2.6: Hibridación In Situ de montaje completo

La hibridación in situ de montaje completo es una técnica poderosa que permite a los científicos comprender las bases moleculares del desarrollo embrionario. "Montaje completo" indica que se utilizará todo el embrión, no solo un corte de tejido. "In situ" es una frase latina que significa "en posición". Y finalmente, la "hibridación" se refiere a la unión complementaria de una molécula de ARN producida sintéticamente a una transcripción de ARNm dentro de la célula de un organismo.

Este video demostrará el procedimiento, los resultados esperados y las aplicaciones seleccionadas de esta técnica que pueden permitir una mejor comprensión de los trastornos del desarrollo.

Los genes que subyacen a la morfogénesis de los organismos se expresan en patrones temporal y espacialmente restringidos durante el curso del desarrollo embrionario.

Las sondas de ARN producidas sintéticamente, llamadas ribosondas, se utilizan para detectar ARNm mediante unión complementaria. Las ribosondas están marcadas con nucleótidos especiales que contienen "haptenos", como dinitrofenol, biotina o digoxigenina. Los haptenos son moléculas que pueden provocar una respuesta inmunitaria cuando se unen a moléculas más grandes y, por lo tanto, son objetivos para la unión de anticuerpos. Estos anticuerpos de detección se conjugan con enzimas, como la peroxidasa de rábano picante o la fosfatasa alcalina, que catalizan reacciones químicas en las que se puede depositar un tinte fluorescente o coloreado.

Las técnicas tradicionales de hibridación in situ requieren la preparación de secciones de tejido de un embrión para facilitar la detección de las estructuras internas. Como resultado, será necesario reconstruir una evaluación completa de la expresión génica en todo el organismo a partir de los cortes de tejido de 5-6 μm con la ayuda de software informático. Sin embargo, con el desarrollo de las técnicas de montaje completo, se puede obtener un análisis de la expresión génica a mayores distancias dentro del embrión completo.

Después de ver los principios detrás de la hibridación in situ de montaje completo, repasemos el protocolo experimental paso a paso.

El primer paso de este procedimiento consiste en la identificación de la secuencia diana en el organismo modelo que se va a investigar. A continuación, la secuencia de ADN diana se amplifica mediante PCR utilizando cebadores que contienen secuencias de iniciación de ARN polimerasa. La plantilla de ADN amplificada ahora se transcribe in vitro con nucleótidos marcados con haptenos. Esta ribosonda marcada con haptenos ya está lista para la etapa de hibridación.

Los embriones se preparan para la hibridación mediante la fijación con formaldehído, un reactivo de reticulación que estabiliza las proteínas y protege contra las RNasas. Después de la fijación, el formaldehído se elimina lavando el embrión varias veces con solución salina tamponada con fosfato que contiene una pequeña cantidad de detergente, como Tween. Para eliminar los lípidos celulares y facilitar la penetración de la sonda en los tejidos, los embriones se deshidratan en una serie graduada de lavados con metanol, por ejemplo: 25%, 50%, 75%, 100% de metanol. Los embriones se pueden conservar en metanol al 100% durante un mes (o más) a -20 °C.

Para preparar los embriones para la hibridación, deben rehidratarse mediante una serie graduada de lavados con metanol con una cantidad progresivamente menor de metanol por lavado. A continuación, los embriones se digieren con una proteasa para facilitar la difusión de la ribosonda en los tejidos. La ribosonda marcada se añade al embrión y se lleva a cabo la hibridación.

Se realizan lavados posteriores a la hibridación para eliminar las hibridaciones inespecíficas. Las ARNasas A y T1 se añaden para eliminar las sondas hibridadas incompletas mediante la digestión de ARN monocatenario. Las sondas hibridadas se detectan con un conjugado anticuerpo-enzima que se une a las ribosondas marcadas con haptenos. Como se mencionó anteriormente, las enzimas como la fosfatasa alcalina se conjugan con anticuerpos específicos de hapteno y se detectan agregando sustratos enzimáticos para provocar un cambio de color. El producto de la reacción forma un precipitado de color púrpura oscuro que marca la ubicación del ARNm expresado, como se ve en este ejemplo.

Ahora que ya sabes cómo hacer la hibridación in situ de montaje completo, veamos algunas aplicaciones de la técnica.

La hibridación in situ de montaje completo se ha utilizado para ayudar a los científicos a abordar enfermedades mortales transmitidas por mosquitos, como la malaria, el dengue y la enfermedad del Nilo Occidental. Al caracterizar los genes implicados en la reproducción y el desarrollo de los mosquitos, se pueden diseñar nuevos insecticidas biológicos o químicos para atacar mejor a los mosquitos portadores de enfermedades.

Otra aplicación de esta técnica consiste en la caracterización de los cambios en el patrón de expresión génica asociados con la exposición a teratógenos o agentes que interfieren con el desarrollo fetal.

Aquí, se utilizó la hibridación in situ de montaje completo en un modelo de pez cebra del síndrome alcohólico fetal para identificar genes cuyos patrones de expresión cambian después de la exposición al alcohol. Esto puede ayudar en el desarrollo de terapias para mitigar las consecuencias de la exposición al alcohol en el útero.

La hibridación in situ de montaje completo también se puede utilizar para validar los cambios fenotípicos asociados con enfermedades congénitas. Las mutaciones asociadas con el síndrome de Bardet-Biedl se introdujeron en embriones de pez cebra a través de ARNm mutantes producidos sintéticamente. Después de un período de tiempo definido, los embriones se dividieron en grupos en función de la gravedad de los defectos. La visualización de la expresión de los genes aguas abajo del gen mutado se utilizó para validar los cambios fenotípicos. Por lo tanto, la hibridación in situ de montaje completo en combinación con la puntuación fenotípica puede facilitar una mejor comprensión de las funciones de las mutaciones específicas que subyacen a los defectos del desarrollo.

Acabas de ver el vídeo de JoVE sobre la hibridación in situ de montaje completo. Esta técnica es una poderosa herramienta que permite una caracterización temporal y espacial precisa de la expresión génica dentro de un organismo. La hibridación in situ de montaje completo se está utilizando actualmente para generar un atlas de los patrones de expresión génica durante el desarrollo en una multitud de organismos modelo. Estos estudios pueden facilitar el desarrollo de nuevas terapias para tratar enfermedades humanas, incluido el cáncer. ¡Gracias por mirar!