinyección: el estereoscopio, microinyector, soporte de pipeta y amalgamas dentales.
La microinyectora ofrece volumen preciso a través de pulsos de presión de aire, que puede ser ajustado por el usuario. El titular de la pipeta asegura la pipeta para su uso durante el procedimiento y lo conecta a la línea aérea del inyector. Por lo general, el titular de la pipeta se coloca en un micromanipulador. Este instrumento permite al investigador hacer pequeños y precisos ajustes en la ubicación de la pipeta durante el procedimiento de inyección. Un pedal está conectado al inyector y permite al investigador mantener el uso de sus manos mientras que al mismo tiempo activar el pulso de presión para la entrega de material de inyección. Finalmente, el estereoscopio permite al investigador ver los embriones y se centran en la localización de la pipeta durante el procedimiento de microinyección.
Antes de empezar microinyección, agujas de cristal deben ser preparadas. Agujas de microinyección deben ser de un tamaño constante para permitir la entrega precisa de material de inyección. Un extractor de pipeta ayuda a asegurar bien y sharp pipetas se preparan cada vez. El tirador calienta un tubo capilar de vidrio y ejerciendo fuerza que tira en el tubo, dando por resultado dos agujas de la pipeta.
Bajo el microscopio, con unas pinzas, la punta se corta de manera que permite un volumen constante de líquido para ser entregado, mantiene todavía la agudeza de la aguja para perforar el embrión de pez cebra.
Rojo de fenol, un colorante utilizado para ayudar a visualizar el procedimiento de la inyección, se puede mezclar con la solución de la inyección para detectar inyección acertada en el embrión.
Las agujas pueden cargarse con la solución de la inyección desde el lado de punta vía acción capilar, o pueden ser rellenados con una jeringa microloader. Una vez que se carga la aguja para la inyección, puede ser insertado en el soporte de pipetas en el micromanipulador.
Después de que las agujas de inyección estén listas, se ajustan los ajustes de presión y tiempo de microinyectora para calibrar cada aguja, que garanticen que un volumen constante se entrega a cada embrión. Bajo el estereoscopio, se inyecta una pequeña cantidad de solución en una gota de aceite mineral en una diapositiva. El tamaño de la gota se mide y se puede calcular el volumen que la aguja se dispersa. Posteriormente, la presión de la microinyectora puede ajustarse más y repite el proceso hasta que una gota del tamaño deseado se obtiene regularmente.
Una vez que las agujas están preparadas y calibradas, embriones obtenidos y arreglados para la inyección.
Embriones deben ser colocados cuidadosamente y sostenidos inmóviles durante la inyección por una cámara de microinyección. Para crear una cámara de microinyección, moldes se colocan en una placa Petri y agarosa fundida se vierte en el plato y se deja endurecer. Una vez que ha solidificado, se retira el molde y se vierte el medio de embrión en la parte superior. Los embriones pueden ser alineados en canales que fueron creadas por el molde utilizando una pipeta de transferencia. Una alternativa a los embriones en agarosa de arreglar es a les en el borde de un portaobjetos de microscopio, por lo que se colocan en una columna para microinyección
Una vez en posición, los embriones están listos para ser inyectados.
Embriones se pueden inyectar en la yema de huevo o de la célula citoplasma. Inyección en la yema de huevo es más sencilla y requiere menos sofisticada técnica de inyección, mientras que la inyección en el citoplasma es más difícil, pero produce resultados más robustos. Para inyectar en la yema de huevo, utilizar el instrumental quirúrgico para mover la aguja que perfora el corión y luego la yema. El pedal es luego aprovechado para provocar el contenido de la aguja para ser expulsados en yema de huevo. Difusión y flujo citoplásmico permite la solución de la inyección fluir en la célula.
Inyección en el citoplasma requiere cuidadosa colocación del embrión, por lo que el citoplasma puede orientarse eficazmente.
Después de la inyección, embriones son transferidos a una nueva placa y se incubó a 28,5 ° C. Con frecuencia se comprueban para eliminar embriones muertos.
Para determinar el éxito de la inyección, los embriones pueden analizarse basado en su aspecto general, la presencia de un marcador fluorescente y buscando cambios en su genoma mediante genotipificación.
Ahora que entiendes cómo inyectar embriones de pez cebra, veamos cómo los científicos pueden utilizar esta técnica para entender la función de los genes.
En primer lugar, los científicos pueden inyectar mRNA sintetizado para sobreexpresar ciertos genes y determinar su función, observando el fenotipo. Esta misma técnica puede utilizarse también para expresar proteínas que destacan acontecimientos moleculares, tales como los cambios citoesqueléticos que ocurren durante el desarrollo.
En segundo lugar, los genes se pueden apagar por la inyección de morfolinos. Morfolinos son análogos estables de ácido nucleico sintético que pueden ser diseñados para atar a las secuencias de mRNA específicos por ácido nucleico estándar base que se aparea y bloquean la traducción. A su vez, esto conduce a la pérdida de la proteína producida por eso mRNA. Este efecto permite a los investigadores a entender el papel de un gen particular en desarrollo al ver cómo el desarrollo se altera en su ausencia.
