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Developmental Biology

Ingeniería genética de organismos modelo

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JoVE Science Education Developmental Biology

Genetic Engineering of Model Organisms

2.2: Gene Silencing with Morpholinos

2.4: An Introduction to Molecular Developmental Biology

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09:36 min

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April 30, 2023

Overview

Transgénesis, o el uso de la ingeniería genética para alterar la expresión génica, es ampliamente utilizado en el campo de la biología del desarrollo. Los científicos utilizan un número de métodos para alterar la función de genes para entender su papel en procesos de desarrollo. Esto incluye la sustitución de un gen con una copia no funcional, o agregar una etiqueta visualizable a un gen que permite a la proteína de fusión resultante realizar un seguimiento a lo largo del desarrollo.

En este video, los espectadores conocerán los principios detrás de transgénesis, así como los pasos básicos para introducir las construcciones genéticas de un animal y dirigidos a genes de interés. Esto es seguido por la discusión de un protocolo para crear ratones knockout. Por último, se revisarán algunas aplicaciones específicas de las tecnologías transgénicas en el campo de la biología del desarrollo.

Procedure

La ingeniería genética es una herramienta valiosa para modificar genomas de organismos modelo en un proceso conocido como transgénesis. En Biología del desarrollo, este enfoque se utiliza a menudo para expresar genes modificados que pueden visualizarse en los tejidos vivos. Como alternativa, la ingeniería genética puede utilizarse para impedir o interrumpir la expresión de la proteína para estudiar la función de genes específicos de desarrollo.

Este video se resumen los principios detrás de esta tecnología, revisar algunos procedimientos de ingeniería genética y maneras de resaltar que estas técnicas se utilizan en el laboratorio.

Para empezar, vamos a explorar algunos conceptos importantes subyacentes transgénesis. Esto implica la inserción de ADN en el genoma de un organismo modelo. Hay una serie de enfoques según el objetivo del estudio.

En primer lugar, además de un gene alterado pueden revelar cambios funcionales o morfológicos debido a una mutación. Otro método es poner en copias adicionales del gen de tipo salvaje inalterado para estudiar los efectos de la sobreexpresión, que a menudo puede ser igual de dañino como una mutación. Un enfoque diferente es introducir una proteína de fusión que contiene una etiqueta visualizable, como la proteína verde fluorescente, para rastrear el lugar y el momento de la expresión génica en animales vivos.

El segmento de ADN que se inserta en el genoma debe ser cuidadosamente diseñado para producir los patrones de expresión deseada y los resultados. El promotor, que es un elemento de la secuencia que dicta cuándo y dónde se expresa un gen, es un componente crucial. Algunos promotores ubicuo se expresan a lo largo de casi todos los tejidos, mientras que otros son sólo activos en tejidos específicos. Promotores inducibles, que son activados por la administración de química o exposición a altas temperaturas, pueden utilizarse también para controlar el tiempo de la expresión génica.

Para ser estable expresado en tejidos, un transgen primero debe integrarse en el genoma. Para lograr esto, los transgenes pueden incluir que flanquean las secuencias de ADN que coinciden con las zonas del genoma del organismo. Esto permite que el transgén a integrar con el anfitrión DNA a través de un proceso conocido como recombinación homóloga. Alternativamente, en algunas especies, elementos especiales llamados transposones pueden hacer que el transgénesis más eficientes incluyendo sitios de reconocimiento para la enzima transposasa, que cataliza la inserción al azar del transgen en el genoma.

Ahora que conoces algunos de los fundamentos de diseño de transgen, vamos a revisar cómo hacer un animal transgénico. Para hacer el transgén construir, comience por amplificar el gen de interés mediante PCR. Esta región amplificada luego se clona en un vector, que es un pedazo de ADN que puede llevar el transgén en las células. Vectores típicamente contienen elementos que permiten la amplificación eficiente del transgen mediante bacterias como e. coli. Después de este paso de amplificación, el vector es purificado de la cultura bacteriana.

Animales transgénicos se realizan mediante la inyección de DNA purificado en embriones. En los peces y las ranas, las construcciones generalmente se inyecta directamente en la yema de huevo o citoplasma de embriones en estadío de una célula. Por transgénesis mediada por transposones, una transcripción que codifican la enzima transposasa se agrega a la mezcla de inyección.

En ratones, es posible transgénesis por manipulación de huevos recién fertilizados en que los pronúcleos del espermatozoide y el óvulo todavía no han fundido. La construcción se inyecta directamente en el pronucleo más grande, donde puede integrarse en el genoma como la célula se divide. Los huevos deben trasplantarse luego en el útero de una hembra seudopreñada para el desarrollo.

Eficiencia de la transgénesis varía, por lo animales deben ser examinados para identificar en que la construcción ha integrado con éxito en el genoma de la progenie. Esto puede hacerse buscando una etiqueta fluorescente que fue insertada para facilitar la identificación, o a través de análisis moleculares como la PCR de DNA genómica aislado de pedazos pequeños de tejido.

