Silenciamiento de genes con morfolinos

Gene Silencing with Morpholinos

JoVE Science Education
Developmental Biology

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Gene Silencing with Morpholinos

2.1: An Introduction to Developmental Genetics

2.3: Genetic Engineering of Model Organisms

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08:47 min

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April 30, 2023

Overview

Silenciamiento génico mediado morfolino es una técnica común utilizada para el estudio de funciones de genes específicos durante el desarrollo. Morfolinos inhiben la expresión genética por cruzamiento por hibridación a mRNAs complementarios. Debido a su química única, morfolinos son fáciles de producir y almacenar, lo que les hace muy rentable en comparación con otros métodos de silenciamiento del gen.

Este video comentarios sobre el diseño experimental apropiado al usar estos oligonucleótidos. Después de que una explicación de las técnicas de microinyección de morfolino en pez cebra y el análisis de los fenotipos resultantes serán discutidos. Finalmente, muestran ejemplos de aplicaciones donde se utiliza tecnología de morfolino modelo trastornos del desarrollo o estudio de regeneración de los tejidos.

Procedure

Técnicas de silenciamiento de genes se utilizan comúnmente en el campo de la biología del desarrollo. Morfolino-precipitación enfoques habitualmente permiten a los investigadores identificar y caracterizar genes implicados en procesos celulares importantes. Morfolinos antisentidos son ahora muy populares en muchos sistemas de modelo, incluyendo ratones, pollos y peces cebra, debido a su alta eficacia, alta especificidad y bajo costo.

Este video le proporcionará una visión general de morfolino mecanismos y estrategias de la microinyección, controles experimentales fundamentales y cómo morfolinos se utilizan en los laboratorios de hoy en día para investigar el desarrollo de vertebrados.

Morfolinos primero fueron desarrollados como una forma de inhibir la traducción de los transcritos de RNA en las células vivas y organismos. En general, morfolinos son moléculas sintéticas de 25 oligonucleótidos conectados por una red neutral cargada.

Pero aunque morfolinos pueden parecerse mucho a DNA, que contienen anillos de morfolina en lugar de los grupos de azúcar encontrados la columna vertebral de azúcar fosfato. Esta conversión simple aumenta morfolino estabilidad en las células y reduce su costo de producción.

Dentro de las células, morfolinos están dirigidas al RNA de interés por la vinculación de base complementaria. La ubicación en el RNA donde se hibridiza el morfolino determina su mecanismo específico de acción.

Bloqueo de empalme morfolinos unen a uniones específicas e inhiben la transcripción correcta de procesamiento, mientras que traducción de bloqueo morfolinos enlazar dentro de lo 5′ región sin traducir del gene de la cerca del sitio de inicio traslacional y prevenir el ensamblaje del ribosoma. Ambos tipos de morfolinos reducen la expresión de proteínas objetivo funcional.

Al planear un experimento usando morfolinos, hay algunas consideraciones importantes a tener en cuenta. Morfolinos pueden utilizarse en varios sistemas de modelo, por lo que es importante seleccionar un modelo que es capaz de abordar la cuestión biológica a la mano.

Morfolinos comercialmente se sintetizan y asistencia de profesionales del diseño está disponible sin costo para los investigadores, pero porque son secuencia-específica, información genética para todos los objetivos específicos morfolino debe locales antes de diseñar.

En el sistema de modelo de pez cebra, hay a menudo dos copias de genes que solo se encuentran en otros vertebrados, debido a un acontecimiento de la duplicación de todo el genoma que se produjo en un antepasado evolutivo del pez cebra. Por lo tanto, la caída de ambos genes del pez cebra puede ser necesario correctamente deficiencias de proteína de modelo en el desarrollo humano.

Diseño de controles experimentales bien es tan importante como diseñar tu destino morfolinos. Puede enlazar cualquier morfolino dado a secuencias específicas en genes diferentes. Es recomendable utilizar independiente, sin traslapo morfolinos complementarios para el mismo gen, con el fin de asegurar que un cambio fenotípico observado es debido a la caída de su gen de interés.

Ahora que hemos abordado diseño experimental morfolino, echemos un vistazo a cómo se introducen morfolinos en pez cebra.

Aquí, describimos morfolino microinyección en pez cebra. Para más información e instrucciones sobre los detalles de microinyección, por favor, referencia la enseñanza de las Ciencias JoVE video titulado “Técnicas de microinyección de pez cebra.”

