Name: Geregisseerd Dopaminerge Neuron Differentiatie van menselijke pluripotente stamcellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 40 s
Description: Leer een geoptimaliseerd protocol voor de differentiatie van A9 middenhersen-dopaminerge neuronen uit menselijke pluripotente stamcellen. Deze methode biedt een efficiënte tool voor het modelleren van de ziekte van Parkinson.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs danken de leden van het Renee Reijo Pera laboratorium voor hun hulp tijdens de ontwikkeling van dit protocol en tijdens de voorbereiding van dit manuscript. Dit werk wordt ondersteund door het California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) gedeelde laboratorium (CL-00518).

1 Voorbereiding van Cultuur Media <ol><li> Bereid muis embryonale fibroblasten (MEF) medium door combinatie van de volgende: 445 ml DMEM, 50 ml foetaal runderserum (FBS) en 5 ml 100x penicilline / ampicilline voorraadoplossing. Houd filter gesteriliseerd bij 4 ° C gedurende ten hoogste 14 dagen. </li><li> Bereid serumbevattend HPSC kweekmedium door combinatie van de volgende: 385 ml DMEM / F12, 100 ml knockout serum vervanging (KSR), 5 ml 100x niet-essentiële aminozuren stockoplossing, 5 ml 100x penicilline / ampicilline stockoplossing, 5 ml 100x mercaptoethanol voorraadoplossing en 10 ng / ml bFGF. Blijf filter gesteriliseerd medium bij 4 ° C gedurende maximaal 10 dagen. </li><li> Bereid mTeSR1 serumvrij medium door combinatie van de volgende: 400 ml mTeSR1 basaal medium, 100 ml 5x supplement en 5 ml 100x penicilline / ampicilline voorraadoplossing. Bewaar bij 4 ° C gedurende maximaal 10 dagen. </li><li> Bereid 10x collagenase IV stamoplossing: weeg 0,5 g collagenase IV macht, enlos het op met 50 ml DMEM / F12 en filter steriliseren. Voeg aliquots en voorraad ze bij -20 ° C gedurende maanden. </li><li> Bereid 0,1% gelatine-oplossing: weeg 0,5 g gelatine (van runderen huid, type B) kracht en los het op met gedemineraliseerd water. Blijf autoclaaf gesteriliseerde oplossing bij kamertemperatuur weken. </li><li> Bereid KSR differentiatiemedium door combinatie van de volgende: 410 ml DMEM, 75 ml KSR, 5 ml 100x niet-essentiële aminozuren stockoplossing, 5 ml 100x penicilline / ampicilline stockoplossing, 5 ml 100x mercaptoethanol voorraadoplossing. Blijf filter gesteriliseerd medium bij 4 ° C gedurende maximaal 10 dagen. OPMERKING: KSR varieert van partij tot partij, die de differentiatie efficiëntie kunnen beïnvloeden. Het is daarom beter om verscheidene partijen KSR testen om de beste voor differentiatie te vinden. </li><li> Bereid N2 differentiatiemedium door het combineren van de volgende: 98 ml DMEM, 1 ml 100x N2 supplement en 1 ml 100x penicilline / ampicilline voorraad oplossing. Blijf filter gesteriliseerd bij 4° C voor niet meer dan 10 dagen. </li><li> Bereid B27 differentiatiemedium door het combineren van de volgende: 480 ml Neurobasal medium, 10 ml 50x B27 supplement, 5 ml 100x Glutamax stockoplossing, en 5 ml 100x penicilline / ampicilline voorraad oplossing. Blijf filter gesteriliseerd medium bij 4 ° C gedurende maximaal 10 dagen. </li></ol> 2 Cultuur van hESC en hiPSCs op MEF feeder cellen De H9 hESCs werden verkregen uit WiCell Research Institute en hiPSCs werden in de Reijo Pera laboratorium door-retrovirus bemiddelde transductie van Yamanaka gevestigde factoren Okt3 / 4, SOX2, KLF4, en c-MYC 18. <ol><li> Ten minste een dag vóór cel passage, bereiden wat gelatine platen door 1 ml 0,1% gelatine 1 putje van platen met 6 putjes en incubeer platen bij 37 ° C gedurende ten minste 30 minuten. </li><li> Na incubatie aspireren gelatine uit platen en zaad bestraling geïnactiveerd MEF cellen op de platen aan de dichtheid van 1,6 x 10 5 cellen/ Putje in MEF medium met behulp van een hemocytometer om de cellen te tellen. OPMERKING: Eventueel bereiden