La inyección puede utilizarse para incorporar ADN extraño en el pez cebra. Mediante la inyección de secuencias que contienen sitios de reconocimiento para enzimas modificadoras de la DNA, los científicos pueden generar eficientemente peces "transgénicos" con genomas modificados, significa que genes extranjeros pasará a las generaciones futuras. Dependiendo del diseño de la secuencia, expresión génica puede limitarse a tejidos específicos o los puntos específicos de tiempo del desarrollo.
Sólo ha visto introducción de Zeus a la microinyección de embriones de pez cebra temprano. Este video ha introducido la configuración de la microinyección, demostró cómo preparar agujas de microinyección, se muestra cómo preparar embriones para microinyección, realizar la técnica de microinyección y algunas aplicaciones de microinyección. ¡Como siempre, gracias por ver!
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Microinyección de embriones de pez cebra permite a los investigadores a soluciones directamente en el desarrollo animal, con el fin de estudiar la función genética y dinámica de desarrollo. Se utilizan con frecuencia los embriones desde la fase de 1 a 4 células de inyección. Porque hay membranas de separación de las células y la yema de huevo en esta primera etapa, soluciones que se inyecta en una célula o en la yema se extenderán uniformemente en todo el organismo. Mediante la microinyección, genes de producción de proteína pueden ser expresados o apagados, dependiendo del tipo de material inyectado. Este video se demuestran preparación de pipeta, colección embrionaria, el procedimiento de microinyección y discutir algunas de las formas de que esta técnica se utiliza en los laboratorios de hoy.
Primero, vamos a cubrir los principales componentes del sistema de microinyección: el estereoscopio, microinyector, soporte de pipeta y amalgamas dentales.
La microinyectora ofrece volumen preciso a través de pulsos de presión de aire, que puede ser ajustado por el usuario. El titular de la pipeta asegura la pipeta para su uso durante el procedimiento y lo conecta a la línea aérea del inyector. Por lo general, el titular de la pipeta se coloca en un micromanipulador. Este instrumento permite al investigador hacer pequeños y precisos ajustes en la ubicación de la pipeta durante el procedimiento de inyección. Un pedal está conectado al inyector y permite al investigador mantener el uso de sus manos mientras que al mismo tiempo activar el pulso de presión para la entrega de material de inyección. Finalmente, el estereoscopio permite al investigador ver los embriones y se centran en la localización de la pipeta durante el procedimiento de microinyección.
Antes de empezar microinyección, agujas de cristal deben ser preparadas. Agujas de microinyección deben ser de un tamaño constante para permitir la entrega precisa de material de inyección. Un extractor de pipeta ayuda a asegurar bien y sharp pipetas se preparan cada vez. El tirador calienta un tubo capilar de vidrio y ejerciendo fuerza que tira en el tubo, dando por resultado dos agujas de la pipeta.
Bajo el microscopio, con unas pinzas, la punta se corta de manera que permite un volumen constante de líquido para ser entregado, mantiene todavía la agudeza de la aguja para perforar el embrión de pez cebra.
Rojo de fenol, un colorante utilizado para ayudar a visualizar el procedimiento de la inyección, se puede mezclar con la solución de la inyección para detectar inyección acertada en el embrión.
Las agujas pueden cargarse con la solución de la inyección desde el lado de punta vía acción capilar, o pueden ser rellenados con una jeringa microloader. Una vez que se carga la aguja para la inyección, puede ser insertado en el soporte de pipetas en el micromanipulador.
Después de que las agujas de inyección estén listas, se ajustan los ajustes de presión y tiempo de microinyectora para calibrar cada aguja, que garanticen que un volumen constante se entrega a cada embrión. Bajo el estereoscopio, se inyecta una pequeña cantidad de solución en una gota de aceite mineral en una diapositiva. El tamaño de la gota se mide y se puede calcular el volumen que la aguja se dispersa. Posteriormente, la presión de la microinyectora puede ajustarse más y repite el proceso hasta que una gota del tamaño deseado se obtiene regularmente.
Una vez que las agujas están preparadas y calibradas, embriones obtenidos y arreglados para la inyección.
Embriones deben ser colocados cuidadosamente y sostenidos inmóviles durante la inyección por una cámara de microinyección. Para crear una cámara de microinyección, moldes se colocan en una placa Petri y agarosa fundida se vierte en el plato y se deja endurecer. Una vez que ha solidificado, se retira el molde y se vierte el medio de embrión en la parte superior. Los embriones pueden ser alineados en canales que fueron creadas por el molde utilizando una pipeta de transferencia. Una alternativa a los embriones en agarosa de arreglar es a les en el borde de un portaobjetos de microscopio, por lo que se colocan en una columna para microinyección
Una vez en posición, los embriones están listos para ser inyectados.
