Name: בשכבה דקה כרומטוגרפי (TLC) הפרדות וbioassays של תמציות צמחים כדי לזהות תרכובות Antimicrobial (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-27T22:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 4 s
Description: למדו לזהות תרכובות אנטימיקרוביאליות ממיצויי צמחים באמצעות כרומטוגרפיית שכבה דקה (TLC) וביואסיי. השיטה מדגימה זיהוי פנולים מכתרת האדומה הפועלים נגד חיידקים מייצרי אמוניה ברומן הבקר.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לד&quot;ר הנור טיילור המנוח, מח&#39; צמח ומדעי קרקע באוניברסיטת קנטאקי, על שאפשרת לנו להשתמש בדגימות מחלקות התלתן האדומות שלו למחקר זה. פרויקט זה מומן על ידי ארצות הברית מחלקת החקלאות.

1. הכנת תמצית צמח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראה קגן וFlythe 10 להפקת תרכובות פנוליות מקורות חי pratense Trifolium. Kenland. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לחלץ תרכובות אחרות בצמחים אחרים, בדוק את ספרות ניתוח Phytochemical לשיטות מיצוי צמחים או המטבוליט ספציפי (רבים מתוארות), או לחפש פרוטוקולים כגון אלה של חוראם et al. 7,8 שבודד תרכובות רבות עם רחב מגוון רחב של קטבים. </li></ol> 2. הכנת לוחות דק שכבה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחות TLC נקיות על ידי פיתוח בממסים קוטביים, ניטראליים אחד או יותר, על מנת להתרחק מהאזור של פיתוח המזהמים adsorbed. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במנדף קטר, להכין מספיק ממס ניקוי (למשל 15-100 מיליליטר של 2:1 יצטט מתנול אתיל, V / V) כדי לכסות את החלק התחתון של חדר פיתוח TLC, כמו גם את הקצה התחתון של צלחת TLC כאשר סט בתוך החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש commerזכוכית זמינה cially TLC פיתוח תאים (בגדלים שונים זמינים, עם מכסים) או כוסות פיירקס מכוסה בנייר כסף או צנצנות שימור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במספריים כדי לחתוך אלומיניום או צלחות בציפוי פלסטיק (גמישות) סיליקה ג&#39;ל, המגיעים בגדלים שונים (סנטימטר וקטן יותר 20 x 20 סנטימטר), כדי שיתאימו לתא פיתוח זמין. (זהירות: סיליקה יכולה לגרום נזק לריאות אם בשאיפה לעבוד במנדף, ולהתמודד עם צלחות TLC עם כפפות כדי להימנע מקבלת שמני עור על גבי סיליקה..) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את הצלחות לתוך התא, עם צמרות נשענו על קירות החדר. צלחות לא צריכים לגעת זה בזה. כסה את החדר ולתת לי הממס להזיז את הצלחת על ידי פעולת נימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר הממס הגיע לחלק העליון של הצלחות, להסיר צלחות מהחדר ולסדר בעמידה בתוך מנדף עד הממס התאדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדקו אם זיהומים היגרו בחלק העליון של צלחת TLC ידי מחפש להקה צהובה מתחת לעיןאור אור, או להקת ניאון מתחת לאולטרה סגול (UV) (ראה &quot;מול הטומאה&quot;, או אם באיור 2 ב). אם הרוב של הצלחת עדיין יש גוון צהבהב, חזור על תהליך הניקוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הסרת צלחות TLC מהאולם, לבטל את הממס. לאפשר ממס שיורי להתאדות לחלוטין לפני השימוש בחדר לפרוטוקול 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להסיר את הלחות שיורית שיכול להשפיע על הגירה של תרכובות על סיליקה 16, לתמוך הצלחות זקופות בתנור ייבוש ב100 ° C (10-15 דקות ל20 סנטימטר x 20 צלחת סנטימטר, ו -5 דקות ל7 ס&quot;מ X 10 צלחות סנטימטר ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם תנור ייבוש 100 ° C אינו זמין, צלחות חום לתקופה ארוכה יותר של זמן בטמפרטורות נמוכות יותר (כלומר 40 דקות על 60 מעלות צלזיוס). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הצלחות יבשות, תן להם להתקרר לטמפרטורת סביבה לפני הטעינה. </li></ol></li></ol> 3. הכנת פיתוח צ&#39;יימברס להפרדת חלץ <ol&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במספריים כדי לחתוך פיסת נייר סינון מעט מתחת לתא גובה, וכמחצית למתחם קאמרי ברוחב. מאמר זה משמש כפתילה לצייר ממס עד קיר החדר ולהרוות את החדר עם אדי חומר, ובכך לשפר את שחזור של הפרדות 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במנדף, לערבב ממסים (אתיל אצטט, מתנול 4:1, V / V, למחקר זה). יוצקים את תערובת ממס לתוך החדר ולכסות. חכה עד שכל הפתיל הוא רטוב עם ממס, מה שמעיד תא לחץ, לשים את הצלחות לתוך תא. </li></ol> 4. טעינה ופיתוח של צלחות TLC <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קל לסמן את מוצאם עם עיפרון. אם בעלי כושר ספיגה צלחת TLC הוא רך ובקלות פגומה, להפוך את הסימנים בקצוות. תרכובות צריכה להיות מעל פני השטח של ממס הפיתוח כאשר צלחות מוכנסות לתוך תא TLC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים תמציות במספיק ממס אורגני (במקרה זה, מתנול) יש פתרון מרוכז במקום עכורהשעיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות עומס וסטנדרטים כמו להקות צרות עם מזרק microliter או micropipettes נימים, משאירים גבול 1 סנטימטר בצדדים של הצלחת. לאפשר ללהקות לייבוש (מלבה את הצלחת או טוען אותו במנדף עוזר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם ריכוז גדול יותר של מדגם יש צורך בצלחת, &quot;overspot&quot; על ידי דגימות טעינה שוב בלהקות מיובשות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם מלקחיים או מלקחיים, הניח את הצלחת (ים) בתוך חדר TLC הרווי. צלחות לא צריכים לגעת בפתיל כי זה עשוי לספק ממס לצלחות בנקודות מגע, ובכך לשנות את נתיב הגירת מתחם. כסה קאמרי ולתת צלחות להתפתח. </li></ol> 5. הכנת צלחות למבדק <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הצלחת (ים) מיכל TLC לפני מול הממס מגיע העליון של הצלחת, ולסמן את הגובה של חזית הממס בעיפרון. בואו יבש צלחת במנדף. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפתח כל צלחות TLC שנותרו באותו התא TLC, שזה generally שמיש עבור כל יום אם כל הזמן סגור. מהדורה מחודשת תערובת ממס עבור חדר TLC אם כמות הממס בתא יורדת בעיקר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הצלחות יבשות, לדמיין להקות תחת אור הנראה או UV, ולהתוות להקות בעיפרון. תא צפייה עם מנורת UV ניידת הוא נוח, במיוחד אם את המנורה יכולה לזהות תרכובות בשני 254 ננומטר (UV בגלים קצרים) ו365 ננומטר (UV גל ארוך). הערה: בשלב זה או לאחר השלב הבא, יכולות להיות עטופים צלחות בניילון נצמד, מכוסות בנייר כסף, ומאוחסנות ב -20 ° C. זמן אחסון מרבי תלוי ביציבות תרכובת. בגלל סיליקה אינה ניטראלית, כמה תרכובות עלולות לבזות ואילו על צלחת TLC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצלם או לצייר צלחות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במערכת photodocumentation ג&#39;ל אם אחד מצויד בUV תקורה ו / או אורות גלויים הוא זמין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם אין מערכת photodocumentation מסחרית זמינה, צלחות צילום בתוך קופסא מרופדת בנייר או בד כהה, wiה להגדיר את המצלמה על חצובה ואור UV נייד מהודק לטבעת לעמוד 17. כאשר מצלמים צלחות שאין להן חיווי ניאון, השתמש במסנן אור כחול על עדשת המצלמה כדי לשפר את המראה של להקת 17. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לסייע באפיון להקות, לחשב גורם שימור (ו R) ערכים על ידי מדידת מרחקים נסעו במתחם וחזית ממס, וחלוקה לשעבר על ידי (איור 2 א) האחרון. </li></ol> 6. חיידקי תרבות וAssay <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין ולחסן תקשורת בתנאים אנאירוביים. התרבות משמשת במקרה זה הייתה SR Clostridium sticklandii המתח, אשר התקבל מאוסף התרבות של ג&#39;יימס ב &#39;ראסל, אוניברסיטת קורנל, איתקה, ניו יורק. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראה Flythe ו13 קגן ורשימת החומרים לתיאור תקשורת HAB. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול התרבות לשלב מעריכי או נייח. השתמש techniqu אנאירובי סטריליes כאשר עובד עם מיקרואורגניזמים אנאירובי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן התרבות (1% V / V) לתוך אגר מותך לאחר הטמפרטורה של אגר (0.75% w / v) ירד ל פחות מ 60 ° C. מערבבים בעדינות ולהביא מייד לחדר אנאירובי (95% H CO 2 -5% 2 אווירה לתקשורת HAB) לשפוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים לתוך 15 מ&quot;מ x 100 צלחות פטרי פלסטיק מ&quot;מ, ומאפשר לחזק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם מספריים, לחתוך את צלחת TLC לאזורים המכילים להקה (ים) של עניין. הנח להקות עם הפנים כלפי מטה על גבי צלחות אגר, לציון להקות בגיבוי הצלחת כדי לעקוב אחר כיוון המקורי על צלחת TLC. הנח רצועת TLC שאינו בשימוש על גבי צלחת אגר כביקורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה צלחות אגר, אגר צד למטה, בתא אנאירובי (שעה 24, 39 מעלות צלזיוס). </li></ol> 7. ויזואליזציה של צלחות Bioassayed אגר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם מלקחיים, להסיר להקות מצלחות אגר בזמן שהם בתא אנאירובי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 1% (w / v) teאדום trazolium, שהוכן במים, dropwise על גבי המשטחים של הצלחות אגר. לאפשר את הצבע לפתח לפחות 20 דקות, או עד שצלחת השליטה הופכת לאדומה לגמרי, לפני הסרת מתא אנאירובי. החיידקים אנאירוביים יתחילו לאבד את יכולת הקיום מייד לאחר ההסרה מתא אנאירובי, אבל הצבע הוא יציב יותר מ24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצלם מתחת לאור הנראה. </li></ol>

