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Developmental Biology

Introducción a la Biología Molecular del desarrollo

An Introduction to Molecular Developmental Biology

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Developmental Biology

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An Introduction to Molecular Developmental Biology

2.3: Genetic Engineering of Model Organisms

2.5: Explant Culture for Developmental Studies

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09:27 min

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April 30, 2023

Overview

Señales moleculares juegan un papel importante en los complejos procesos que ocurren durante el desarrollo embrionario. Estas señales regulan actividades como la diferenciación celular y la migración, que contribuyen a la formación de tipos celulares específicos y estructuras. El uso de aproximaciones moleculares permite a los investigadores investigar estos mecanismos físicos y químicos en detalle.

Este video hará un repaso breve historia del estudio de los eventos moleculares durante el desarrollo. Siguientes, claves preguntas por biólogos moleculares del desarrollo hoy serán revisados, seguida por una discusión de varios prominentes métodos utilizados para responder a estas preguntas, tales como coloración, presentaron la cultura y la proyección de imagen de células vivas. Por último, veremos algunas aplicaciones actuales de estas técnicas al estudio de la biología del desarrollo.

Procedure

Estudios en el campo de la biología molecular del desarrollo proporcionan información acerca de los cambios que ocurren a nivel celular durante la diferenciación y el desarrollo. Los investigadores examinan los mecanismos físicos y químicos que regulan las funciones celulares. Esto ayuda a entender cómo las células dan lugar a tejidos especializados en el embrión maduro, y cómo los defectos a nivel molecular pueden conducir a Estados de enfermedad.

Este video presenta una breve historia de la biología molecular del desarrollo, introduce preguntas claves de los científicos en este campo, describe algunas herramientas disponibles para responder a esas preguntas y discute algunas aplicaciones actuales del laboratorio.

Empecemos por revisar algunos estudios hito en la historia de la investigación de la biología molecular del desarrollo.

En 1957, Conrad Waddington publicó un libro titulado “La estrategia de Genes” en el que trató de explicar cómo se decide el destino de la célula. Basado en estudios de trasplante de tejido previamente realizado, él presentó un modelo conceptual describe que una célula es como una canica rodando por una colina, y la ruta que tarda en llegar a la parte inferior va a determinar su estado final diferenciado. Esta idea de que tipos de células diferentes se derivan de recibir diferentes señales durante el desarrollo de células indiferenciadas se conocía como el “paisaje epigenético”.

Al mismo tiempo, Rita Levi-Montalcini y Stanley Cohen observan que transplantar tumores en embriones de pollo condujo al crecimiento rápido de la neurona. Presume que una sustancia secretada por los tumores causados este crecimiento y que identificaron la proteína como factor de crecimiento nervioso, NGF. Pronto después de eso, Cohen descubrió otro factor de crecimiento que era secretado por la glándula salival ratón y promovieron el crecimiento de las células epiteliales. Él identificó esta proteína como factor de crecimiento epidérmico EGF.

Más tarde, en 1969, Lewis Wolpert propusieron una teoría sobre cómo cierta clase de señalización moléculas, conocidas como morfógenos, actúan directamente sobre las células para inducir respuestas específicas en concentraciones variables. Él utilizó colores de la bandera francesa para Estados de celular modelo, rojos que sirve como el estado por defecto cuando no hay señal. A partir de ahí, morfogen bajas concentraciones, que se muestra en blanco, podrían activar un gen, mientras que concentraciones de morfógeno alto, en azul, podrían activar un gen distinto.

Ampliando este trabajo, en 1988 Christiane Nusslein-Volhard identificó primer morfógeno conocida mediante la realización de pantallas genéticas en las moscas. Ella utiliza anticuerpos para mostrar que una proteína, conocida como Bicoid, forma un gradiente de concentración a lo largo del eje antero-posterior del embrión en desarrollo y controla la expresión de genes importantes para la organización de las regiones cabeza y tórax.

Durante la década de 1990, Peter Lawrence y Ginés Morata utilizan su propio trabajo en moscas para ampliar la teoría de gradientes de morfógeno. Presume que un conjunto de células es responsable de organizar un compartimiento particular del organismo. Medida que avanza el desarrollo, las señales moleculares instruir a esas células para dividir y construir más compartimientos, continuando hasta el organismo entero está formado.

Ahora que hemos repasado algunos aspectos históricos destacados, vamos a examinar algunas cuestiones fundamentales por biólogos del desarrollo actuales.

Para empezar, algunos investigadores se centran en la identificación de las moléculas que regulan el desarrollo. Por ejemplo, podrían estudiar individual o una combinación de, factores de crecimiento demostrados para causar una respuesta celular específica, como la diferenciación o migración.

