Hibridación In Situ de montaje completo

Whole-Mount <em>In Situ</em> Hybridization

JoVE Science Education
Developmental Biology

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Whole-Mount In Situ Hybridization

2.5: Explant Culture for Developmental Studies

2.7: An Introduction to Stem Cell Biology

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08:00 min

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April 30, 2023

Overview

Conjunto de montaje en situ hibridación (WMISH) es una técnica común utilizada para la visualización de la ubicación de RNAs expresadas en embriones. En este proceso, sintéticamente producidas sondas de RNA son primera complementariamente obligado o “cruzado por hibridación,” a la transcripción de genes diana. Inmunohistoquímica o fluorescencia se utiliza entonces para detectar estos híbridos de ARN, revelando los patrones espaciales y temporales de la expresión génica. A diferencia de los tradicionales en situ hibridación técnicas, que requieren de secciones del tejido fino cuyas imágenes se necesitan reensamblarse computacionalmente, la técnica de montaje de conjunto permite gene patrones de la expresión a evaluar sobre el embrión entero o estructura.

Este video presenta los conceptos básicos de Monte toda la coloración y el detalle claves procesales, incluyendo el diseño de la sonda y producción, fijación de embriones y tinción y detección de señales de hibridación posterior. Los espectadores aprenderán entonces sobre cómo desarrollo biólogos están aplicando WMISH a estudios de investigación actuales.

Procedure

Conjunto de montaje en situ el hibridación es una técnica poderosa que permite a los científicos a entender las bases moleculares del desarrollo embrionario. “Whole-mount” indica que el embrión entero se utiliza, no sólo un trozo de tejido. “In situ” es un frase en latín que significa “lugar.” Y por último, la “hibridación” se refiere a la Unión complementaria de una molécula de ARN sintético producida a una transcripción de mRNA dentro de la célula de un organismo.

Este video muestran el procedimiento, los resultados esperados y las aplicaciones de esta técnica que puede permitir para una mejor comprensión de los trastornos del desarrollo.

Genes subyacentes morfogénesis del organismo se expresan en patrones restringidos temporal y espacial en el curso del desarrollo embrionario.

Sintéticamente producidas sondas de RNA, llamadas riboprobes, se utilizan para detectar mRNAs complementarios atando. Están etiquetados riboprobes con especiales nucleótidos que contiene “haptenos” como el dinitrofenol, biotina o digoxygenin. Los haptenos son moléculas que pueden provocar una respuesta inmune cuando se ata a las moléculas más grandes y por lo tanto son objetivos para la Unión de anticuerpos. Estos anticuerpos de detección son conjugados a enzimas como la peroxidasa de rábano o fosfatasa alcalina, que catalizan las reacciones químicas donde puede depositarse un colorante fluorescente o de color.

Tradicional en situ hibridación técnicas requieren la preparación de las secciones de tejido de un embrión para facilitar la detección de las estructuras internas. Como resultado, una evaluación completa de la expresión génica en todo el organismo tendrá que ser reconstruido a partir de las láminas de tejido de 5-6 μm con la ayuda de programas informáticos. Sin embargo, con el desarrollo de técnicas de montaje de conjunto, análisis de expresión génica sobre distancias más grandes en el embrión entero pueden ser obtenido.

Después de observar los principios del montaje en conjunto en situ el hibridación, vamos a ir a través del protocolo experimental paso a paso.

El primer paso de este procedimiento consiste en la identificación de la secuencia de destino en el organismo modelo para ser investigado. La blanco de secuencia de la DNA entonces se amplifica por PCR usando las cartillas que contienen secuencias de ARN polimerasa iniciación. Ahora, la plantilla de ADN amplificada se transcribe in vitro con nucleótidos marcados con hapteno. Este riboprobe marcado hapteno está listo para el paso de hibridación.

Los embriones están preparados para hibridación mediante fijación con formol, un cross-linking reactivo que estabiliza proteínas y protege contra RNasas. Después de la fijación, el formaldehído se elimina el embrión se lava varias veces con tampón fosfato salino que contiene una pequeña cantidad de detergente, como interpolación. Para eliminar los lípidos celulares y facilitar la penetración de la sonda en los tejidos, los embriones se deshidratan en una serie gradual de lavados de metanol, por ejemplo: 25%, 50%, 75%, 100% metanol. Los embriones se pueden preservar en metanol al 100% hasta por un mes (o más) a-20 ° C.