<ol><li>Stahl, E., Ashworth, M. R. F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStahl%2C+E+%22Thin-layer+chromatography%22">Thin-layer chromatography</a>. , Springer. (1969).</li>
<li>Marston, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thin-layer+chromatography+with+biological+detection+in+phytochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">Thin-layer chromatography with biological detection in phytochemistry.</a> J. Chromatogr. A. 1218 (19), 2676-2683 Forthcoming.</li>
<li>Homans, A. L., Fuchs, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+bioautography+on+thin-layer+chromatograms+as+a+method+for+detecting+fungitoxic+substances%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr%22%5BJournal%5D)">Direct bioautography on thin-layer chromatograms as a method for detecting fungitoxic substances.</a> J. Chromatogr. 51, 327-329 Forthcoming.</li>
<li>Lund, B. M., Lyon, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+inhibitors+of+Erwinia+carotovora+and+E.+herbicola+on+thin-layer+chromatograms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr%22%5BJournal%5D)">Detection of inhibitors of Erwinia carotovora and E. herbicola on thin-layer chromatograms.</a> J. Chromatogr. 110, 193-196 (1975).</li>
<li>Betina, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioautography+in+paper+and+thin-layer+chromatography+and+its+scope+in+the+antibiotic+field%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">Bioautography in paper and thin-layer chromatography and its scope in the antibiotic field.</a> J. Chromatogr. A. 78, 41-51 (1973).</li>
<li>Weltzien, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ein+biologischer+Test+f%C3%BCr+fungizide+Substanzen+auf+dem+Papierchromatogramm%5BTitle%5D)+AND+%22Naturwissenschaften%22%5BJournal%5D)">Ein biologischer Test für fungizide Substanzen auf dem Papierchromatogramm.</a> Naturwissenschaften. 45, 288-289 (1958).</li>
<li>Khurram, M., Khan, A. M., Hameed, A., Abbas, N., Quayum, A., Inayat, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibacterial+activities+of+Dodonaea+viscosa+using+contact+bioautography+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Antibacterial activities of Dodonaea viscosa using contact bioautography technique.</a> Molecules. 14 (3), 1332-1341 (2009).</li>
<li>Khurram, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+anticandidal+potential+of+Quercus+baloot+Griff.+using+contact+bioautography+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Afr.+J.+Pharm.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of anticandidal potential of Quercus baloot Griff. using contact bioautography technique.</a> Afr. J. Pharm. Pharmacol. 5 (12), 1538-1542 (2012).</li>
<li>Robinson, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRobinson%2C+T+%22The+Organic+Constituents+of+Higher+Plants%22">The Organic Constituents of Higher Plants</a>. , Burgess Publishing Co. (1963).</li>
<li>Kagan, I. A., Flythe, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+affecting+the+separation+and+bioactivity+of+red+clover+%28Trifolium+pratense%29+extracts+assayed+against+Clostridium+sticklandii%2C+a+ruminal+hyper+ammonia-producing+bacterium%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Prod.+Commun%22%5BJournal%5D)">Factors affecting the separation and bioactivity of red clover (Trifolium pratense) extracts assayed against Clostridium sticklandii, a ruminal hyper ammonia-producing bacterium.</a> Nat. Prod. Commun. 7 (12), 1605-1608 (2012).</li>
<li>Mattila, P., Kumpulainen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+free+and+total+phenolic+acids+in+plant-derived+foods+by+HPLC+with+diode-array+detection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Agric.+Food+Chem%22%5BJournal%5D)">Determination of free and total phenolic acids in plant-derived foods by HPLC with diode-array detection.</a> J. Agric. Food Chem. 50 (13), 3660-3667 (2002).</li>
<li>Hamburger, M. O., Cordell, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+direct+bioautographic+TLC+assay+for+compounds+possessing+antibacterial+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Nat.+Prod%22%5BJournal%5D)">A direct bioautographic TLC assay for compounds possessing antibacterial activity.</a> J. Nat. Prod. 50 (1), 19-22 (1987).</li>
<li>Flythe, M., Kagan, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+effect+of+red+clover+%28Trifolium+pratense%29+phenolic+extract+on+the+ruminal+hyper+ammonia-producing+bacterium%2C+Clostridium+sticklandii%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial effect of red clover (Trifolium pratense) phenolic extract on the ruminal hyper ammonia-producing bacterium, Clostridium sticklandii.</a> Curr. Microbiol. 61, 125-131 Forthcoming.</li>
<li>Rahalison, L., Hamburger, M., Hostettmann, K., Monod, M., Frenk, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bioautographic+agar+overlay+method+for+the+detection+of+antifungal+compounds+from+higher+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochem.+Anal%22%5BJournal%5D)">A bioautographic agar overlay method for the detection of antifungal compounds from higher plants.</a> Phytochem. Anal. 2 (5), 199-203 (1991).</li>
<li>Chomnawang, M. T., Trinapakul, C., Gritsanapan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+antigonococcal+activity+of+Coscinium+fenestratum+stem+extract%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Ethnopharmacol%22%5BJournal%5D)">In vitro antigonococcal activity of Coscinium fenestratum stem extract.</a> J. Ethnopharmacol. 122, 445-449 (2009).</li>
<li>Stahl, E., Kaldewey, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spurenanalyse+physiologisch+aktiver%2C+einfacher+Indolderivate%5BTitle%5D)+AND+%22Hoppe-Seyler%E2%80%99s+Z.+Physiol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Spurenanalyse physiologisch aktiver, einfacher Indolderivate.</a> Hoppe-Seyler’s Z. Physiol. Chem. 323, 182-191 Forthcoming.</li>
<li>Kagan, I. A., Hammerschmidt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+ecotype+variability+in+camalexin+production+and+reaction+to+infection+by+Alternaria+brassicicola%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chem.+Ecol%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis ecotype variability in camalexin production and reaction to infection by Alternaria brassicicola.</a> J. Chem. Ecol. 28 (11), 2121-2140 (2002).</li>
<li>Kline, R. M., Golab, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+technique+in+developing+thin-layer+bioautographs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr%22%5BJournal%5D)">A simple technique in developing thin-layer bioautographs.</a> J. Chromatogr. 18, 409-411 (1965).</li>
<li>Wedge, D. E., Nagle, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+2D-TLC+bioautography+method+for+the+discovery+of+novel+antifungal+agents+to+control+plant+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Nat.+Prod%22%5BJournal%5D)">A new 2D-TLC bioautography method for the discovery of novel antifungal agents to control plant pathogens.</a> J. Nat. Prod. 63 (8), 1050-1054 (2000).</li>
<li>Beck, A. B., Knox, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+acylated+isoflavone+glycosides+from+subterranean+clover+and+red+clover%5BTitle%5D)+AND+%22Aust.+J.+Chem%22%5BJournal%5D)">The acylated isoflavone glycosides from subterranean clover and red clover.</a> Aust. J. Chem. 24 (7), 1509-1518 (1971).</li>
<li>Kahn, R. A., Bak, S., Svendsen, I., Halkier, B. A., Møller, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+reconstitution+of+cytochrome+P450ox+and+in+vitro+reconstitution+of+the+entire+biosynthetic+pathway+of+the+cyanogenic+glucoside+dhurrin+from+sorghum%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Isolation and reconstitution of cytochrome P450ox and in vitro reconstitution of the entire biosynthetic pathway of the cyanogenic glucoside dhurrin from sorghum.</a> Plant Physiol. 115 (4), (1997).</li>
<li>Peterson, C. A., Edgington, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+estimation+of+the+fungicide+benomyl+using+a+bioautograph+technique%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Agr.+Food+Chem%22%5BJournal%5D)">Quantitative estimation of the fungicide benomyl using a bioautograph technique.</a> J. Agr. Food Chem. 17 (4), 898-899 (1969).</li>
</ol>