Embriones se pueden inyectar en la yema de huevo o de la célula citoplasma. Inyección en la yema de huevo es más sencilla y requiere menos sofisticada técnica de inyección, mientras que la inyección en el citoplasma es más difícil, pero produce resultados más robustos. Para inyectar en la yema de huevo, utilizar el instrumental quirúrgico para mover la aguja que perfora el corión y luego la yema. El pedal es luego aprovechado para provocar el contenido de la aguja para ser expulsados en yema de huevo. Difusión y flujo citoplásmico permite la solución de la inyección fluir en la célula.
Inyección en el citoplasma requiere cuidadosa colocación del embrión, por lo que el citoplasma puede orientarse eficazmente.
Después de la inyección, embriones son transferidos a una nueva placa y se incubó a 28,5 ° C. Con frecuencia se comprueban para eliminar embriones muertos.
Para determinar el éxito de la inyección, los embriones pueden analizarse basado en su aspecto general, la presencia de un marcador fluorescente y buscando cambios en su genoma mediante genotipificación.
Ahora que entiendes cómo inyectar embriones de pez cebra, veamos cómo los científicos pueden utilizar esta técnica para entender la función de los genes.
En primer lugar, los científicos pueden inyectar mRNA sintetizado para sobreexpresar ciertos genes y determinar su función, observando el fenotipo. Esta misma técnica puede utilizarse también para expresar proteínas que destacan acontecimientos moleculares, tales como los cambios citoesqueléticos que ocurren durante el desarrollo.
En segundo lugar, los genes se pueden apagar por la inyección de morfolinos. Morfolinos son análogos estables de ácido nucleico sintético que pueden ser diseñados para atar a las secuencias de mRNA específicos por ácido nucleico estándar base que se aparea y bloquean la traducción. A su vez, esto conduce a la pérdida de la proteína producida por eso mRNA. Este efecto permite a los investigadores a entender el papel de un gen particular en desarrollo al ver cómo el desarrollo se altera en su ausencia.
La inyección puede utilizarse para incorporar ADN extraño en el pez cebra. Mediante la inyección de secuencias que contienen sitios de reconocimiento para enzimas modificadoras de la DNA, los científicos pueden generar eficientemente peces "transgénicos" con genomas modificados, significa que genes extranjeros pasará a las generaciones futuras. Dependiendo del diseño de la secuencia, expresión génica puede limitarse a tejidos específicos o los puntos específicos de tiempo del desarrollo.
Sólo ha visto introducción de Zeus a la microinyección de embriones de pez cebra temprano. Este video ha introducido la configuración de la microinyección, demostró cómo preparar agujas de microinyección, se muestra cómo preparar embriones para microinyección, realizar la técnica de microinyección y algunas aplicaciones de microinyección. ¡Como siempre, gracias por ver!
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Q1: Why are 1 to 4-cell stage zebrafish embryos preferred for microinjection?
Early-stage embryos lack membranes separating cells from the yolk, allowing injected solutions to spread evenly throughout the organism. This uniform distribution enables consistent gene expression or silencing across all cells, making these stages ideal for studying gene function and developmental dynamics in zebrafish.
Q2: What is the role of the micromanipulator in zebrafish microinjection?
The micromanipulator makes small, accurate adjustments to pipette position during injection. Mounted with the pipette holder, it allows researchers to precisely target the embryo's yolk or cytoplasm while maintaining steady control, ensuring successful delivery of injection material to the correct location.
Q3: How does a pipette puller ensure consistent microinjection needle quality?
A pipette puller heats a glass capillary tube while applying force to create two identical needles. The tip is then cut under a microscope using forceps to maintain sharpness while ensuring consistent liquid delivery volume. This standardization allows precise, repeatable injection across all embryos.
Q4: What is the difference between yolk and cytoplasmic injection in zebrafish embryos?
Yolk injection is simpler and requires less sophisticated technique, as cytoplasmic flow naturally carries the solution into cells. Cytoplasmic injection is more difficult, requiring careful embryo positioning to directly target the cell, but yields more robust and reliable results for gene manipulation studies.
Q5: How do morpholinos function in zebrafish microinjection experiments?
Morpholinos are synthetic nucleic acid analogs designed to bind specific mRNA sequences through base pairing, blocking translation. This prevents protein production from that mRNA, allowing researchers to study gene function by observing how development changes when the protein is absent.
Q6: What methods are used to calibrate a microinjection needle before embryo injection?
A small solution volume is injected into mineral oil on a slide under the stereoscope, and the resulting droplet size is measured to calculate delivery volume. Microinjector pressure is adjusted and the process repeated until consistent droplets of desired size are regularly obtained.
Q7: How can microinjection be used to create transgenic zebrafish?
Researchers inject DNA sequences containing recognition sites for DNA-modifying enzymes into embryos. This efficiently generates transgenic fish with modified genomes that pass foreign genes to future generations. Gene expression can be confined to specific tissues or developmental timepoints depending on sequence design. Learn more about zebrafish reproduction and development to understand how these modifications are inherited.
Capítulos en este video
0:00
Overview
1:01
Components of the Injection Apparatus
2:09
Preparing for Microinjections
3:59
Preparing Embryos for Injection
4:47
Injecting Zebrafish Embryos
6:06
Applications
7:40
Summary