2.3: Ingeniería genética de organismos modelo

La ingeniería genética es una herramienta valiosa que se utiliza para modificar los genomas de organismos modelo en un proceso conocido como transgénesis. En biología del desarrollo, este enfoque se utiliza a menudo para expresar genes modificados que se pueden visualizar en tejidos vivos. Alternativamente, la ingeniería genética se puede utilizar para prevenir o interrumpir la expresión de proteínas para estudiar la función de desarrollo de genes específicos.

Este video resumirá los principios detrás de esta tecnología, revisará algunos procedimientos de ingeniería genética y destacará las formas en que estas técnicas se utilizan en el laboratorio.

Para comenzar, exploremos algunos conceptos importantes que subyacen a la transgénesis. Esto implica la inserción de ADN en el genoma de un organismo modelo. Hay una serie de enfoques dependiendo del objetivo del estudio.

En primer lugar, la adición de un gen alterado podría revelar cambios funcionales o morfológicos debidos a una mutación. Otro método es colocar copias adicionales del gen de tipo salvaje inalterado para estudiar los efectos de la sobreexpresión, que a menudo puede ser tan dañina como una mutación. Un enfoque diferente es insertar una proteína de fusión que contenga una etiqueta visualizable, como la proteína fluorescente verde, para rastrear la ubicación y el momento de la expresión génica en animales vivos.

El segmento de ADN que se insertará en el genoma debe diseñarse cuidadosamente para producir los patrones de expresión y los resultados deseados. El promotor, que es un elemento de la secuencia que dicta cuándo y dónde se expresa un gen, es un componente crucial. Ciertos promotores se expresan de forma ubicua en casi todos los tejidos, mientras que otros solo son activos en tejidos específicos. Los promotores inducibles, que se activan por la administración de productos químicos o la exposición a altas temperaturas, también se pueden utilizar para controlar el momento de la expresión génica.

Para expresarse de manera estable en los tejidos, un transgén debe integrarse primero en el genoma. Para lograr esto, los transgenes pueden incluir secuencias de ADN flanqueantes que coincidan con áreas del genoma del organismo. Esto permite que el transgén se integre con el ADN del huésped a través de un proceso conocido como recombinación homóloga. Alternativamente, en algunas especies, los elementos especiales llamados transposones pueden hacer que la transgénesis sea más eficiente al incluir sitios de reconocimiento para la enzima transposasa, que cataliza la inserción aleatoria del transgén en el genoma.

Ahora que conoces algunos de los conceptos básicos del diseño transgénico, repasemos cómo hacer un animal transgénico. Para crear la construcción del transgén, comience por amplificar el gen de interés mediante PCR. Esta región amplificada se clona en un vector, que es una pieza de ADN que puede transportar el transgén a las células. Los vectores suelen contener elementos que permiten la amplificación eficiente de transgenes mediante bacterias, como E. coli. Después de este paso de amplificación, el vector se purifica a partir del cultivo bacteriano.

Los animales transgénicos se fabrican inyectando ADN purificado en embriones. En peces y ranas, las construcciones generalmente se inyectan directamente en la yema o el citoplasma de los embriones en etapa de una célula. Para la transgénesis mediada por transposones, se añade a la mezcla de inyección una transcripción que codifica la enzima transposasa.

En ratones, la transgénesis puede lograrse mediante la manipulación de óvulos recién fertilizados en los que los pronúcleos de espermatozoides y óvulos aún no se han fusionado. El constructo se inyecta directamente en el pronúcleo más grande, donde puede integrarse en el genoma a medida que la célula se divide. Luego, los óvulos deben trasplantarse al útero de una hembra pseudoembarazada para su desarrollo.

La eficiencia de la transgénesis varía, por lo que los animales deben ser examinados para identificar la progenie en la que el constructo se ha integrado con éxito en el genoma. Esto se puede hacer buscando una etiqueta fluorescente que se insertó para una fácil identificación, o a través de análisis moleculares como la PCR de ADN genómico aislado de pequeñas piezas de tejido.