אזכור של שמות מסחריים או מוצרים מסחריים במאמר הוא אך ורק לצורך מתן מידע ספציפי ואינו מעיד על המלצה או אישור על ידי משרד החקלאות. המחברים מצהירים שום אינטרס כלכלי מתחרה.

פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה להפרדת תמצית לתוך תת קבוצות של תרכובות ומנסים לאמוד תת אלה על ידי bioautography ליצירת קשר. השיטה די דומה לזו ששמשה את Chomnawang et al. 15 למסך למטבוליטים צמח מעכבים לחיידקי גורמי זיבה. הסוג של bioautography המועסק מסך לתרכובות צמחים מיקרוביאלית תלוי בגורמים רבים, כולל בקטריה הבדיקה, התקנת המעבדה, ואת ההעדפות של האדם (ים) ביצוע המבדק. bioautography לתקשר, השיטה המשמשת במחקר זה, זכה לביקורת על תלוי ביכולת של מתחם כדי לפזר לתקשורת מחו...

מנסה לאמוד עבור תרכובות מיקרוביאלית בצמחים דורש הפרדת המרכיבים של תמצית צמח, חושף מיקרואורגניזם בדיקה לרכיבים אלה, וקביעה אם הצמיחה של מיקרואורגניזם הוא מעוכב על ידי כל אחת מהתרכובות. הפרדות על ידי נייר או כרומטוגרפיה בשכבה דקה (PC או TLC) הן נוחים, כי תרכובות רבות יכולות להיות מופרדות על משטח מישורי. הפרדה מבוססת על קוטביות, עם כמה תרכובות מחייבות בחוזקה לבעלי כושר ספיגה (תאית במקרה של מחשב, ועוד מגוון של חומרי ספיחה במקרה של TLC) ונודדות פחות מאחרים 1. איור 1 מספק דוגמא למיקומים היחסי של תרכובות פנוליות קוטב ופולרי לאחר הפרדה על צלחת TLC סיליקה. <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51411/51411fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51411/51411fig1.jpg" /> איור 1. דיאגרמה המדגימה הפצות של תרכובות של קטבים שונים לאחר הפרדה על chromatographic דק שכבה סיליקה צלחת (TLC). תרכובות פנול של תלתן אדום (Trifolium pratense L.) משמשות כדוגמא. תרכובות קוטביות, כגון clovamide, יש זיקה חזקה עבור בעלי כושר ספיגה קוטביים כמו סיליקה ולהישאר קרובים למקור (OR), ואילו תרכובות קוטביות פחות, כגון שלושה איזופלבונים קרובים לחזית הממס (SF), מחיצה יותר בקלות לממסים (שהם פחות קוטביים מסיליקה, אלא אם כן מים, חומצות, בסיסים או כלולים) ולהעביר הלאה את הצלחת. לאחר ההפרדה של תמצית על צלחת TLC, יכולים להיחשף מיקרואורגניזמים מבחן לכל התרכובות על הצלחת, ובכך להאיץ את זיהוי של הרכיבים הפעילים של תמצית 2. אם תרבות פטרייתי או חיידקים חשופה להכרומתוגרמה, התפתחותם של חיידקים תתרחש בכל מקום פרט מעל אזורים עם צמיחת מעכביםתרכובות y. אזורים של עיכוב לאחר מכן ניתן לראות על ידי הניגוד בין צמיחת mycelial והאזורים ללא צמיחת פטריות אם כבר הוחלו 3 או על ידי ריסוס עם חומרים שמשנים את צבעם כאשר מופחת או הידרוליזה על ידי תאי חיים 4. למרות שימוש chromatograms נייר או בשכבה דקה למבחנים מיקרוביאלית יושם לראשונה לאנטיביוטיקה 5 וקוטלי פטריות 3,6, תמציות צמחים נמצאות כעת בתדירות גבוהה לגילוי תרכובות מיקרוביאלית בשיטה זו, המכונים לעתים קרובות bioautography. הפרוטוקולים שתוארו לעיל חלים על bioautography של chromatograms בשכבה דקה. TLC נעשה שימוש נרחב בגלל זה הוא מהיר יחסית ויכול להתבצע על חומרי ספיחה שונות (לדוגמא: סיליקה, עמילן, אלומינה), כמו גם לספק רזולוציה טובה ורגישות 1. ניתן להכין תמציות צמחים לTLC בדרכים רבות. שיטות נפוצות כוללות חומר צמחי חילוץ בALCתערובות ohol מים כגון 80% אתנול 7,8, אולי עם התוספת של חומצה או בסיס 9. בעקבות מיצוי בממסים כאלה, המכילים מעט מים והם אולי חומצי או בסיסיים, תמציות חייבת להיות מרוכזות, כך שהם יכולים להיות מיושמים על צלחות TLC בנפח מינימאלי. הריכוז של תמציות אלכוהול מים יכול להיות מושגת על ידי החלוקה עם ממסים אורגניים במים immiscible 8 או בתערובת של ממסים כאלו, כגון אתר אתיל אצטט, אתיל (1:1, V / V) 10,11. מטבוליטים שונים של צמחים המחולצים לממסים אורגניים שונים, בהתאם לקוטביות שלהם. כדי להבטיח כי חומצות אורגניות צמח או בסיסים המחולצים לממסים אורגניים, בשלב זה, ה-pH של תמצית אלכוהול מים יכול להיות עלה או מונמכת עם חומצה מסיס במים או בסיס להמיר analytes ניתק לצורות nondissociated, אשר לאחר מכן מסיס בממסים אורגניים ניטראליים 9. לאחר מכן השלב האורגני יכול להיות דוארvaporated תחת לחץ מופחת או תחת חנקן ומותאם להיקף הרצוי עבור TLC. ה-pH של התמצית לא סביר שיהיה קטלני למיקרואורגניזמים מבדק בשל המחיצות של analytes לממסים ניטראליים, נפח סופי קטן, ואידוי של התמצית על צלחת TLC לפני ההפרדה. פטריות וחיידקים שניהם מועסקים כמיקרואורגניזמים מבחן בbioautography של תמציות צמחים 2. נבגים של פטריות מסוימות, כגון cucumerinum Cladosporium, לנבוט על צלחות TLC (מלבד אזורים עם תרכובות מעכבות) אם ריססו על צלחות בפתרון תזונתי וטופחו בסביבה לחה במשך כמה ימים 3. התפטיר האפל של ג cucumerinum באזורי noninhibitory מספק ניגוד חריף לאזורים ללא צמיחה mycelial. למרות שחיידקים יושמו לכרומטוגרפיה בשכבה דקה צלחות (TLC) באותו אופן 4,12, חיידקים הם גם שפכו על TLCמשטחי צלחת אגרה שכבות 13,14. שמרים, כמו קנדידה אלביקנס, יכולים להיות מיושמים בשכבות אגר כמו גם 14. לחלופין, ניתן להציב צלחות TLC עם פנים כלפי מטה על גבי אגר מחוסן עם חיידקים או שמרי 10,15 8, בשיטה המכונה קשר bioautography 2. אנו מתארים שיטה לbioautography מגע מסך עבור תרכובות פנוליות מיקרוביאלית מתלתן אדום (Trifolium pratense קורות חיים. Kenland). מיקרואורגניזם המבחן הוא sticklandii Clostridium, חיידק כרס היפר לייצור אמוניה (HAB) ולחייב anaerobe. למרות הפרדות שימוש אינן פותרות את כל הרכיבים של התמצית, הם להקל על זיהוי של אזורים של פעילות מיקרוביאלית, ובכך מצמצם את הבריכה של תרכובות מיקרוביאלית אפשריות. הפרוטוקול מנצל נהלים סטנדרטיים ל1 TLC. הפרוטוקול מתאר גם כמה הטכניקות הנדרשות לobli culturingאנאירוביים שער עבור assay כגון, שימוש בקשר bioautography 15 ושיטת הדמיה עם מלח tetrazolium, אשר כתמי תאי חיים 2,4.

