4.10: Genotipificación del ratón

El genotipado es el proceso de detectar la presencia, o ausencia, de secuencias específicas de ADN en el genoma de un organismo en particular.

Dado que los genes pueden influir en el fenotipo de un ratón, el hecho de poder sondear la composición genética de un ratón individual, o ?genotipo,? es fundamental para atribuir un fenotipo a un gen específico. Este video explorará la genética del ratón, demostrará los pasos clave del procedimiento de genotipado y explicará cómo interpretar los resultados del genotipado basado en PCR.

Para entender lo que buscan los investigadores cuando genotipan ratones, repasemos algunas manipulaciones comunes de la genética de ratones.

Para estudiar un gen, los científicos frecuentemente interrumpen su función alterando su secuencia genética. Sin embargo, los ratones son diploides, por lo que tienen dos copias de cualquier gen dado. Dado que la mayoría de los genes necesitan solo una copia normal para funcionar, los ratones deben ser criados para producir un animal con ambos genes alterados antes de estudiar el fenotipo.

A este genotipo se le llama "knockout homocigótico". o más comúnmente simplemente ?nocaut? para abreviar. Por el contrario, un ratón normal con dos copias funcionales se denomina "tipo salvaje homocigótico". o simplemente ?tipo salvaje.? Por último, los ratones con una sola copia funcional se denominan "heterocigotos". o ?hets.?

En lugar de eliminar material genético, algunos experimentos requieren la introducción de secuencias de ADN en el genoma del ratón. Estos fragmentos de ADN insertados se denominan "transgenes". y los ratones que los portan son ?transgénicos". El ?transgén? introducida en ratones es una que impulsa la expresión de la proteína fluorescente verde, o GFP, de las medusas. Mediante el uso de un promotor específico de tejido (una secuencia reguladora que "promueve" la actividad de un gen) para impulsar la producción de GFP, las células de un tipo de tejido específico se pueden identificar fácilmente mediante fluorescencia verde.

Debido a que muchos cambios genéticos no conducen a un fenotipo fácilmente observable, como la expresión de GFP, los ratones necesitan ser genotipados para determinar qué animal específico debe usarse en los experimentos. Antes del genotipado, los ratones deben ser etiquetados cuidadosamente para que puedan ser identificados de nuevo más tarde. No, necesitarás algo más permanente que eso. Un método común es hacer muescas en la oreja, de modo que la posición y el número de muescas correspondan a un número de identificación.

Una vez que el ratón esté marcado, recoja un pequeño trozo de tejido (generalmente de 2 a 5 mm de cola, usando una hoja de afeitar o unas tijeras) del que extraer el ADN. Si vas a recolectar tejido de más de un ratón, marca los segmentos usados de la hoja para asegurarte de que no usarás la misma parte en el siguiente animal, lo que podría provocar contaminación cruzada en tus muestras.

Para comenzar el proceso de separación del material genético de otros componentes del tejido, la muestra se digiere en un tampón de lisis que contiene la enzima proteinasa K. Después de una digestión durante la noche, la muestra se centrifuga a pellets de pelo y cualquier otro material no digerido. Para aislar el ADN del lisado digerido, un método sencillo y eficaz es añadir alcohol para precipitar los ácidos nucleicos. Después de una breve incubación, la muestra se centrifuga nuevamente para recoger el ADN en un gránulo.

Después de lavar con etanol al 70% para eliminar el exceso de sales, el pellet de ADN se resuspende en agua o tampón y está listo para el genotipado.

Existen muchas estrategias para determinar si una secuencia específica de ADN está presente en los ratones. La mayoría de ellos requieren que primero amplifique la región genética de interés mediante la reacción en cadena de la polimerasa o PCR. Para obtener más información sobre cómo configurar la PCR, consulte la sección Educación Científica de JoVE ? Guía de PCR.?

Un método para distinguir genotipos es detectar cambios en el tamaño del fragmento amplificado por PCR. Digamos que estás seleccionando ratones con una inserción genética de 700 pares de bases. Después de la PCR, las bandas de tipo salvaje son de 200 pares de bases y las bandas de transgenes deben ser de 900 pares de bases.

Después de realizar su PCR, separe los productos de reacción en un gel de agarosa de porcentaje adecuado, para que pueda distinguir los tamaños de sus fragmentos. El control de tipo salvaje solo debe tener la banda de tipo salvaje de 200 pares de bases; el control transgénico solo debe tener un par de bases 900, banda transgénica; y el control het debe tener ambas bandas. Por último, un ?no template? se incluye un control para asegurarse de que los reactivos no contengan ADN contaminante y, por lo tanto, no deben generar ninguna banda.

Ahora que estamos seguros de que los controles funcionaron como se esperaba, echemos un vistazo a los ratones desconocidos. Dado que los ratones 1 y 2 tienen cada uno una sola banda de tipo salvaje, son homocigotos de tipo salvaje. Los ratones 4 y 6 tienen cada uno una sola banda transgénica y, por lo tanto, son transgénicos homocigotos.

Y los ratones 3 y 5 tienen cada uno dos bandas y, por lo tanto, son hets.

Finalmente, cuando regrese a encontrar los ratones con el genotipo que desea, solo necesita hacer coincidir el patrón de muescas de las orejas con el número de identificación del mouse.

Después de comprender qué es el genotipado y cómo se realiza, veamos algunos ejemplos de por qué es útil.

En algunos casos, se requieren modificaciones genéticas más complejas para producir el fenotipo deseado. Por ejemplo, para establecer este modelo de cáncer de piel en ratones, se requieren dos transgenes. Uno es portador de un ?oncogén inducible,? o un gen que puede causar cáncer, y el segundo lleva la enzima Cre recombinasa, que solo se expresa en las células de la piel y extirpa una secuencia que impide la transcripción del oncogén, permitiendo así la expresión del oncogén. Para producir descendencia con ambos transgenes, se aparean ratones heterocigotos para cada uno. A continuación, se utiliza el genotipado para identificar la descendencia deseada.

A veces puede que no sea posible genotipar ratones antes de un experimento. Por ejemplo, en este estudio de la frecuencia cardíaca embrionaria, no es factible recolectar tejido para el genotipado de los embriones sin interrumpir su comportamiento. Por lo tanto, las posiciones de los embriones dentro de la madre primero se etiquetan cuidadosamente y luego se registran las mediciones de ultrasonido. Por último, se recogen biopsias de cola para determinar el efecto del genotipo sobre la frecuencia cardíaca.

Este video ha demostrado un método de extracción de ADN, pero hay muchas variaciones. Por ejemplo, el sistema de PCR directa requiere menos de cinco minutos de digestión de tejidos. Además, después de centrifugar el material no digerido, el sobrenadante está listo para la PCR, lo que elimina la necesidad de purificar el ADN.

Acabas de ver la guía de JoVE para el genotipado de ratones. En este vídeo, hemos repasado los conceptos básicos de la genética de ratones, cómo preparar y analizar muestras de ADN de ratón, así como algunas aplicaciones prácticas de esta técnica. ¡Gracias por mirar!