Un segundo enfoque de la ingeniería genética se centra en gen específico dirigido a para interrumpir la función génica. Existen múltiples enfoques para lograr este objetivo. Un método relativamente nuevo, conocido como la edición del genoma, aprovecha de secuencia específico enzimas llamadas nucleasas, que corta la espina dorsal de la DNA y causan mutaciones en los genes, el ADN se repara.

Otro método de segmentación consiste en el uso de la recombinación homóloga para reemplazar un gen con ADN extraño o bien o una copia del gen flanqueado por secuencias de reconocimiento para las enzimas conocidas como recombinasas. Cuando las recombinasas están presentes, la secuencia flanqueada será suprimida desde el genoma. Esto se conoce como un condicional knockout, y control de la supresión del gen se logra expresar la enzima en tejidos específicos o en ciertos puntos del tiempo.

Vamos a revisar un procedimiento general para la generación de ratones knockout por recombinación homóloga. Aquí, una construcción debe ser preparada en que parte del ADN genómico secuencia se sustituye por ADN extraño. Este ADN codifica a menudo otro gen, como para la resistencia a los antibióticos, que proporciona una manera para seleccionar exitosamente modificado células en pasos posteriores.

Para comenzar el procedimiento, las células madre embrionarias son recogidas de la masa celular interna de un embrión temprano de ratón conocido como blastocisto. La construcción lineal entonces se entrega a las células a través de electroporación, en la que impulsos eléctricos generan poros transitorios en la membrana celular. Las células entonces se permiten incubar en presencia de un antibiótico para eliminar las células sin el transgen.

Después de este paso de selección, se puede inyectar las células madre en otro embrión de ratón en la fase de blastocisto. Los embriones se transfieren al útero de un ratón hembra para continuar con el desarrollo. Las crías resultantes serán quimeras, que se componen de células de tipo salvaje y golpe de gracia. Algunas quimeras tendrá células de octavos de final dentro de su línea germinal, que transmitirá el gen interrumpido cuando se crían, que luego se establecerá una nueva línea de octavos de final.

Han aprendido los conceptos básicos de genética de la ingeniería de modelos de desarrollo, así que ahora vamos a ven algunas aplicaciones prácticas.

Estudios del desarrollo suelen ser proteínas fluorescente etiquetas para identificar las células y estudiar su desarrollo. Uso de promotores específicos de tejido, organismos transgénicos pueden diseñarse a proteínas fluorescentes expresa en células específicas, como la cresta neural. Utilizando técnicas de imagen avanzadas, las células fluorescentes pueden ser reflejadas en tiempo real, permitiendo a los investigadores visualizar directamente eventos de desarrollo complejo.

Otro uso importante de la ingeniería genética es el estudio de genes específicos y su papel en fenotipos de la enfermedad. Aquí, se introducen mutaciones específicas en un gen de ratón específicos con nucleasas, como TALENs. PCR se muestra si el ratón tiene cero, una o dos copias del gen mutado. Los embriones que llevan dos copias mutantes ahora pueden ser estudiados en detalle para determinar la función del desarrollo del gen.

Usando el condicionales nocauts, los científicos pueden determinar la función de un gen dentro de un conjunto restringido de las células. Aquí, un gen flanqueado loxP se expresó en todo el embrión entero, pero Cre fue expresado en las células endoteliales, causando una canceladura del gene en el corazón y los vasos sanguíneos. Este tejido-específica resultó en un cambio mensurable en la frecuencia cardíaca embrionaria y muestra cómo poner a prueba la función localizada de un gen sin alterar todo el organismo.

Sólo ha visto la introducción de Zeus a la tecnología transgénica. Estas técnicas le ayudarán a entender los conceptos básicos de la ingeniería genética, algunos de los métodos que intervienen, y cómo se aplica en ciencia cotidiana. Ingeniería genética pueden aplicarse extensamente a través de muchos organismos y seguirá siendo una herramienta importante para estudiar y entender el papel de la genética en enfermedades del desarrollo, así como los que aparecen durante la edad adulta. ¡Gracias por ver!

Transcript

Genetic engineering is a valuable tool used to modify genomes of model organisms in a process known as transgenesis. In developmental biology, this approach is often used to express modified genes that can be visualized in living tissues. Alternatively, genetic engineering can be used to prevent or disrupt protein expression to study the developmental function of specific genes.

This video will summarize the principles behind this technology, review some genetic engineering procedures, and highlight ways that these techniques are used in the lab.

To begin, let’s explore some important concepts underlying transgenesis. This involves insertion of DNA into the genome of a model organism. There are a number of approaches depending on the study goal.

First, addition of an altered gene might reveal functional or morphological changes due to a mutation. Another method is to put in additional copies of the unaltered wild-type gene to study the effects of overexpression, which can often be just as damaging as a mutation. A different approach is to insert a fusion protein that contains a visualizable tag, such as green fluorescent protein, to track the location and timing of gene expression in live animals.