<table><tbody><tr><td>סיליקה F254 לוחות TLC, עם גיבוי אלומיניום, עובי 0.2 מ"מ, 20 ס"מ x 20 ס"מ</td><td>EMD Chemicals</td><td>5554/7</td><td>לוחות אלה מצופים בסיליקה המכילה מחוון פלואורסצנטי ב-254 ננומטר. תרכובות הנספגות באורך גל זה נראות כהות על רקע ירוק פלואורסצנטי. מקורות חלופיים כוללים את Analtech, Selecto Scientific, Fluka.&nbsp; ייתכן שיהיה צורך בחומרים סופחים שאינם סיליקה.&nbsp; צלחות עם גב פלסטיק עשויות להתאים, בהתאם לממיסים שבהם יש להשתמש.&nbsp;</td></tr><tr><td>מספריים חדים וכבדים&nbsp;</td><td>כל חברת אספקת תפירה</td><td>הדומה ל-Fiskars 175800-1002</td><td>לחיתוך לוחות TLC.&nbsp; ניתן להשתמש גם בחותך נייר עם להב חד.&nbsp; אין לשאוף אבק סיליקה.</td></tr><tr><td>תנור ייבוש ב-100 מעלות; C (הסעה מכנית)</td><td>Thermo Scientific</td><td>PR305225M</td><td>Quincy Lab, Inc, שיקגו, אילינוי (www.quincylab.com); Cascade Technical Sciences, הילסבורו, אורגון (www.cascadetek.com)</td></tr><tr><td>TLC chamber</td><td>Kimble Chase</td><td>416180-0000</td><td>מקורות חלופיים:&nbsp; אולדריץ'. ניתן להשתמש בכוסות פיירקס או צנצנות שימור לצלחות קטנות (כלומר 5 ס"מ על 10 ס"מ). מכסים בנייר אלומיניום (מכסי צנצנות עשויים להכיל חומר הניתן לחילוץ על ידי אדי ממס).</td></tr><tr><td>50 ומיקרו; l מזרק עם קצה מחט שטוח</td><td>המילטון</td><td>80965</td><td>לטעינת כמויות סטנדרטיות או מדגם העולות על 5-10 &micro;l.&nbsp; מקורות חלופיים שווי ערך.</td></tr><tr><td>מיקרופיפטות</td><td>דראמונד</td><td>2-000-001</td><td>להעמסת כמויות קטנות של תקנים או דוגמאות.&nbsp; מקורות חלופיים:&nbsp; VWR.&nbsp; כמו כן, ניתן למתוח את פיפטות פסטר לקוטר דק יותר עם לפיד בוטאן.&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>נייר סינון (כיתה #1)</td><td>Whatman</td><td>1001 917</td><td>משמש כפתיל.&nbsp; ציונים אחרים של נייר סינון הם בסדר.&nbsp; ניתן לקצץ גודל זה לתאים המכילים צלחות בגודל 20 ס"מ על 20 ס"מ. &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>מלקחיים של כוסות</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>15-186</td><td>להכנסת צלחות פנימה והחוצה מתא TLC גדול.&nbsp; מקורות חלופיים: VWR&nbsp;</td></tr><tr><td>מלקחיים שטוחים</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>10-275</td><td>להכנסת צלחות לחדר קטן והחוצה ממנו. מקורות חלופיים: VWR </td></tr><tr><td>מנורת UV ניידת קטנה עם נורות 4 W או 6 W לתאורת אור UV בגלים קצרים וארוכים, (254 ו-365 ננומטר, בהתאמה)</td><td>מוצרים אולטרה סגולים</td><td>95-0271-01</td><td>מקורות חלופיים: Spectronics Corporation (www.spectroline.net)</td></tr><tr><td>ארון צפייה לשימוש עם מנורת UV כף יד</td><td>מוצרים אולטרה סגולים</td><td>Chromato-Vue C-10E</td><td>רצועות פעילות UV מוקפות ביתר קלות אם ניתן להציב כאן לוחות. מקורות חלופיים: Spectronics Corporation.&nbsp;</td></tr><tr><td>מערכת תיעוד צילום עם מנורת UV עילית ומנורה גלויה</td><td>קודאק</td><td>ג'ל לוג'יק 200</td><td>&nbsp; מקורות חלופיים: מוצרים אולטרה סגולים (www.uvp.com).&nbsp; ראה פרוטוקול לחלופה תוצרת בית.</td></tr><tr><td>תא אנאירובי, סוג A, ויניל</td><td>קוי</td><td>7150000</td><td>תא זה מתאים לחיידקים אנאירוביים, כמו Clostridium sticklandii, כמתואר. &nbsp; עם זאת, תנאי הגידול חייבים להיות מותאמים לאורגניזם המשמש בבדיקה.&nbsp; יש לנקוט בארון בטיחות ביולוגית ואמצעי זהירות אחרים אם משתמשים באורגניזמים פתוגניים. מקורות חלופיים: Anaerobe Systems, BioRad, Plas Labs, אחרים&nbsp;</td></tr><tr><td>Tetrazolium red</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8877</td><td>מקורות חלופיים: MP Biomedicals, Santa Cruz Biotechnology, Alfa Aesar</td></tr><tr><td colspan="4">Ingredients for HAB media</td></tr><tr><td>Pyridoxamine &middot; 2HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9380</td><td>עבור זה ועבור כל הריאגנטים האחרים בטבלה זו, מקורות חלופיים שווי ערך.</td></tr><tr><td>ריבופלבין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>R4500</td><td></td></tr><tr><td>תיאמין הידרוכלוריד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>T3902</td><td></td></tr><tr><td>ניקוטינאמיד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>N3376</td><td></td></tr><tr><td>סידן D-פנטותנט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>C8731</td><td></td></tr><tr><td>חומצה ליפואית&nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>T5625</td><td></td></tr><tr><td>עם חומצה אמינו-בנזואית&nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ</td>' <td>A9878</td><td></td></tr><tr><td>חומצה פולית</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>F8798</td><td></td></tr><tr><td>ביוטין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>B4639</td><td></td></tr><tr><td>קובלמין&nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>C3607</td><td></td></tr><tr><td>פירידוקסל הידרוכלוריד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P9130</td><td></td></tr><tr><td>פירידוקסין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P5669</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>ברזל גופרתי &middot; 7H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8263</td><td></td></tr><tr><td>אבץ גופרתי &middot; 7H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z0251</td><td></td></tr><tr><td>מנגן כלוריד &middot; 4H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8054</td><td></td></tr><tr><td>חומצה בורית</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6768</td><td></td></tr><tr><td>קובלט כלוריד &middot; 6H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8661</td><td></td></tr><tr><td>נחושת כלוריד &middot; 2H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>459097 ניקל כלוריד &middot; 6H2O</td><td>סיגמא-אולדריץ</td>' <td>203866</td><td></td></tr><tr><td>נתרן מוליבדט &middot; 2H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>331058</td><td></td></tr><tr><td>Trypticase (עיכול לבלב של קזאין)</td><td>Thermo Fisher</td><td>B11921</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן פוספט חד בסיסי</td> נטול מים <td>Thermo Fisher</td><td>P284</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פחמתי ומידות; H2O&nbsp;</td><td>תרמו פישר</td><td>S636</td><td></td></tr><tr><td>אגר</td><td>תרמו פישר</td><td>50841063</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום גופרתי &middot; 6H2O</td><td>תרמו פישר</td><td>7791-18-6</td><td></td></tr><tr><td>סידן כלורי &middot; 2H2O</td><td>תרמו פישר</td><td>BP510</td><td></td></tr><tr><td>ציסטאין HCl</td><td>תרמו פישר</td><td>19464780</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן פוספט דו-בסיסי נטול מים</td><td>תרמו פישר</td><td>P290</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>תרמו פישר</td><td>BP358</td><td></td></tr></tbody></table>

בשכבה דקה כרומטוגרפי (tlc) הפרדות וbioassays של תמציות צמחים כדי לזהות תרכובות antimicrobial

Thin-layer Chromatographic (TLC) Separations and Bioassays of Plant Extracts to Identify Antimicrobial Compounds