MEF feeders zo vroeg als 3 dagen voor celpassage. </li><li> Passage cellen een dag na het uitplaten MEF feeders: aspireren medium van hPSCs, voeg 1 mg / ml collagenase IV cellen per 1 ml / putje en incubeer cellen bij 37 ° C gedurende 1 uur. </li><li> Tijdens deze incubatie, wassen MEF feeders eenmaal met PBS, en voeg warm (37 ° C) serumbevattend HPSC kweekmedium met 1,5 ml / putje. </li><li> Na 1 uur, tik op de cultuur plaat een paar keer, zodat het grootste deel van de ongedifferentieerde kolonies zal losmaken van de platen, terwijl de gedifferentieerde koloniën verbonden blijven. Verzamel zorgvuldig de drijvende kolonies, en breng ze in 15 ml tube. </li><li> Voorzichtig de plaat eenmaal met warm (37 ° C) DMEM / F12 en DMEM overdragen / F12 in dezelfde 15 ml buis. </li><li> Centrifugeer de buizen bij 179 xg gedurende 3 minuten. </li><li> Zuig medium van de buizen, zorg dat u de pellet te verstoren. Oorlog toevoegenm HPSC kweekmedium, pipet de cellen op en neer meerdere malen om ze te breken in kleine clusters en meng ze goed. </li><li> Breng de cellen op nieuwe MEF feeders op 1: 3-1: 6 verhouding. </li><li> Verander het medium elke dag en passage van de cellen om de 5-6 dagen. </li></ol> 3 Bereiding van cellen voor differentiatie <ol><li> Ten minste een dag vóór de bereiding van cellen, bereiden wat Matrigel platen (meestal 3 wells van een 6-well plaat). Verdun de Matrigel met koud (4 ° C) DMEM / F12 om 1:40 en voeg 1 ml Matrigel per putje van platen met 6 putjes. Incubeer Matrigel platen bij 4 ° C overnacht. OPMERKING: Men kan Matrigel platen dichten met Parafilm en voorraad hen bij 4 ° C voor zo lang als een week. </li><li> Gebruik cellen (zie stap 2) 4 dagen na de passage. Verwijder al het gedifferentieerde kolonies van de platen. Zuig medium uit de kweek plaat, voeg 1 ml Accutase per putje en incubeer cellen bij 37 ° C gedurende 5 minuten. </li><li> Tijdens de incubatie, bereiden wat gelAtin platen door 1 ml gelatine 1 putje van platen met 6 putjes. Plaats deze platen en de Matrigel-platen voorbereid op een dag voordat in de broedstoof. </li><li> Na 5 min incubatie of wanneer cellen zijn semizwevende, pipet cellen en neer meerdere malen om ze te maken in enkele cellen. </li><li> Verzamel enkele cellen in 15 ml buizen en centrifugeer bij 258 xg gedurende 3 minuten. </li><li> Resuspendeer cellen met geschikte hoeveelheid serum bevattend HPSC kweekmedium en voeg Thiazovivin aan de uiteindelijke concentratie van 2 uM. </li><li> Transfer cellen op gelatine beklede platen 1: 1 verhouding en incubeer cellen bij 37 ° C gedurende 30 minuten om MEF feeders verwijderen. </li><li> Breng de cellen een 15 ml conische buis, voeg juiste serum bevattend medium HPSC en tel de cellen met een hemocytometer. </li><li> Centrifugeer de cellen bij 258 g gedurende 3 minuten. </li><li> Tijdens centrifuge, voeg Thiazovivin aan mTeSR1 medium geschikt is om een ​​concentratie van 2 uM maken. </li><li> Na centrifuge, eenSpirate het medium en voeg passende mTeSR1 medium met Thiazovivin zodat er 1,8 x 10 5 cellen / ml medium. </li><li> Haal de Matrigel platen uit de incubator, zuig het Matrigel en voeg 2 ml van de gemengde cellen op 1 goed van de 6-well platen. OPMERKING: De celdichtheid dient 3,6 x 10 4 cellen / cm 2 oppervlakte. </li><li> Zet de borden terug naar de couveuse, en laat de cellen hechten gedurende 24 uur. </li><li> 24 uur na plating de cellen, zuigen oude medium en voeg 2 ml nieuwe mTeSR1 medium per putje en laat cellen groeien voor nog eens 24 uur voor aanvang van de differentiatie. </li></ol> Cell Differentiation <ol><li> Start differentiatie 48 uur na opnieuw platen van de cellen op Matrigel platen. </li><li> Aspireren kweekmedium van de plaat, was cellen eenmaal met PBS, en 2 ml van de volgende differentiatie medium per well: KSR differentiatie medium aangevuld met 10 