Morfolinos normalmente se inyectan en embriones de pez cebra entre la etapa una y cuatro celdas, en la yema de huevo o citoplasma de la célula. Conexiones citoplasmáticas entre las células embrionarias permiten rápida difusión y entrega ubicua de morfolinos soluble en agua en el organismo. Morfolinos son estables en las células, ya que el embrión del pez cebra se eleva a 28,5 ° C.

Volúmenes y concentraciones de inyección óptimo deben probarse empíricamente para cada morfolino. Normalmente, se utiliza la dosis más baja a la que hay un fenotipo definido confiable en al menos 50-75% de los embriones inyectados para evitar la mortalidad embrionaria o efectos no deseados fuera del objetivo.

La mayoría morfolino pez cebra fenotipos se identifican en la primera tres días tras la fertilización, y silenciamiento del gen es generalmente eficaz hasta el día cinco. En el caso de bloqueo de empalme morfolinos, RT-PCR puede utilizarse para identificar cantidades relativas de las transcripciones nativas y modificadas. Para bloqueo de traducción morfolinos, niveles de precipitación del gene pueden evaluarse mediante Western blot.

El rápido desarrollo externo y la transparencia de los embriones de pez cebra permite la fácil observación de muchos procesos biológicos tempranos. Fenotipos de morfolino comúnmente pueden ser anotó mediante el análisis de la morfología mediante microscopía brightfield o fluorescencia, así como mediante la evaluación de comportamiento.

Después de que se ha definido el fenotipo morfolino, rescate de RNA puede realizarse para demostrar la especificidad de la blanco. Tras la caída de morfolino del mRNA endógeno, mRNA sintético se inyecta, que codifica la proteína misma, pero no contiene la secuencia de destino morfolino. Si este ARN inyectado es capaz de restablecer el fenotipo tipo silvestre del organismo, entonces podemos concluir que el fenotipo observado morfolino es específicamente por el gene de la blanco consiguiendo derribado.

Ahora que tienes una idea para qué son los morfolinos y experimentos de morfolino cómo controlados se pueden realizar, echemos un vistazo a cómo morfolinos se están aplicando en los laboratorios biológicos hoy.

En biología celular, morfolinos sirven para entender los procesos de desarrollo tempranos. Flujo generado por cilios en vesícula de Kupffer es un ejemplo que controla patrones de izquierda a derecha en el pez cebra. Flujo corre hacia la izquierda en embriones de control inyectado, mientras que el silenciamiento de un gen que regula la organización de células ciliadas interrumpe la dirección y velocidad del fluido.

Morfolinos también son muy adecuados para la rápida y confiable modelo de enfermedades genéticas humanas. Fenotipos de pérdida de función se pueden reproducir fácilmente mediante la manipulación de la expresión de la proteína, como se ve en un modelo de pez cebra de displasia humano mostrando quistes renales, edema pericárdico y una cola encrespada. Además, las mutaciones patógenas pueden rápidamente ensayarse en vivo mediante el uso de tipo salvaje o mutante mRNA para rescatar morfolino fenotipos de la enfermedad.

Desde morfolinos pueden introducirse en las células vivas de diferentes maneras, son valoradas en el estudio de desarrollo y la regeneración de órganos. Microinyección, seguido por el estímulo eléctrico de morfolinos en tejidos específicos ha permitido a los investigadores a estudiar el crecimiento de la aleta y formación de la retina de pez cebra adulto.

Sólo ha visto introducción de Zeus al silenciamiento génico con morfolinos. En este video, hemos discutido la estructura y mecanismo de morfolinos, aplicaciones comunes para el uso y maneras importantes para evaluar la eficacia y los efectos de silenciamiento de genes específicos. Porque son de fáciles diseño, morfolinos altamente específicas y rentables, serán siendo un jugador importante en el campo de la genética reversa, ayudando a analizar funcionalmente genes implicados en la enfermedad y el desarrollo. ¡Gracias por ver!

Transcript

Gene silencing techniques are commonly used in the field of developmental biology. Morpholino-based knockdown approaches routinely allow researchers to both identify and characterize genes involved in important cellular processes. Antisense morpholinos are now widely popular in many model systems, including mice, chicks, and zebrafish, due to their high efficacy, high specificity, and low cost.

This video will provide an overview of morpholino mechanisms and microinjection strategies, key experimental controls, and how morpholinos are being used in labs today to investigate vertebrate development.

Morpholinos were first developed as a way to inhibit the translation of RNA transcripts in living cells and organisms. Generally, morpholinos are synthetic molecules made up of 25 oligonucleotides connected by a neutrally charged backbone.

But although morpholinos may look a lot like DNA, they contain morpholine rings in place of the sugar groups found in phosphate sugar backbone. This simple conversion increases morpholino stability in cells, and lowers their cost of production.