מסך משותף לתרכובות מיקרוביאלית צמח מורכב של הפרדת תמציות צמחים על ידי נייר או כרומטוגרפיה בשכבה דקה (PC או TLC), חושפת את chromatograms להשעיות של חיידקים (למשל פטריות או חיידקים במרק או אגר), ומאפשרים זמן לחיידקים לגדול ב סביבה לחה, באופן חזותי אזורים ללא התפתחותם של חיידקים. היעילות של שיטת הקרנה זו, הידועה בשם bioautography, תלויה הן באיכות של הפרדת chromatographic והטיפול נלקח בתנאי תרבות של חיידקים. מאמר זה מתאר פרוטוקולים סטנדרטיים עבור TLC וbioautography מגע עם יישום חדשני לאמין חיידקי תסיסת חומצה. התמצית מופרדת על צלחות TLC סיליקה (מגובות אלומיניום) גמישות, ולהקות הם דמיינו תחת אור אולטרה סגול (UV). אזורים הם לגזור וטופחו על פנים על אגר מחוסן עם מיקרואורגניזם הבדיקה. להקות מעכבות הם דמיינו ידי מכתימים את הצלחת אגרים עם tetrazolium אדום. השיטה מיושמת להפרדה של תלתן אדום (Trifolium pratense קורות חיים. Kenland) תרכובות פנוליות וההקרנה שלהם לפעילות נגד sticklandii Clostridium, חיידק היפר לייצור אמוניה (HAB) כי הוא יליד המסס השור. שיטות TLC תחולנה על סוגים רבים של תמציות צמחים ומיני חיידקים אחרים (אירוביים או אנאירובי), כמו גם פטריות, ניתן להשתמש בם כיצורי מבחן אם תנאי התרבות שונו כדי שיתאימו לדרישות הצמיחה של המינים.

הפרדות TLC סיליקה נציג של תלתן אדום תמציות (CV pratense Trifolium. Kenland), המכילים תרכובות פנוליות, מוצגות באיור 2. הפרדה של תמצית תלתן אדומה ביצטטו-הקסאן אתיל (9:01, v / v), מעל 8.5 סנטימטר, הביא חמש להקות, (איור 2 א) אחד חלקי נפתר מהמקור. עם זאת, איור 2 מראה כי להקות על כפליים נחשפו כאשר מדגם של תמצית תלתן אדומה (מאותו הזן, אבל גדלו בחלקה נפרדת באותו המשק) שונה הופרד על פני מרחק גדול יותר (15 סנטימטר במקום 8.5 סנטימטר...

שיטות מתוארות להפרדת chromatographic בשכבה דקה (TLC) של תמציות צמחים וbioautography קשר לזהות מטבוליטים אנטי בקטריאליים. השיטות מיושמות להקרנה של תרכובות פנוליות תלתן אדומים עיכוב חיידקים מייצרי אמוניה היפר (HAB) יליד המסס השור.

בשכבה דקה כרומטוגרפי (TLC) הפרדות וbioassays של תמציות צמחים כדי לזהות תרכובות Antimicrobial

A common screen for plant antimicrobial compounds consists of separating plant extracts by paper or thin-layer chromatography (PC or TLC), exposing the ...