pM en 100 nM SB431542 LDN-193189. markeren deze dag als D0 van differentiatie. </li><li> Veranderen medium elke dag van D0 tot D20. OPMERKING: Men kan medium bereiden voor maximaal 2 dagen per keer. </li><li> Gebruik de volgende medium voor D1 en D2: KSR differentiatie medium aangevuld met 10 uM SB431542, 100 nM LDN-193189, 0,25 pM SAG, 2 uM purmorphamine en 50 ng / ml FGF8b. </li><li> Gebruik de volgende medium voor D3 en D4: KSR differentiatie medium aangevuld met 10 uM SB431542, 100 nM LDN-193189, 0,25 pM SAG, 2 uM purmorphamine, 50 ng / ml FGF8b en 3 uM CHIR99021. </li><li> Gebruik de volgende medium voor D5 en D6: 75% KSR differentiatie medium plus 25% N2 differentiatie medium aangevuld met 100 nM LDN-193189, 0,25 uM SAG, 2 uM purmorphamine, 50 ng / ml FGF8b, en 3 uM CHIR99021. </li><li> Gebruik de volgende medium voor D7 en D8: 50% KSR differentiatie medium plus 50% N2 differentiatie medium aangevuld met 100 nM LDN-193189 en 3 uM CHIR99021.</li><li> Gebruik de volgende medium voor D9 en D10: 25% KSR differentiatie medium plus 75% N2 differentiatie medium aangevuld met 100 nM LDN-193189 en 3 uM CHIR99021. </li><li> Gebruik de volgende medium voor D11 en D12: B27 differentiatie medium gesupplementeerd met 3 uM CHIR99021, 10 ng / ml BDNF, 10 ng / ml GDNF, 1 ng / ml TGF3, 0,2 mM ascorbinezuur en 0,1 mM cAMP. </li><li> Gebruik de volgende medium voor de rest van differentiatie: B27 differentiatie medium aangevuld met 10 ng / ml BDNF, 10 ng / ml GDNF, 1 ng / ml TGF3, 0,2 mM ascorbinezuur en 0,1 mM cAMP. </li><li> Rond D16 van differentiatie, bereiden wat poly-L-ornithine / laminine / fibronectine platen. Verdun Poly-L-ornithine voorraadoplossing met koud (4 ° C) PBS tot 15 ug / ml, voeg 1 ml 1 putje van platen met 6 putjes en incubeer de platen bij 37 ° C overnacht. </li><li> Zuig het poly-L-ornithine oplossing was de platen 3 maal met steriel water en daarna aan de lucht drogen de platen. </li><li> Verdunnen laminin voorraad solution met koud (4 ° C) PBS tot 1 ug / ml, voeg 1 ml aan een putje van platen met 6 putjes en incubeer de platen bij 37 ° C overnacht. </li><li> Zuig het laminin oplossing, wassen de platen 3 keer met steriel water en vervolgens aan de lucht drogen de platen. </li><li> Verdun fibronectine voorraadoplossing met koud (4 ° C) PBS tot 2 ug / ml, voeg 1 ml 1 putje van platen met 6 putjes en incubeer de platen bij 37 ° C overnacht. </li><li> Verbinding platen met Parafilm en plaats ze bij 4 ° C gedurende wel twee weken. </li><li> Na 20 dagen van differentiatie, replate de cellen aan de poly-L-ornithine / laminine / fibronectine platen. Zuig differentiatiemedium, voeg 1 ml warm (37 ° C) Accutase 1 putje van platen met 6 putjes en incubeer cellen bij 37 ° C gedurende 5 minuten. </li><li> Tijdens de incubatie plaats de poly-L-ornithine / laminine / fibronectine platen in de incubator. </li><li> Na 5 min incubatie of wanneer cellen zijn semizwevende voorzichtig pipet cellen en neer meerdere malenze in afzonderlijke cellen. </li><li> Verzamel de enige cellen in 15 ml conische buizen, en voeg de juiste hoeveelheid Neurobasal medium voor celtelling, die variëren afhankelijk van expansie (na 11 dagen van differentiatie, cellen 15-20 voudig vergroten). Tel de cellen met een hemocytometer. </li><li> Centrifugeer de cellen bij 258 g gedurende 3 minuten. Zuig supernatant en resuspendeer cellen met B27 differentiatiemedium zodat de celconcentratie 1 x 10 6 cellen / ml medium. </li><li> Zuig fibronectine uit de platen twee keer wassen met PBS, en voeg 2 ml cellen 1 putje van platen met 6 putjes. OPMERKING: De celdichtheid voor replating moet 2 x 10 5 cellen / cm 2 oppervlakte. </li><li> Veranderen medium 24 uur later aan een losse dode cellen te verwijderen. </li><li> Verandering medium om de dag tot de gewenste tijdstippen voor een gegeven experiment. </li></ol>