Para preparar los embriones para hibridación, deben ser rehidratados por una serie gradual de metanol lavados con progresivamente menos metanol por lavado. Los embriones entonces son digeridos con una proteasa para facilitar la difusión de riboprobe en los tejidos. La etiqueta riboprobe se agrega al embrión y la hibridación se lleva a cabo.

Se realizan lavados de la hibridación para quitar hibridaciones no específicas. RNasas A un T1 se agregan remover incompleto cruzado por hibridación sondas por digerir RNA monocatenario. Las sondas hibridadas se detectan con un anticuerpo-enzima conjugado que se une al hapteno-etiquetados riboprobes. Como se mencionó anteriormente, enzimas como la fosfatasa alcalina están conjugadas hapteno específicos anticuerpos y se detectaron mediante la adición de sustratos enzimáticos para provocar un cambio de color. Producto de la reacción forma un precipitado de color púrpura oscuro marcar la ubicación de los mRNA expresado, como se ve en este ejemplo.

Ahora que sabes todo-Monte hibridación en situ , echemos un vistazo a algunas aplicaciones de la técnica.

Conjunto de montaje en situ el hibridación se ha utilizado para ayudar a los científicos hacer frente a enfermedades letales transmitidas por mosquitos como la malaria, el dengue y la enfermedad de West Nile. Por la caracterización de los genes implicados en el desarrollo y la reproducción de mosquitos, nuevos insecticidas biológicos o químicos pueden estar diseñados para mejor mosquitos de destino la realización de la enfermedad.

Otra aplicación de esta técnica consiste en la caracterización de la expresión génica cambios en los patrones asociados con la exposición a teratógenos, o a agentes que interfieren con el desarrollo fetal.

Aquí, todo Monte en situ el hibridación fue utilizado en un modelo de pez cebra de síndrome de alcoholismo fetal para identificar los genes cuyos patrones de expresión se cambian después de la exposición al alcohol. Esto puede ayudar en el desarrollo de terapias para mitigar las consecuencias de la exposición del alcohol en el útero.

Conjunto de montaje en situ el hibridación puede utilizarse también para validar cambios fenotípicos asociados con enfermedades congénitas. Se introdujeron mutaciones asociadas con el síndrome de Bardet-Biedl en embriones de pez cebra mediante mRNAs mutante producida sintéticamente. Después de un período definido de tiempo, los embriones fueron divididos en grupos basados en la severidad de los defectos. Visualización de la expresión de genes corriente abajo del gen mutado se utilizó para validar los cambios fenotípicos. Por lo tanto, conjunto de montaje en situ hibridación en combinación con calificación fenotípica puede facilitar una mejor comprensión de los roles de mutaciones específicas subyacentes defectos de desarrollo.

Sólo ha visto video en todo montaje en situ hibridación de Zeus. Esta técnica es una poderosa herramienta que permite la caracterización espacial y temporal precisa de la expresión génica dentro de un organismo. Conjunto de montaje en situ el hibridación se está utilizando actualmente para generar un atlas de patrones de expresión génica durante el desarrollo de una multitud de organismos modelo. Estos estudios pueden facilitar el desarrollo de nuevas terapias para tratar enfermedades humanas, incluyendo el cáncer. ¡Gracias por ver!

Transcript

Whole-mount in situ hybridization is a powerful technique that enables scientists to understand the molecular basis of embryonic development. “Whole-mount” indicates that the entire embryo will be used, not just a tissue slice. “In situ” is a Latin phrase meaning “in position.” And finally, “hybridization” refers to the complementary binding of a synthetically produced RNA molecule to an mRNA transcript within the cell of an organism.

This video will demonstrate the procedure, the expected results, and selected applications of this technique that can allow for better understanding of developmental disorders.

Genes underlying organism morphogenesis are expressed in temporally and spatially restricted patterns during the course of embryonic development.