המטרה הכללית של הליך זה היא לזהות מטבוליטים של צמחים בעלי פעילות אנטי-מיקרוביאלית נגד חיידקים אנארוביים. מטרה זו מושגת תחילה על ידי הפרדת תמצית צמחית באמצעות כרומטוגרפיה על שכבה דקה (TLC). לאחר מכן, הכרומטוגרמה נחתכת לאזורים המכילים תרכובת אחת או יותר.לאחר מכן, מניחים את האזורים על גהגא שזוהם בחיידקים אנאירוביים ומדגירים אותם. לאחר הדגירה, מסירים את האזורים וצובעים את הפתחים כדי לזהות תרכובים המעכבים צמיחה חיידקית. הנתונים המתקבלים חושפים את נוכחותם או היעדרם של מטבוליטים צמחיים אנטימיקרוביאליים.שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום התזונה של רuminants, כגון מהן ההשפעות של מטבוליטים משניים של צמחים על ניצול חומרים מזינים על ידי מיקרואורגניזמים ספציפיים. למרות ששיטה זו חושפת תרכובות צמחיות המעכבות חיידקי קידקא (rumen), ניתן להשתמש בה גם לחשיפת תרכובות המעכבות חיידקים או פטריות אחרים.בפרוטוקול זה, תרכובות פנוליות מנפש אדום ישמשו להדגמת זיהוי של תרכובות אנטימיקרוביאליות באמצעות ביוגרפיה במגע. התחילו בניקוי של לוחות כרומטוגרפיה בשכבה דקה או TLC בעבודה בתוך מ 빠르게כאשר המערך מוצב בתוך התא כאן, מכינים תמיסה של אתיל אצטט ומנול ביחס של שניים לאחד. לאחר מכן, בעודכם לובשים כפפות ועובדים תחת מ 빠르게, השתמשו במספריים כדי לגזור פלטות סיליקה גמישות בעלות גב אלומיניום או פלסטיק כך שיתאימו לתא הפיתוח.הכניסו את הפלטות לתא כאשר החלקים העליונים נשענים על דפנות התא. הפלטות לא צריכות לגעת זו בזו. כסו את התא והניחו לממס לעלות במעלה הפלטות באמצעות פעולת נימיות.כאשר הממס מגיע לקצה העליון של הלוחיות, הוציאו אותן מתא הריצה והניחו אותן במצב אנכי במכסה המנדף עד שמיסם הממס יתאדה. לאחר שהלוחיות התייבשו, בדקו אם זיהומים נדדו לכיוון החלק העליון של לוחיות ה-TLC. אלו יופיעו כפס צהוב תחת תאורה נראית או כפס פלואורסצנטי תחת תאורת ultraviolet.אם רוב הפלטה עדיין בעלת גוון צהבהב, חזור על תהליך הניקוי באותה תא TLC תוך שימוש באותו ממס. לאחר הוצאת פלטות ה-TLC מהתא, השלך את הממס. המתן להתאיידות מלאה של שאריות הממס לפני שימוש בתא עבור החלק הבא של הפרוטוקול.כדי להסיר לחות שיורית שעלולה להשפיע על נדירת התרכובות על הסיליקה, העמידו את הלוחיות במצב אנכי בתנור ייבוש בטמפרטורה של 100 °C למשך 10 עד 15 דקות עבור לוחית של 20 על 20 סנטימטרים, וחמש דקות עבור לחיות של 7 על 10 סנטימטרים. לאחר שהלוחיות יתייבשו, הניחו להן להגיע לטמפרטורת החדר לפני טעינתן בתמציות. להכנת התאים להפרדת התמציות, השתמשו במספריים כדי לגזור פיסת נייר סינון שגובהה נמוך מעט מגובה התא ורוחבה הוא כחצי מהיקף התא.נייר זה ישמש כפתיל לשאיבת הממסים במעלה דופן התא ולהרוויית התא בניירות ממס, ובכך ישפר את השחזוריות של ההפרדות. ערבב את הממסים כאן בתוך מנדף. הממסים שנעשה בהם שימוש הם ethyl acetate ו-methanol ביחס של ארבעה לאחד לנפח. שפוך את תערובת הממסים לתוך התא וכסה אותו.השתמשו בעיפרון כדי לסמן קלות את נקודת המוצא בנקודה על פלטת ה-TLC שתהיה מעל פני הממס המפתח בתא. אם החומר הסופג של פלטת ה-TLC רך ונוטה להינזק בקלות, סמנו את השוליים כפי שמוצג כאן. לאחר מכן, המסו את התמציות בכמות מספקת של ממס אורגני כדי לקבל תמיסה רכזת במקום סספנסיה עכורה.במקרה זה הממס שנעשה בו שימוש הוא מתנול. שימוש במיקרו-פיפטות קפילריות או במזרק מיקרוליטר מאפשר להעמיס סטנדרטים ודגימות כפסים צרים, תוך השארת שוליים של סנטימטר אחד בצדדי הלוח. כדי לייבש את הפסים במהירות רבה יותר, ניתן להנפנף בלוח או להניחו בתוך מופה. לאחר שהפסים התייבשו, העמיסו את הדגימות שוב באותו נקודת העמסה או בצעו העמסה חוזרת על אותן נקודות (over spot).אם נדרש ריכוז גבוה יותר של הדגימה על הלוח, חזור על הפעולה לפי הצורך בתא ה-TLC. ודא כי כל הפתיל רווי בממס. לאחר מכן, בעזרת פינצטה או מלקחים, הנח את הלוחות בתוך תא ה-TLC.הלוחיות לא צריכות לגעת בפתיל. כסו את התא והמתינו להתפתחות הלוחיות לפני שחזית הממס מגיעה לקצה העליון של הלוחית. הוציאו את הלוחיות ממיכל ה-TLC וסמנו את גובה חזית הממס בעזרת עיפרון.