<ol><li>Freed, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Will+embryonic+stem+cells+be+a+useful+source+of+dopamine+neurons+for+transplant+into+patients+with+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Will embryonic stem cells be a useful source of dopamine neurons for transplant into patients with Parkinson's disease.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 1755-1757 (2002).</li>
<li>Perrier, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+midbrain+dopamine+neurons+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Derivation of midbrain dopamine neurons from human embryonic stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 12543-12548 (2004).</li>
<li>Park, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+analyses+of+human+embryonic+stem+cell-derived+dopamine+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo analyses of human embryonic stem cell-derived dopamine neurons.</a> Journal of Neurochemistry. 92, 1265-1276 (2005).</li>
<li>Buytaert-Hoefen, K. A., Alvarez, E., Freed, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+tyrosine+hydroxylase+positive+neurons+from+human+embryonic+stem+cells+after+coculture+with+cellular+substrates+and+exposure+to+GDNF%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Generation of tyrosine hydroxylase positive neurons from human embryonic stem cells after coculture with cellular substrates and exposure to GDNF.</a> Stem Cells. 22, Dayton, Ohio 669-674 (2004).</li>
<li>Zeng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopaminergic+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Dopaminergic differentiation of human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 22, Dayton, Ohio 925-940 (2004).</li>
<li>Yan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+dopaminergic+neuronal+subtypes+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of dopaminergic neuronal subtypes from human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 23, 781-790 (2005).</li>
<li>Schulz, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+to+dopaminergic+neurons+in+serum-free+suspension+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human embryonic stem cells to dopaminergic neurons in serum-free suspension culture.</a> Stem Cells. 22, 1218-1238 (2004).</li>
<li>Park, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+dopaminergic+neurons+in+vitro+from+human+embryonic+stem+cells+treated+with+neurotrophic+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Generation of dopaminergic neurons in vitro from human embryonic stem cells treated with neurotrophic factors.</a> Neuroscience Letters. 359, 99-103 (2004).</li>
<li>Cho, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+and+large-scale+generation+of+functional+dopamine+neurons+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Highly efficient and large-scale generation of functional dopamine neurons from human embryonic stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 3392-3397 (2008).</li>
<li>Cooper, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+ES+and+Parkinson%27s+disease+iPS+cells+into+ventral+midbrain+dopaminergic+neurons+requires+a+high+activity+form+of+SHH%2C+FGF8a+and+specific+regionalization+by+retinoic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human ES and Parkinson's disease iPS cells into ventral midbrain dopaminergic neurons requires a high activity form of SHH, FGF8a and specific regionalization by retinoic acid.</a> Molecular and Cellular Neurosciences. 45, 258-266 (2010).</li>
<li>Chambers, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+neural+conversion+of+human+ES+and+iPS+cells+by+dual+inhibition+of+SMAD+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling.</a> Nature Biotechnology. 27, 275-280 (2009).</li>
<li>Sanchez-Danes, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+A9+midbrain+dopaminergic+neurons+by+lentiviral+delivery+of+LMX1A+in+human+embryonic+stem+cells+and+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of A9 midbrain dopaminergic neurons by lentiviral delivery of LMX1A in human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells.</a> Human Gene Therapy. 23, 56-69 (2012).</li>
<li>Fasano, C. A., Chambers, S. M., Lee, G., Tomishima, M. J., Studer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+derivation+of+functional+floor+plate+tissue+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Efficient derivation of functional floor plate tissue from human embryonic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 6, 336-347 (2010).</li>
<li>Kriks, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+neurons+derived+from+human+ES+cells+efficiently+engraft+in+animal+models+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson's disease.</a> Nature. 480, 547-551 (2011).</li>
<li>Xi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specification+of+midbrain+dopamine+neurons+from+primate+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Specification of midbrain dopamine neurons from primate pluripotent stem cells.</a> Stem Cells. 30, 1655-1663 (2012).</li>
<li>Kirkeby, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+regionally+specified+neural+progenitors+and+functional+neurons+from+human+embryonic+stem+cells+under+defined+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Generation of regionally specified neural progenitors and functional neurons from human embryonic stem cells under defined conditions.</a> Cell Reports. 1, 703-714 (2012).</li>
<li>Mendez, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type+analysis+of+functional+fetal+dopamine+cell+suspension+transplants+in+the+striatum+and+substantia+nigra+of+patients+with+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%3A+a+Journal+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Cell type analysis of functional fetal dopamine cell suspension transplants in the striatum and substantia nigra of patients with Parkinson's disease.</a> Brain: a Journal of Neurology. 128, 1498-1510 (2005).</li>
<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li>
<li>Nishimura, K., Takahashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+application+of+stem+cell+technology+toward+the+treatment+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+%26+Pharmaceutical+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Therapeutic application of stem cell technology toward the treatment of Parkinson's disease.</a> Biological & Pharmaceutical Bulletin. 36, 171-175 (2013).</li>
<li>Smidt, M. P., Burbach, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+make+a+mesodiencephalic+dopaminergic+neuron%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">How to make a mesodiencephalic dopaminergic neuron.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 8, 21-32 (2007).</li>
<li>Wang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noggin+and+bFGF+cooperate+to+maintain+the+pluripotency+of+human+embryonic+stem+cells+in+the+absence+of+feeder+layers%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Noggin and bFGF cooperate to maintain the pluripotency of human embryonic stem cells in the absence of feeder layers.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 330, 934-942 (2005).</li>
<li>Chen, J. K., Taipale, J., Young, K. E., Maiti, T., Beachy, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecule+modulation+of+Smoothened+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Small molecule modulation of Smoothened activity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 14071-14076 (2002).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Humane pluripotente stamcellen (zowel hESCs en hiPSCs) kunnen worden gedifferentieerd in vitro te genereren meeste, zo niet alle celtypen van het lichaam waaronder DA neuronen, die is aangetoond in eerdere studies 19. Hier, op basis van kennis van embryonale dopaminerge ontwikkeling 20 en gepubliceerde protocollen van andere laboratoria 14,15, optimaliseerden we de kweekomstandigheden voor de productie van DA neuronen in hESCs en hiPSCs. Dit protocol is efficiënt, reproduceerbar...