The segment of DNA that will be inserted into the genome must be carefully designed to produce the desired expression patterns and outcomes. The promoter, which is a sequence element that dictates when and where a gene is expressed, is a crucial component. Certain promoters are ubiquitously expressed throughout almost all tissues, while others are only active in specific tissues. Inducible promoters, which are activated by chemical administration or exposure to high temperatures, can also be used to control timing of gene expression.

To be stably expressed in tissues, a transgene must first integrate into the genome. To accomplish this, transgenes can include flanking DNA sequences that match areas of the organism’s genome. This allows the transgene to integrate with the host DNA through a process known as homologous recombination. Alternatively, in some species special elements called transposons can make transgenesis more efficient by including recognition sites for the enzyme transposase, which catalyzes random insertion of the transgene into the genome.

Now that you know some of the basics of transgene design, let’s review how to make a transgenic animal. To make the transgene construct, start by amplifying the gene of interest using PCR. This amplified region is then cloned into a vector, which is a piece of DNA that can carry the transgene into cells. Vectors typically contain elements that allow efficient transgene amplification using bacteria, such as E. coli. After this amplification step, the vector is purified from the bacterial culture.

Transgenic animals are made by injecting purified DNA into embryos. In fish and frogs, constructs are usually injected directly into the yolk or cytoplasm of one-cell stage embryos. For transposon-mediated transgenesis, a transcript encoding the transposase enzyme is added to the injection mix.

In mice, transgenesis can be accomplished by manipulation of newly fertilized eggs in which the sperm and egg pronuclei have not yet fused. The construct is injected directly into the larger pronucleus, where it may integrate into the genome as the cell divides. The eggs must then be transplanted into the uterus of a pseudopregnant female for development.

Transgenesis efficiency varies, so animals must be screened to identify progeny in which the construct has successfully integrated into the genome. This can be done by looking for a fluorescent tag that was inserted for easy identification, or through molecular analyses such as PCR of genomic DNA isolated from small tissue pieces.

A second approach to genetic engineering focuses on specific gene targeting to disrupt gene function. There are multiple approaches to achieve this goal. One relatively new method, known as genome editing, takes advantage of sequence-specific enzymes called nucleases, which cut the DNA backbone and cause mutations in genes as the DNA is repaired.

Another targeting method involves the use of homologous recombination to replace a gene with either foreign DNA or a copy of the gene flanked by recognition sequences for enzymes known as recombinases. When the recombinases are present, the flanked sequence will be excised from the genome. This is known as a conditional knockout, and control of gene excision can be achieved by expressing the enzyme in specific tissues or at certain time points.

Let’s review a general procedure for generating knockout mice by homologous recombination. Here, a construct must be prepared in which part of the genomic DNA sequence is replaced with foreign DNA. This DNA often encodes another gene, such as for antibiotic resistance, which provides a way to select successfully modified cells in later steps.

To begin the procedure, embryonic stem cells are collected from the inner cell mass of an early mouse embryo known as a blastocyst. The linearized construct is then delivered into the stem cells via electroporation, in which electrical pulses generate transient pores in the cell membrane. The cells are then allowed to incubate in the presence of an antibiotic to eliminate cells without the transgene.

After this selection step, the stem cells can be injected into another mouse embryo at the blastocyst stage. The embryos are then transferred to the uterus of a female mouse to continue development. The resulting pups will be chimeras, which are composed of both wild-type and knockout cells. Some chimeras will have knockout cells within their germline, which will transmit the disrupted gene when they are bred, which will then establish a new knockout line.

You have learned the basics of genetic engineering of developmental models, so now let’s look at some practical applications.

Developmental studies often use fluorescently tagged proteins to identify cells and study their development. Using tissue-specific promoters, transgenic organisms can be engineered to express fluorescent proteins in specific cells, like the neural crest. Using advanced imaging techniques, the fluorescent cells can be imaged in real time, allowing researchers to directly visualize complex developmental events.

Another important use of genetic engineering is to study specific genes and their role in disease phenotypes. Here, targeted mutations are introduced into a specific mouse gene using nucleases, such as TALENs. PCR shows whether the mouse has zero, one, or two copies of the gene mutated. The embryos carrying two mutant copies can now be studied in detail to determine the developmental function of the gene.

Using conditional knockouts, scientists can determine the function of a gene within a restricted set of cells. Here, a loxP-flanked gene was expressed throughout the entire embryo, but Cre was expressed in endothelial cells only, causing a gene deletion in the heart and blood vessels. This tissue-specific knockout resulted in a measureable change in embryonic heart rate, and illustrates how to test the localized role of a gene without changing the entire organism.

You’ve just watched JoVE’s introduction to transgenic technology. These techniques help you understand the basics of genetic engineering, some of the methods that are involved, and how it is applied in everyday science. Genetic engineering can be widely applied across many organisms, and will continue to be an important tool for studying and understanding the role of genetics in developmental diseases, as well as those that appear during adulthood. Thanks for watching!

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