הניחו לפלטה להתייבש. בתוך מ 빠르게, פתחו את שאר פלטות ה-TLC באותה תא TLC, שבדרך כלל ניתן להשתמש בו לאורך יום שלם אם הוא נשאר סגור. אם כמות הממס בתא פוחתת באופן ניכר, הכינו תערובת ממס נוספת לאחר שהפלטות התייבשו.הדמיאו את הפסים תחת אור נראה או אור UV. תא צפייה עם מנורת UV ניידת הוא פתרון נוח, במיוחד אם המנורה מסוגלת לזהות תרכובים הן באורך גל קצר של 254 nanometer והן באורך גל ארוך של 365 nanometer של UV. השתמשו בעיפרון כדי לסמן את הפסים, והשתמשו במערכת לתיעוד תצלומי ג'ל המצוידת בתאורה עליונה, UV ו/או אור נראה כדי להשיג תמונות של הלוחות.לבסוף, כדי לסייע באפיון הפסים, חשבו את מקדם השרידות או את ערכי ה-RF על ידי מדידת המרחק שעבר התרכובת, לאחר מכן מדידת המרחק שעבר הממס וחילוק הראשון באחרון. לאחר סימון מיקומי הפסים, ניתן לשמור את הפלטות להמשך. השתמשו בהן בבדיקה הביולוגית.עטפו את הפלטות בניילון וכסו אותן בנייר אלומיניום. אחסנו את הפלטות בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס. משך האחסון המקסימלי תלוי ביציבות התרכובת כיוון שסיליקה אינה ניטרלית.ייתכן שחלק מהתרכובות יתפרקו בעודן על לוח ה-TLC. כהכנה לבדיקת הביוגרפיה במגע, הכין והזרק חיידקים מייצרי אמוניה גבוהה או מצע HAB בתנאים אנאירוביים. התרבית המשמשת במקרה זה היא Clostridium stickland eye strain sr.גדלו את התרבית לשלב האקספוננציאלי או לשלב הסטציונרי בטמפרטורה של 39 °C. השתמשו בטכניקות אנאירוביות סטריליות בעבודה עם מיקרואורגניזמים אנאירוביים. הכינו תמיסה בריכוז 0.75% משקל לנפח.אגר באותו מצע ששימש להגדלת החיידקים, לאחר שטמפרטורת האגר ירדה לפחות מ-60 °C. יש להחדיר לאגר המומס 1% נפח לנפח מהתרבית ולערבב בעדינות; מיד לאחר מכן יש להניח אותו בתא אנאירובי ולשפוך למכלי פטרי פלסטיים בגודל 15 על 100 מילימטר באמצעות מספריים. יש לחתוך את לוח ה-TLC לאזורים המכילים את הפס או הפסים הרלוונטיים.סמנו את הצד האחורי של הפלטות באמצעות טוש Sharpie. הניחו פס TLC שאינו בשימוש על פלטת האגר כביקורת. לאחר מכן, הניחו את הפסים כשהפנים פונה כלפי מטה על פלטות האגר.דגרו את הצלחות כשהצד של האגר פונה כלפי מטה באינקובטור של תא האנאירובי למשך 24 שעות בטמפרטורה של 39 °C באמצעות פינצטה. הוציאו את פסי ה-TLC מצעי האגר בעודם בתוך התא האנאירובי.הוסיפו tetra oleum red טיפה אחר טיפה על פני פלטות האגר. המתינו לפחות 20 דקות לפיתוח הצבע. כאשר פלטת הביקורת תהפוך לאדומה לחלוטין, הוציאו את הפלטות מתא האנאירובי.Clostridium stick Landi הוא חיידק אנאירובי, ולכן הוא יתחיל לאבד את חיוניותו מיד לאחר הוצאתו מהתא האנאירובי, אך הצבע נותר יציב למשך למעלה מ-24 שעות. צלם את הפלטות באמצעות מצלמה דיגיטלית תחת אור נראה על רקע המספק ניגודיות מספקת. צבע אדום בהיר ייראה כאשר תאים חיים נצבעים.תאים מתים אינם נצבעים. מוצגות כאן הפרדות TLC מייצגות של תמציות תיתורה אדומה המכילות תרכובים פנוליים על סיליקה. הפרדה בתוך ethyl acetate hexane ביחס של תשע לאחד על פני 8.5 סנטימטרים הניבה חמישה פסים, כאשר אחד מהם הופרד לחלוטין מנקודת המוצא.הסטנדרטים שהוטענו היו Formin Bio Canon A ו-Genine. ארבע רצועות מלוח זה הועברו לתרביות עם Clostridium stick Landi, חיידק המייצר היפר-אמוניה בקיבקיב, למשך 24 שעות ונצבעו ב-tetra oleum red כפי שמתואר כאן. דגירה עם רצועה אחת של Bio Canon A וחלק מרצועה שתיים של four Monon nein על אגרר זריעה של חיידקים הביאה לאזור עיכוב מוגדר היטב.עם זאת, דגירה של שאר פס שני, יחד עם פסי שלושה וארבעה, לא עיכבה את הצמיחה הבקטריאלית. תוצאות אלו הוכירו כי bio Canon A עיכב את צמיחת see stickland eye, אך form aone Nein לא עיכב אותה. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור כי הטכניקה היא גמישה.ניתן להשתמש במיקרואורגניזמים אחרים לבדיקה כל עוד נבחרים מצעים מתאימים, ונכללו בקרות כדי להבטיח שכימיה ההפרדה ושיטת הזיהוי תואמות לביצוע פרוצדורה זו. ניתן להשתמש בטכניקות אחרות, כגון כרומטוגרפיה נוזלית בעירה גבוהה (HPLC) וספקטרומטריה של מסות, כדי לסייע באפיון התרכובות האנטימיקרוביאליות שזוהו בבדיקה ביולוגית (bioassay).