Dopamine (DA) neuronen te vinden in verscheidene hersengebieden, waaronder de middenhersenen, hypothalamus, retina en reukkwabben. De A9 DA neuronen in de substantia nigra pars compacta (SNpc) controle gedrag en beweging door het projecteren naar het striatum in de voorhersenen en de vorming van het extrapiramidale motorische systeem. Degeneratie van de A9 DA neuronen leidt tot de ziekte van Parkinson (PD), dat is de tweede meest voorkomende menselijke neurodegeneratieve aandoening en op dit moment ongeneeslijk. Vervangende Celtherapie is een van de meest veelbelovende strategieën voor de behandeling van PD 1, derhalve is er een grote belangstelling voor het afleiden A9 DA neuronen tegen humane pluripotente stamcellen (hPSCs) geweest, zowel humane embryonale stamcellen (hESCs) en recente humane geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSCs). Veel onderzoek is geprobeerd om A9 DA neuronen ontlenen hPSCs met behulp van verschillende methoden. De eerste rapporten alle gegenereerde DA neuronen via een neuralerozet voorlopercellen podium. Door co-kweken met MS5 2 of PA6 3-5 stromale cellen met of zonder externe groeifactoren voor 2-4 weken, L. Studer en collega&#39;s en drie andere groepen met succes geïnduceerde hESCs neurale rozetten produceren. Vervolgens verrijkt deze rozetten met mechanische ontleding of enzymatische digestie voor verdere differentiatie. In andere rapporten, onderzoekers gegenereerd neurale rozetten door embryoid lichaam (EB) drijvende cultuur differentiatie 6-9. Later, onderzoekers werd een monolaag gebaseerd differentiatie werkwijze 10,11, waar ze uitgeplaat hESCs en hiPSCs op extracellulaire matrix, verschillende groeifactoren toegevoegd aan de kweek tot de differentiatie van hPSCs DA neuronen, die de in vivo embryonale DA neuron ontwikkeling nabootst induceren . Hoewel al deze studies verkregen tyrosine hydroxylase (TH) -expressie cellen met een aantal kenmerken van DA neuronen, het hele proces van differentiatie is tijd en arbeid consumeren,algemeen inefficiënt, en nog belangrijker, werden de A9 identiteit van deze neuronen niet aangetoond in de meeste studies behalve degene met LMX1a ectopische expressie 12. Onlangs is een nieuwe vloerplaat (FP) gebaseerde protocol ontwikkeld 13-16, waarbij de FP voorlopers met DA neuron potentiële eerst werden gegenereerd door activering van de sonic hedgehog en Wnt signaalpaden in een vroeg stadium van differentiatie, en deze FP cellen werden verder gespecificeerd naar DA neuronen. Hoewel dit protocol efficiënter, zijn er nog problemen; bijvoorbeeld, de hele differentiatieproces kost tijd (ten minste 35 dagen) en feeder celafhankelijke 15, of EB afhankelijk 16 of A9 identiteit niet aangetoond 14. Hier, op basis van de kennis van in-vivo embryonale DA neuron ontwikkeling en de gepubliceerde resultaten van andere onderzoekers, we hebben de kweekomstandigheden voor de eff geoptimaliseerdeicient generatie DA neuronen van zowel hESCs en hiPSCs. We hebben eerst gegenereerd FP voorloper cellen door activering van het Wnt-signalering met op kleine moleculen CHIR99021 en sonic hedgehog signalering met kleine moleculen SAG en purmorphamine. Deze FP-cellen brengen FOXA2, LMX1a, CORIN, OTX2 en nestine. We hebben toen aangegeven deze FP cellen naar DA neuronen met groeifactoren zoals BDNF, GDNF, etc. De gegenereerde DA neuronen van A9 celtype als ze positief voor GIRK2 maar negatief voor Calbindin 17. Dit protocol is feeder cel of EB onafhankelijke, zeer efficiënte en reproduceerbaar. Met dit protocol kan men afleiden DA neuronen in minder dan 4 weken van hESCs of hiPSCs normale personen voor celtransplantatie, of hiPSCs PD patiënten in vitro modellen van PD of testen van potentiële therapeutische middelen voor PD.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>10569-010</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Life Technologies</td><td>26140</td><td></td></tr><tr><td>penicillin/ampicillin</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>10565-018</td><td></td></tr><tr><td>KSR</td><td>Life Technologies</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>Non-essential amino acid</td><td>Life Technologies</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>b-mercaptoethanol</td><td>Millipore</td><td>ES-007-E</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>R&amp;D Systems</td><td>233-FB-025</td><td></td></tr><tr><td>mTesR1</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>5850</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase IV</td><td>Life Technologies</td><td>17104-019</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9391</td><td></td></tr><tr><td>N2 supplement</td><td>Life Technologies</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>B27 supplement</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td>Life Technologies</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Growth factor reduced matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>MP Biomedicals</td><td>1000449</td><td></td></tr><tr><td>Thiazovivin</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-361380</td><td></td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Tocris Bioscience</td><td>1614</td><td></td></tr><tr><td>LDN-193189</td><td>Stemgent</td><td>04-0074</td><td></td></tr><tr><td>SAG</td><td>EMD Millipore</td><td>566660-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Purmorphamine</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-202785</td><td></td></tr><tr><td>FGF8b</td><td>R&amp;D Systems</td><td>423-F8-025</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Cellagen Technology</td><td>C2447-2s</td><td></td></tr><tr><td>BDNF</td><td>R&amp;D Systems</td><td>248-BD-025</td><td></td></tr><tr><td>GDNF</td><td>R&amp;D Systems</td><td>212-GD-010</td><td></td></tr><tr><td>TGF-beta3</td><td>R&amp;D Systems</td><td>243-B3-002</td><td></td></tr><tr><td>Ascorbic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4034</td><td></td></tr><tr><td>cAMP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0627</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti human NESTIN antibody</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-23927</td><td>1/1,000 dilutie</td></tr><tr><td>Rabbit anti human OTX2 antibody</td><td>Millipore</td><td>AB9566</td><td>1/2,000 verdunning</td></tr><tr><td>Goat anti human FOXA2 antibody</td><td>R&amp;D Systems</td><td>AF2400</td><td>1/200 verdunning</td></tr><tr><td>rabbit anti human LMX1a antibody</td><td>Millipore</td><td>AB10533</td><td>1/1,000 verdunning</td></tr><tr><td>Rabbit anti human TH antibody</td><td>Pel Freez</td><td>P40101</td><td>1/500 verdunning</td></tr><tr><td>Chicken anti human TH antibody</td><td>Millipore</td><td>AB9702</td><td>1/500 verdunning</td></tr><tr><td>Mouse anti human TUJ1 antibody</td><td>Covance</td><td>MMS-435P</td><td>1/2,000 verdunning</td></tr><tr><td>Rabbit anti human GIRK2 antibody</td><td>Abcam</td><td>ab30738</td><td>1/300 verdunning</td></tr><tr><td>Rabbit anti human Calbindin antibody</td><td>Abcam</td><td>ab25085</td><td>1/400 verdunning</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5804</td><td></td></tr></tbody></table>