Un segundo enfoque de la ingeniería genética se centra en la selección de genes específicos para interrumpir la función de los genes. Existen múltiples enfoques para lograr este objetivo. Un método relativamente nuevo, conocido como edición del genoma, aprovecha las enzimas específicas de la secuencia llamadas nucleasas, que cortan la columna vertebral del ADN y causan mutaciones en los genes a medida que se repara el ADN.

Otro método de focalización implica el uso de la recombinación homóloga para reemplazar un gen con ADN extraño o una copia del gen flanqueada por secuencias de reconocimiento de enzimas conocidas como recombinasas. Cuando las recombinasas están presentes, la secuencia flanqueada se extirpará del genoma. Esto se conoce como knockout condicional, y el control de la escisión génica se puede lograr mediante la expresión de la enzima en tejidos específicos o en ciertos puntos de tiempo.

Repasemos un procedimiento general para generar ratones knockout por recombinación homóloga. Aquí, se debe preparar un constructo en el que parte de la secuencia de ADN genómico se reemplaza con ADN extraño. Este ADN a menudo codifica otro gen, como el de la resistencia a los antibióticos, que proporciona una forma de seleccionar células modificadas con éxito en pasos posteriores.

Para comenzar el procedimiento, las células madre embrionarias se recolectan de la masa celular interna de un embrión de ratón temprano conocido como blastocisto. A continuación, la construcción linealizada se introduce en las células madre mediante electroporación, en la que los pulsos eléctricos generan poros transitorios en la membrana celular. A continuación, se permite que las células se incuben en presencia de un antibiótico para eliminar las células sin el transgén.

Después de este paso de selección, las células madre se pueden inyectar en otro embrión de ratón en la etapa de blastocisto. Luego, los embriones se transfieren al útero de un ratón hembra para continuar su desarrollo. Las crías resultantes serán quimeras, que se componen de células de tipo salvaje y noqueadas. Algunas quimeras tendrán células knockout dentro de su línea germinal, que transmitirán el gen interrumpido cuando se reproduzcan, lo que luego establecerá una nueva línea knockout.

Has aprendido los conceptos básicos de la ingeniería genética de los modelos de desarrollo, así que ahora veamos algunas aplicaciones prácticas.

Los estudios de desarrollo a menudo utilizan proteínas marcadas con fluorescencia para identificar células y estudiar su desarrollo. Mediante el uso de promotores específicos de tejidos, los organismos transgénicos pueden diseñarse para expresar proteínas fluorescentes en células específicas, como la cresta neural. Mediante el uso de técnicas de imagen avanzadas, las células fluorescentes se pueden visualizar en tiempo real, lo que permite a los investigadores visualizar directamente eventos complejos de desarrollo.

Otro uso importante de la ingeniería genética es el estudio de genes específicos y su papel en los fenotipos de enfermedades. Aquí, las mutaciones dirigidas se introducen en un gen específico del ratón utilizando nucleasas, como los TALEN. La PCR muestra si el ratón tiene cero, una o dos copias del gen mutado. Los embriones portadores de dos copias mutantes ahora se pueden estudiar en detalle para determinar la función de desarrollo del gen.

Usando knockouts condicionales, los científicos pueden determinar la función de un gen dentro de un conjunto restringido de células. En este caso, un gen flanqueado por loxP se expresó en todo el embrión, pero Cre solo se expresó en las células endoteliales, lo que provocó una deleción del gen en el corazón y los vasos sanguíneos. Este knockout específico de tejido resultó en un cambio medible en la frecuencia cardíaca embrionaria e ilustra cómo probar el papel localizado de un gen sin cambiar todo el organismo.

Acabas de ver la introducción de JoVE a la tecnología transgénica. Estas técnicas le ayudan a comprender los conceptos básicos de la ingeniería genética, algunos de los métodos que están involucrados y cómo se aplica en la ciencia cotidiana. La ingeniería genética puede aplicarse ampliamente en muchos organismos, y seguirá siendo una herramienta importante para estudiar y comprender el papel de la genética en las enfermedades del desarrollo, así como en las que aparecen durante la edad adulta. ¡Gracias por mirar!