thin-layer-chromatographic-tlc-separations-bioassays-plant-extracts

Research

JoVE Journal

Chemistry

כימיה

הרכב תמציות השומנים הקוטב הרכב חומצות שומן של glycerolipids הפרט נקבעים ניסוי פשוט חזקים פרופיל השומנים. לענין זה, glycerolipids מבודדים על ידי כרומטוגרפיה בשכבה דקה נתונה transmethylation של קבוצות acyl שלהם. Methylesters acyl שומן הם לכמת ידי כרומטוגרפיה גז נוזלי.

Thaliana ארבידופסיס פולאר Glycerolipid פרופיל ידי כרומטוגרפיה בשכבה דקה (TLC) יחד עם כרומטוגרפיה גז נוזלי (GLC)

מוצרים טבעיים מייצגים נקודות התחלה מבטיחות לפיתוח תרופות חדשות וסוכנים טיפוליים. עם זאת, בשל המגוון הכימי הגבוה, מציאת תרכובות טיפוליות חדשות מצמחים היא משימה מאתגרת וגוזלת זמן. אנו מתארים גישה פשוטה לזיהוי מולקולות מיקרוביאלית ואנטיביופילם מתמציות צמחים ושברים.

גישה שיטתית לזיהוי מולקולות אנטי-מיקרוביאליות ואנטיביופילם חדשניות מתמציות ושברים של צמחים למניעת עששת שיניים

הפרוטוקול הנוכחי פיתח שיטה להערכת התפוקה של תרכובות על לוח TLC באמצעות טכניקת התאורה הכחולה-LED. היתרונות של גישה זו הם שהיא בטוחה, יעילה, זולה, ומאפשרת לחוקר למדוד מספר דגימות בו זמנית.

הערכת התפוקה של תרכובות על לוח TLC באמצעות טכניקת התאורה הכחולה-LED

אנו מתארים את השימוש בכרומטוגרפיה בשכבה דקה, בדיקת ביואוטוגרפיה ישירה וספקטרומטריית מסה של כרומטוגרפיה נוזלית כדי לזהות מוצרים טבעיים מיקרוביאליים המציגים אנטגוניזם נגד פתוגנים פטרייתיים באמצעות הפתוגן Sclerotinia sclerotiorum והדברה ביולוגית Bacillus isolates כמערכת מודל.

זיהוי מונחה ביואסי של מוצרים טבעיים להדברה ביולוגית על ידי כרומטוגרפיה בשכבה דקה - ביואוטוגרפיה ישירה

מחקר זה פיתח כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים בשילוב עם שיטת ספקטרומטריית מסה משולשת (HPLC-QQQ-MS) לזיהוי וכימות אלקלואידים של טרופן (היוסציאמין, אניסודמין, סקופולמין) ב-Anisodus tanguticus. השיטה הוכיחה את עצמה כמהירה, מדויקת ואמינה לניתוח מהיר של צמחי מרפא.

שיטת HPLC-QQQ-MS יעילה ומהירה לכימות אלקלואידים טרופאן בצמחי מרפא

integument יונקים מכיל שומני ממס לחילוץ שיכול לספק אופייני הרכב כימי של מינים בודדים. מאמר זה מציג שיטה שגרתית להפרדת כיתות שומנים רחבות בודדו מרקמות הכסות באמצעות כרומטוגרפיה בשכבה דקה וקביעת פרופיל triacylglyceride ידי ספקטרומטריית בסיוע מטריקס לייזר desorption / יינון הזמן של הטיסה המונית.

פרופיל תוכן Triacylglyceride בשומני הכסות בת על ידי כרומטוגרפיה Preparative שכבה דקה וMALDI-TOF המוני ספקטרומטריית

מתוארות שתי שיטות להקצאת אותות התהודה המגנטית הגרעינית של α ו-ε-dimethylamine של ליזין N-terminal 13C-methylated. שיטה אחת משתמשת בסלקטיביות הנגרמת על ידי pH של תגובת המתילציה הרדוקטיבית, והשנייה משתמשת באמינופפטידאז כדי להסיר באופן סלקטיבי את הליזין הטרמינלי N.

שיטות לזיהוי תהודת ה-NMR של 13C-dimethyl N-terminal אמין על חלבונים שעברו מתילציה רדוקטיבית

וידאו זה מציג פרוטוקול לניתוח spectrometrical ההמוני של תרכובות רגישות תנודתי ושל חמצון באמצעות יינון השפעת אלקטרונים. הטכניקה המוצגת הינה בעיקר עניין לכימאים אורגניים, עבודה עם organyls מתכת, silanes, או phosphanes שצריך להיות מטופלים באמצעות תנאי אינרטי, כגון טכניקת Schlenk.

ניתוח של תרכובות נדיפות רגישות וחמצון באמצעות מערכת קרה מפרצון ואלקטרוני השפעה המוני ספקטרומטריית

פרוטוקול זה מתאר את הטכניקות הספציפיות המשמשות לאפיון מבני של רצפי גליקוזיל מפחיתים (RE) ואזור פנימי של הטרוקסילנים על ידי תיוג ה-RE עם 2 אמינובנזמיד לפני הידרוליזה אנזימטית (אנדוקסילאנאז) ולאחר מכן ניתוח של האוליגוסכרידים המתקבלים באמצעות ספקטרומטריית מסה (MS) ותהודה מגנטית גרעינית (NMR).

רצף של הצמח קיר Heteroxylans שימוש enzymic, כימית (מתילציה) הפיזיקליים (ספקטרומטריית מסה, תהודה מגנטית גרעינית) טכניקות

שיטה המשלבת כרומטוגרפיה גז דו-מימדי מקיף עם זיהוי chemiluminescence חנקן פותחה ויושמה ניתוח on-line של תרכובות המכילות חנקן במטריצה ​​פחמימנים מורכבים.

ניתוח אונליין של חנקן המכיל תרכובות ב מטריצות פחמימן Complex

למדו לזהות תרכובות אנטימיקרוביאליות ממיצויי צמחים באמצעות כרומטוגרפיית שכבה דקה (TLC) וביואסיי. השיטה מדגימה זיהוי פנולים מכתרת האדומה הפועלים נגד חיידקים מייצרי אמוניה ברומן הבקר.

בשכבה דקה כרומטוגרפי (TLC) הפרדות וbioassays של תמציות צמחים כדי לזהות תרכובות Antimicrobial

גלה סרטונים נוספים