geregisseerd dopaminerge neuron differentiatie van menselijke pluripotente stamcellen

Directed Dopaminergic Neuron Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells

Dopaminerge (DA) neuronen in de substantia nigra pars compacta (ook bekend als A9 DA neuronen) zijn het specifieke celtype dat verloren gaat bij de ziekte van Parkinson (PD). Er is veel interesse in het afleiden van A9 DA neuronen uit humane pluripotente stamcellen (hPSCs) voor regeneratieve celvervangende therapie voor PD. Tijdens neurale ontwikkeling, ontstaan A9 DA neuronen uit de floor plate (FP) precursoren die zich op de ventrale middenlijn van het centrale zenuwstelsel bevinden. Hier optimaliseren we de kweekomstandigheden voor de stapsgewijze differentiatie van hPSCs naar A9 DA neuronen, die de embryonale DA neuronontwikkeling nabootst. In ons protocol beschrijven we eerst de efficiënte generatie van FP precursor cellen uit hPSCs met behulp van een kleine molecuulmethode, en vervolgens het omzetten van de FP cellen naar A9 DA neuronen, die in vitro gedurende meerdere maanden kunnen worden onderhouden. Dit efficiënte, herhaalbare en controleerbare protocol werkt goed bij humane embryonale stamcellen (hESCs) en humane geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSCs) van normale personen en PD-patiënten, waarbij men A9 DA neuronen kan afleiden om in vitro ziektemodellering en geneesmiddelenscreening en in vivo celtransplantatietherapie voor PD uit te voeren.

Een overzicht van de differentiatie protocol wordt getoond in figuur 1. Het rendement van de differentiatie protocol hier gepresenteerde steunt op de status van de uitgangscellen. Daarom is het essentieel om ervoor te zorgen dat eerste verwijdert alle gedifferentieerde koloniën voor dissociëren hPSCs in enkelvoudige cellen voor differentiatie en anderzijds een put meeste, zo niet alle, de MEF feeder-cellen door de cellen te incuberen op gelatine beklede platen gedurende 30 min, en derde, de platen HPSC ...

Wij hebben, op basis van kennis uit de ontwikkelingsbiologie en gepubliceerd onderzoek, een geoptimaliseerd protocol ontwikkeld om efficiënt A9 middenhersen-dopaminerge neuronen te genereren uit zowel menselijke embryonale stamcellen als menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen, wat nuttig zou zijn voor ziektemodellering en celvervangende therapie voor de ziekte van Parkinson.

Geregisseerd Dopaminerge Neuron Differentiatie van menselijke pluripotente stamcellen

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta  (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in ...