Synthetically produced RNA probes, called riboprobes, are used to detect mRNAs by complementary binding. Riboprobes are labeled with special nucleotides containing “haptens,” such as dinitrophenol, biotin, or digoxygenin. Haptens are molecules that can elicit an immune response when attached to larger molecules, and are therefore targets for antibody binding. These detection antibodies are conjugated to enzymes, such as horseradish peroxidase or alkaline phosphatase, that catalyze chemical reactions where a fluorescent or colored dye can be deposited.

Traditional in situ hybridization techniques require the preparation of tissue sections of an embryo to facilitate the detection of the internal structures. As a result, a complete assessment of gene expression throughout the organism will need to be reconstructed from the 5-6 μm tissue slices with the help of computer software. However, with the development of whole-mount techniques, gene expression analysis over larger distances within the whole embryo can be obtained.

After looking at the principles behind whole-mount in situ hybridization, let’s go through the experimental protocol step-by-step.

The first step in this procedure involves the identification of the target sequence in the model organism to be investigated. The target DNA sequence is then amplified by PCR using primers containing RNA polymerase initiation sequences. The amplified DNA template is now transcribed in vitro with hapten-labeled nucleotides. This hapten-labeled riboprobe is now ready for the hybridization step.

Embryos are prepared for hybridization via fixation with formaldehyde, a cross-linking reagent that stabilizes proteins and protects against RNases. After fixation, the formaldehyde is removed by washing the embryo several times with phosphate buffered saline containing a small amount of detergent, such as Tween. To remove cellular lipids and facilitate probe penetration into the tissues, embryos are dehydrated in a graded series of methanol washes, for example: 25%, 50%, 75%, 100% methanol. Embryos can be preserved in 100% methanol for up to one month (or more) at -20°C.

To prepare embryos for hybridization, they must be rehydrated by a graded series of methanol washes with progressively less methanol per wash. Embryos are then digested with a protease to facilitate diffusion of riboprobe into the tissues. The labeled riboprobe is added to the embryo and the hybridization is carried out.

Post-hybridization washes are performed to remove nonspecific hybridizations. RNases A an T1 are added to remove incompletely hybridized probes by digesting single-stranded RNA. The hybridized probes are detected with an antibody-enzyme conjugate that binds the hapten-labeled riboprobes. As mentioned previously, enzymes like alkaline phosphatase are conjugated to hapten-specific antibodies, and are detected by adding enzyme substrates to elicit a color change. The reaction product forms a dark purple precipitate marking the location of the expressed mRNA, as seen in this example.

Now that you know how to do whole-mount in situ hybridization, let’s look at some applications of the technique.

Whole-mount in situ hybridization has been used to help scientists tackle deadly mosquito-borne diseases, such as malaria, dengue fever, and West Nile disease. By characterizing the genes involved in mosquito reproduction and development, new biological or chemical insecticides may be designed to better target the disease-carrying mosquitos.

Another application of this technique involves the characterization of gene expression pattern changes associated with exposure to teratogens, or agents that interfere with fetal development.

Here, whole-mount in situ hybridization was used in a zebrafish model of fetal alcohol syndrome to identify genes whose expression patterns are changed after exposure to alcohol. This can help in the development of therapies to mitigate the consequences of in utero alcohol exposure.

Whole-mount in situ hybridization can also be used to validate phenotypic changes associated with congenital diseases. Mutations associated with the Bardet-Biedl syndrome were introduced into zebrafish embryos via synthetically produced mutant mRNAs. After a defined period of time, embryos were divided into groups based on the severity of defects. Visualizing the expression of genes downstream of the mutated gene was used to validate the phenotypic changes. Thus, whole-mount in situ hybridization in combination with phenotypic scoring can facilitate a better understanding of the roles of specific mutations underlying developmental defects.

You’ve just watched JoVE’s video on whole-mount in situ hybridization. This technique is a powerful tool that enables precise temporal and spatial characterization of gene expression within an organism. Whole-mount in situ hybridization is currently being used to generate an atlas of gene expression patterns during development in a multitude of model organisms. These studies may facilitate the development of new therapeutics to treat human diseases, including cancer. Thanks for watching!

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