Otros biólogos del desarrollo investigan cómo estas moléculas regulan el proceso de desarrollo. Podría estudiar cómo la concentración de una señal molecular puede indicar una celda para distinguir o migrar. También pregunte sobre cómo las células se comunican con otras células cercanas y mirar las moléculas que difunden sobre una distancia corta y actúan localmente, conocido como factores paracrinos de señalización.

Por último, algunos biólogos del desarrollo quieren entender acerca de cómo las células responden a señales externas. Pueden estudiar cambios dentro de la célula, tales como aumentos o disminuciones en la expresión de genes particulares, analizando los niveles de sus proteínas codificadas. Otros se centran en cambios externos, tales como alteraciones en el tamaño o forma de la célula.

Ahora que tienes una idea de preguntas claves por biólogos del desarrollo moleculares, echemos un vistazo a algunas de las técnicas que utilizan para encontrar las respuestas a estas preguntas.

La coloración es uno de los enfoques más utilizados para investigar patrones de expresión génica y para identificar las moléculas que regulan el desarrollo.

Inmunohistoquímica es una técnica de tinción que emplea anticuerpos conjugados a los reporteros fluorescentes o química a las proteínas de la etiqueta. Visualización de proteínas por microscopía de fluorescencia ofrece información sobre su localización en las secciones de tejido y también su contribución potencial a las estructuras celulares. Conjunto de montaje en situ el hibridación es una alternativa de tinción, que utiliza oligonucleótidos de ADN o ARN marcados para ver patrones de expresión génica en tejidos tridimensionales.

Explante es otro método utilizado en este campo para estudiar los mecanismos por el cual actúan estímulos externos. En esta técnica, un tejido es removido del sitio natural de crecimiento y crecido en la cultura. Condiciones de crecimiento específicos, tales como el sustrato en las placas de cultivo o factores de crecimiento, añadidos a los medios de cultivo, pueden ser examinadas luego por sus efectos sobre el desarrollo de las células y los tejidos.

En vivo la proyección de imagen de la célula se utiliza para analizar las respuestas de la célula a los estímulos del desarrollo. Cultivos in vitro son idóneos para la captura de movimientos celulares y los patrones de localización en tiempo real. Células manchadas o fluorescencia de etiquetado también pueden ser seguido en vivo usando microscopia Time-lapse.

Con frecuencia, las células de un tejido de interés son trasplantadas de un donante a un organismo huésped y luego monitoreadas durante el curso del desarrollo.

Ahora que usted está familiarizado con algunos métodos generales de laboratorio, vamos a ver algunas aplicaciones de la investigación de la biología molecular del desarrollo.

Un enfoque para determinar los productos de gen específico papel desempeñan en el desarrollo es para alterar su expresión por medios externos. En este experimento, oligonucleótidos antisentido llamados morfolinos fueron inyectados a derribo dos genes del pez cebra importantes para el desarrollo del oído interno apropiado. Immunostaining de proteínas estructurales demostró que los embriones con expresión génica reducida exhiben menos neuronas y células de pelo dentro del oído interno en comparación con los controles.

Otra aplicación de biología molecular del desarrollo es averiguar cuándo y dónde se expresan los genes, para entender mejor cómo funcionen sus proteínas codificadas. Los investigadores de este experimento utilizan fluorescencia etiquetadas sondas de RNA complementario a dos transcripciones de destino para identificar células transcripción de uno o ambos genes de interés.

Algunos científicos utilizan culturas explant para analizar las respuestas de la célula bajo varias condiciones. En este experimento, los investigadores disecaron las neuronas sensoriales del oído interno de los embriones y cultivan durante varias horas. A continuación, las culturas fueron cambiadas a los medios de comunicación que contiene granos de proteína. Time-lapse imágenes confocales tras incubación con los anticuerpos etiquetados revelaron que las proteínas en los granos promovieron el crecimiento de las proyecciones de cuerpos celulares de neuronas.

Sólo ha visto la introducción de Zeus a la biología molecular del desarrollo. En este video, hemos revisado la historia de la investigación de la biología molecular del desarrollo e introducido preguntas claves por biólogos del desarrollo. También exploran estrategias de investigación prominentes y discuten algunas de sus aplicaciones actuales. ¡Como siempre, gracias por ver!

Transcript

Studies in the field of molecular developmental biology provide insight about the changes that occur at the cellular level during differentiation and development. Researchers examine the physical and chemical mechanisms that regulate cell functions. This helps in understanding how cells give rise to specialized tissues within the maturing embryo, and how defects at the molecular level can lead to disease states.

This video presents a brief history of molecular developmental biology, introduces key questions asked by scientists in this field, describes some tools available to answer those questions, and discusses a few current lab applications.

Let’s start by reviewing some landmark studies in the history of molecular developmental biology research.

In 1957, Conrad Waddington published a book entitled “The Strategy of the Genes” in which he tried to explain how cell fate is decided. Based on previously conducted tissue transplantation studies, he presented a conceptual model describing that a cell is like a marble rolling down a hill, and the path it takes to reach the bottom will determine its final differentiated state. This idea that distinct cell types arise from undifferentiated cells receiving different signals during development became known as the “epigenetic landscape.”