Het algemene doel van deze procedure is het induceren van een zeer efficiënte differentiatie van dopaminerge neuronen in vitro. Dit wordt bereikt door eerst een adhesiecultuur van enkelvoudige menselijke pluripotente stamcellen voor te bereiden.In de tweede stap wordt het celkweekmedium vervangen door neuron-inductiemedium om floorplate-progenitoren te induceren. Vervolgens worden de dopaminerge neuronen gekweekt in rijpingsmedium. Ten slotte worden de dopaminerge neuron-progenitoren in single-cell cultuur gekweekt op met poly-L-ornithine en fibronectine gecoate platen, in rijpingsmedium gedurende 30 dagen.Uiteindelijk kan immunofluorescentiemicroscopie worden gebruikt om de expressie van belangrijke markers voor dopaminerge neuronen te beoordelen. Deze techniek biedt een groter voordeel ten opzichte van het bestaande protocol voor neurosferen op neurozuur. Het kan een meer homogene populatie van dubbele neuronen genereren met een hogere efficiëntie.Zuig vier dagen na passage het medium uit de celculturen af. Los de cellen los met één milliliter Accutane per well en incubeer ze gedurende vijf minuten bij 37 °C. Voeg tijdens de incubatie één milliliter gelatine toe aan elke well van een zes-wells plaat, en plaats deze plaat samen met vers geprepareerde matri gel-gecoate platen in de incubator.Wanneer de cellen semi-zwevend zijn geworden, pipetteer ze dan enkele keren op en neer om een suspensie van enkelvoudige cellen te maken. Trek de cellen vervolgens over naar een buis van 15 milliliter en centrifugeer ze gedurende drie minuten. Bij 258 Gs en kamertemperatuur wordt het pellet opnieuw gesuspendeerd in de juiste hoeveelheid kweekmedium voor humane pluripotente stamcellen, aangevuld met serum, waarna thivivin wordt toegevoegd tot een eindconcentratie van twee millimolars.Incubeer vervolgens de cellen in de met gelatine gecoate platen in een verhouding van één-op-één bij 37 °C gedurende 30 minuten. Om de meth-feeders te verwijderen, worden de cellen vervolgens overgebracht naar een nieuwe buis van 15 ml. Verdun ze in medium voor humane pluripotente stamcellen, aangevuld met serum, en tel ze na het opnieuw centrifugeren van de cellen; resuspendeer de cellen in MT.SRone-medium met thias Ivan tot een concentratie van 180.000 cellen per ml.Aspireer vervolgens de matrigel uit de gecoate platen en verdeel twee milliliters cellen per well. 48 uur. Na het heruitplaten van de cellen in de matrigel-platen.Zuig het medium uit elke put en was de cellen eenmaal met PBS. Voeg vervolgens twee milliliters KSR-differentiatiemedium toe aan de cellen, aangevuld met SB 4 31, 50 42 en L DN 1 9 3 1 8 9, waarbij het medium dagelijks wordt ververst van D 0 tot D 20 zoals beschreven in de tabel. Zuig op dag 20 het differentiatiemedium af en detach de cellen met één milliliter acutus per put bij 37 °C gedurende vijf minuten. Warm tijdens de incubatie de poly-L-ornine laminine fibronectine platen op in de incubator.Resuspendeer na de reanimatie de losgekomen cellen tot een enkelcel-suspensie en verdun de cellen in neurobasaal medium. Centrifugeer na het tellen de cellen en resuspendeer het pellet in B 27 differentiatiemedium bij een concentratie van 1 miljoen cellen per milliliter. Aspireer vervolgens het fibronectine uit de poly-L-ornithine-laminine-fibronectine-platen.Was ze twee keer met PBS en breng 400 microliters cellen over naar elk putje. Vervang ten slotte het medium na de eerste 24 uur, en daarna om de dag tot aan het eindpunt van het experiment om eventuele niet-gehechte dode cellen te verwijderen. Zoals geïllustreerd in deze afbeeldingen, zullen opnieuw geplaatste enkelvoudige menselijke pluripotente stamcelculturen uitbreiden als clusters tijdens de eerste 48 uur van differentiatie, waarbij een confluentie van ongeveer 70% wordt bereikt.Na differentiatie bereiken de cellen binnen drie tot vier dagen volledige confluentie. Tegen dag 20 hechten de gedifferentieerde cellen zich aan en groeien ze als kleine klontjes. Gedurende de volgende vijf dagen verschijnen er binnen de klontjes veel intensievere en morfologisch intacte axonen en neurieten, die enkele verbindingen tussen de klontjes vormen.Na 11 dagen differentiatie kunnen de humane pluripotente stamcellen efficiënt worden omgezet in floor plate-precursors. Zoals in deze afbeeldingen wordt aangetoond, brengen bijna alle cellen de floor plate-precursor celmarkers nestin en fox A2 tot expressie en meer dan 90% van de cellen brengen Corin, OTX2 en LMX1A tot expressie. Na verdere differentiatie specialiseren de floor plate-precursorcellen zich tot dopaminerge neuronen die TUJ1 en TH tot expressie brengen. Deze dopaminerge neuronen hebben een A9-identiteit, aangezien ze Girk2 tot expressie brengen en negatief zijn voor calbindine. Immunokleuringsexperimenten tonen daarnaast aan dat er geen GFAP-astrocyten en zeer weinig GABAerge neuronen aanwezig zijn, wat aangeeft dat de differentiatie exclusief specifiek is voor de dopaminerge neuronale lijn.Tijdens het testen van deze procedure is het belangrijk om consistentie te behouden in de dagelijkse celkweek en ervoor te zorgen dat het medium vers is bereid met de juiste ingrediënten.

directed-dopaminergic-neuron-differentiation-from-human-pluripotent

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

We hebben een protocol voor de inductie van neuroblasts rechtstreeks van pluripotente menselijke embryonale stamcellen gehouden onder bepaalde voorwaarden met kleine moleculen, die afleiding van een groot aanbod van menselijke neurale voorouders en neuronale celtypes in het ontwikkelen van CNS voor neurale reparatie mogelijk maakt.