Inside cells, morpholinos are targeted to the RNA of interest by complementary base pairing. The location on the RNA where the morpholino hybridizes determines its specific mechanism of action.

Splice-blocking morpholinos bind to specific junctions and inhibit proper transcript processing, whereas translation-blocking morpholinos bind within the 5′ untranslated region of the gene near the translational start site and prevent ribosome assembly. Both types of morpholinos reduce expression of functional target proteins.

When planning an experiment using morpholinos, there are a few important considerations to keep in mind. Morpholinos can be used in several model systems, so it is important to select a model that is able to address the biological question at hand.

Morpholinos are commercially synthesized, and professional design assistance is available at no cost to researchers, but because they are sequence-specific, gene information for all specific morpholino targets should be sourced prior to design.

In the zebrafish model system, there are often two copies of single genes found in other vertebrates, due to a whole-genome duplication event that occurred in an evolutionary ancestor of the zebrafish. Therefore, knockdown of both zebrafish genes may be necessary to successfully model protein deficiencies in human development.

Designing good experimental controls is just as important as designing your targeted morpholinos. Any given morpholino can bind to specific sequences on different genes. It is advisable to use independent, non-overlapping morpholinos complementary to the same gene, in order to ensure that an observed phenotypic change is due to knockdown of your gene of interest.

Now that we’ve addressed morpholino experimental design, let’s have a look at how morpholinos are introduced into zebrafish.

Here, we will describe morpholino microinjection into zebrafish. For more insight and instruction on the details of microinjection, please reference the JoVE Science Education video entitled “Zebrafish Microinjection Techniques.”

Morpholinos are typically injected into zebrafish embryos between the one- and four-cell stage, into the yolk or cell cytoplasm. Cytoplasmic connections between embryonic cells allow for rapid diffusion and ubiquitous delivery of water-soluble morpholinos throughout the organism. Morpholinos are stable in cells, since the zebrafish embryo is raised at 28.5°C.

Optimum injection concentrations and volumes must be empirically tested for each morpholino. Typically, the lowest dose at which there is a defined reliable phenotype in at least 50-75% of injected embryos is used in order to avoid embryonic lethality or unwanted off-target effects.

Most morpholino zebrafish phenotypes are identified in the first three days post-fertilization, and gene silencing is generally effective through day five. In the case of splice-blocking morpholinos, RT-PCR can be used to identify relative amounts of native and altered transcripts. For translation-blocking morpholinos, levels of gene knockdown may be assessed by Western blot.

The rapid external development and transparency of zebrafish embryos allows for easy observation of many early biological processes. Morpholino phenotypes can commonly be scored by analyzing morphology using brightfield or fluorescence microscopy, as well as by assessing behavior.

After the morpholino phenotype has been defined, RNA rescue can be performed to demonstrate target specificity. Following morpholino knockdown of the endogenous mRNA, synthetic mRNA is injected, which encodes the same protein, but does not contain the morpholino target sequence. If this injected RNA is able to restore the wild-type phenotype of the organism, then we can conclude that the observed morpholino phenotype is specifically due to the target gene getting knocked down.

Now that you have a feel for what morpholinos are and how controlled morpholino experiments can be performed, let’s look at how morpholinos are being applied in biological labs today.

In cell biology, morpholinos are used to understand early developmental processes. Cilia-generated fluid flow in Kupffer’s vesicle is one example, which controls left-right patterning in zebrafish. Fluid flow runs counterclockwise in control-injected embryos, whereas silencing of a gene that regulates ciliated cell organization disrupts fluid speed and direction.

Morpholinos are also very suited to quickly and reliably model human genetic diseases. Loss-of-function phenotypes can be easily reproduced by manipulating protein expression, as seen in a zebrafish model of human dysplasia displaying kidney cysts, pericardial edema, and a curled tail. Additionally, pathogenic mutations can be rapidly assayed in vivo by using wild-type or mutant mRNA to rescue morpholino disease phenotypes.

Since morpholinos can be introduced into living cells in different ways, they are highly valued in studying organ regeneration and development. Microinjection followed by electrical stimulation of morpholinos into specific tissues has allowed researchers to study fin growth and retina formation in adult zebrafish.

You’ve just watched JoVE’s introduction to gene silencing with morpholinos. In this video, we’ve discussed the structure and mechanism of morpholinos, common applications for use, and important ways to assess efficacy and effects of targeted gene silencing. Because they are easy to design, highly specific, and cost-effective, morpholinos will remain a significant player in the field of reverse genetics, helping to functionally analyze genes involved in disease and development. Thanks for watching!

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