Around the same time, Rita Levi-Montalcini and Stanley Cohen observed that transplanting tumors into chick embryos led to rapid neuron growth. They hypothesized that a substance secreted by the tumors caused this growth, and identified the protein as nerve growth factor, or NGF. Soon after that, Cohen discovered another growth factor that was secreted by mouse salivary gland and promoted the growth of epithelial cells. He identified this protein as epidermal growth factor, or EGF.

Later, in 1969, Lewis Wolpert proposed a theory about how a certain class of signaling molecules, known as morphogens, act directly on cells to induce specific responses at varying concentrations. He used colors of the French flag to model cell states, red serving as the default state when no signal is present. From there, low morphogen concentrations, shown in white, might activate one gene, while high morphogen concentrations, shown in blue, might activate a different gene.

Expanding on this work, in 1988 Christiane Nusslein-Volhard identified the first known morphogen by conducting genetic screens on flies. She used antibodies to show that a protein, known as Bicoid, forms a concentration gradient along the anterior-posterior axis of the developing embryo, and controls the expression of genes important for organizing the head and thorax regions.

During the early 1990s, Peter Lawrence and Ginés Morata used their own work in flies to expand the theory of morphogen gradients. They hypothesized that one set of cells is responsible for organizing one particular compartment of the organism. As development proceeds, molecular signals instruct those cells to divide and construct more compartments, continuing until the whole organism is formed.

Now that we have reviewed some historical highlights, let’s examine a few fundamental questions asked by current developmental biologists.

To begin, some researchers focus on identifying the molecules that regulate development. For example, they might study individual, or combinations of, growth factors shown to cause a specific cell response, such as differentiation or migration.

Other developmental biologists investigate how these molecules regulate the developmental process. They might study how the concentration of a molecular signal can instruct a cell to differentiate or migrate. They also ask about how cells communicate with other nearby cells, and look at signaling molecules which diffuse over a short distance and act locally, known as paracrine factors.

Finally, some developmental biologists want to understand about how cells respond to external signals. They may study changes inside the cell itself, such as increases or decreases in the expression of particular genes, by looking at levels of their encoded proteins. Others focus on external changes, such as alterations in cell shape or size.

Now that you have a feel for key questions asked by molecular developmental biologists, let’s look at some of the techniques they use to find answers to these questions.

Staining is one of the most widely used approaches to investigate gene expression patterns, and to identify the molecules that regulate development.

Immunohistochemistry is a staining technique that uses antibodies conjugated to chemical or fluorescent reporters to label proteins. Visualization of proteins by fluorescence microscopy offers insights about their localization in tissue sections, and also their potential contributions to cellular structures. Whole-mount in situ hybridization is an alternative staining method, which uses labeled DNA or RNA oligonucleotides to look at patterns of gene expression in three-dimensional tissues.

Explant culture is another commonly used approach in this field to study the mechanisms by which external stimuli act. In this technique, a tissue is removed from the natural site of growth and grown in culture. Specific growth conditions, such as the substrate on the culture plates or growth factors added to the culture media, can then be examined for their effects on developing cells and tissues.

Live cell imaging is used to analyze cell responses to developmental stimuli. In vitro cultures are well-suited for capturing cell movements and localization patterns in real time. Stained or fluorescently labeled cells can also be tracked in vivo using time-lapse microscopy.

Frequently, cells from a tissue of interest are transplanted from a donor to a host organism, and then monitored over the course of development.

Now that you’re familiar with some general laboratory methods, let’s look at some applications of molecular developmental biology research.

One approach to determining the role specific gene products play in development is to alter their expression by external means. In this experiment, antisense oligonucleotides called morpholinos were injected to knockdown two zebrafish genes important for proper inner ear development. Immunostaining of structural proteins showed that embryos with reduced gene expression exhibit fewer neurons and hair cells within the inner ear compared to the controls.

Another application of molecular developmental biology is to figure out when and where genes are expressed, to better understand how their encoded proteins may function. Researchers in this experiment used fluorescently labeled RNA probes complementary to two target transcripts in order to identify cells transcribing one or both genes of interest.

Some scientists use explant cultures to analyze cell responses under various conditions. In this experiment, investigators dissected sensory neurons from the inner ear of chick embryos and cultured them for several hours. Next, cultures were switched to media containing protein beads. Time-lapse confocal images following incubation with labeled antibodies revealed that proteins on the beads promoted the growth of projections from neuron cell bodies.

You’ve just watched JoVE’s introduction to molecular developmental biology. In this video, we have reviewed the history of molecular developmental biology research, and introduced key questions asked by developmental biologists. We also explored prominent research strategies, and discussed some of their current applications. As always, thanks for watching!

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