Efficiënte Afleiding van de Mens Neuronale voorouders en neuronen van pluripotente menselijke embryonale stamcellen met op kleine moleculen Inductie

Protocollen voor neuronale differentiatie van pluripotente menselijke stamcellen (hPSCs) vaak tijdrovend en vereisen grote celkweek vaardigheden. Hier hebben we een kleine molecule aangepast gebaseerde differentiatie procedure een multititre plaat formaat, zodat eenvoudige, snelle en efficiënte productie van humane neuronen in een gecontroleerde manier.

Snelle en efficiënte generatie van de neuronen van menselijke pluripotente stamcellen in een Multititre Plate Format

This video demonstrates the generation of neural progenitor cells from non-transgenic and transgenic human pluripotent stem cells (hPSCs). hPSCs are differentiated into neural progenitor cells using a neuronal differentiation medium. While differentiation is induced in non-transgenic cells using small molecules, the transgenic hPSCs are differentiated by adding an antibiotic that induces the promoter for a neuronal differentiation-specific transcription factor.

Differentiating Non-Transgenic and Transgenic Human Pluripotent Stem Cells into Neural Progenitor Cells

This video demonstrates the process of inducing human pluripotent stem cells to differentiate into neurons by transfecting them with engineered lentiviruses carrying a neurogenic transcription factor gene under the control of  tetracycline-responsive element, followed by treatment with a tetracycline derivative and maturation medium.

Human Pluripotent Stem Cell Differentiation in Neurons Using Engineered Lentiviruses

This video demonstrates the differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) into dopaminergic neurons, to provide a model for studying Parkinson's disease. The hESCs are cultured in a neural induction medium in a microwell plate to form 3D neurospheres. These are then cultured in a neural induction medium to promote the differentiation into dopaminergic progenitor neurons. The final maturation of the neurons occurs in a culture insert under air-liquid interface conditions, resulting in 3D...

Generation of Dopaminergic Neuronal Organoids from Human Embryonic Stem Cells

Deze procedure levert telencephalic neuronen door door checkpoints die vergelijkbaar zijn met die waargenomen in menselijke ontwikkeling. De cellen mogen spontaan differentiëren blootgesteld aan risicofactoren te duwen naar de neurale stam, geïsoleerd en uitgeplaat op dekglaasjes om voor terminale differentiatie en maturatie.

De Specificatie van Telencephalic glutamaat neuronen van menselijke pluripotente stamcellen

We wijzigen en implementeren van een eerder gepubliceerd protocol beschrijft de snelle, reproduceerbare en efficiënte differentiatie van humane geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSCs) in prikkelende corticale neuronen 12. Specifiek onze modificatie maakt regeling van neuronale celdichtheid en gebruik op micro-electrode arrays elektrofysiologische eigenschappen op netwerkniveau meten.

Rapid neuronale differentiatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen voor het meten van het netwerk activiteit op micro-electrode arrays

Het protocol presenteert de herprogrammering van perifere bloed mononucleaire cellen voor het opwekken van neurale stamcellen door Sendai virus infectie, differentiatie van iNSCs in Dopaminerge neuronen, transplantatie van de voorlopers van de DA in de eenzijdig-lesioned De ziekte van Parkinson, en de evaluatie van de veiligheid en werkzaamheid van de in de SC afgeleide DA-precursoren voor PD-behandeling.

Generatie van geïnduceerde neurale stamcellen uit perifere mononucleaire cellen en differentiatie naar precursoren voor Dopaminerge neuron voor transplantatie studies

Hier gepresenteerd is een protocol voor het genereren van een eencellige cultuur van menselijke embryonale stamcellen en hun daaropvolgende differentiatie in neurale voorlopercellen. Het protocol is eenvoudig, robuust, schaalbaar en geschikt voor geneesmiddelen screening en toepassingen voor regeneratieve geneeskunde.

Efficiënte Neurale differentiatie met behulp van eencellige cultuur van menselijke embryonale stamcellen

In dit protocol beschrijven we een stabiele, zeer efficiënte differentiatiestrategie voor het genereren van postganglionische sympathische neuronen uit menselijke pluripotente stamcellen. Dit model zal neuronen beschikbaar stellen voor het gebruik van studies van meerdere autonome aandoeningen.

Efficiënte differentiatie van postganglionic Sympathische neuronen met behulp van menselijke pluripotente stamcellen onder Feeder-vrije en chemisch gedefinieerde cultuurvoorwaarden

We tonen de automatisering van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcelculturen (hiPSC) culturen en neuronale differentiaties die compatibel zijn met geautomatiseerde beeldvorming en analyse.

Geautomatiseerde productie van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide corticale en dopaminerge neuronen met geïntegreerde live-cel monitoring

Leer een geoptimaliseerd protocol voor de differentiatie van A9 middenhersen-dopaminerge neuronen uit menselijke pluripotente stamcellen. Deze methode biedt een efficiënte tool voor het modelleren van de ziekte van Parkinson.

Geregisseerd Dopaminerge Neuron Differentiatie van menselijke pluripotente stamcellen

Meer video's verkennen