Hibridación In Situ de montaje completo
Conjunto de montaje en situ el hibridación es una técnica poderosa que permite a los científicos a entender las bases moleculares del desarrollo embrionario. "Whole-mount" indica que el embrión entero se utiliza, no sólo un trozo de tejido. "In situ" es un frase en latín que significa "lugar." Y por último, la "hibridación" se refiere a la Unión complementaria de una molécula de ARN sintético producida a una transcripción de mRNA dentro de la célula de un organismo.
Este video muestran el procedimiento, los resultados esperados y las aplicaciones de esta técnica que puede permitir para una mejor comprensión de los trastornos del desarrollo.
Genes subyacentes morfogénesis del organismo se expresan en patrones restringidos temporal y espacial en el curso del desarrollo embrionario.
Sintéticamente producidas sondas de RNA, llamadas riboprobes, se utilizan para detectar mRNAs complementarios atando. Están etiquetados riboprobes con especiales nucleótidos que contiene "haptenos" como el dinitrofenol, biotina o digoxygenin. Los haptenos son moléculas que pueden provocar una respuesta inmune cuando se ata a las moléculas más grandes y por lo tanto son objetivos para la Unión de anticuerpos. Estos anticuerpos de detección son conjugados a enzimas como la peroxidasa de rábano o fosfatasa alcalina, que catalizan las reacciones químicas donde puede depositarse un colorante fluorescente o de color.
Tradicional en situ hibridación técnicas requieren la preparación de las secciones de tejido de un embrión para facilitar la detección de las estructuras internas. Como resultado, una evaluación completa de la expresión génica en todo el organismo tendrá que ser reconstruido a partir de las láminas de tejido de 5-6 μm con la ayuda de programas informáticos. Sin embargo, con el desarrollo de técnicas de montaje de conjunto, análisis de expresión génica sobre distancias más grandes en el embrión entero pueden ser obtenido.
Después de observar los principios del montaje en conjunto en situ el hibridación, vamos a ir a través del protocolo experimental paso a paso.
El primer paso de este procedimiento consiste en la identificación de la secuencia de destino en el organismo modelo para ser investigado. La blanco de secuencia de la DNA entonces se amplifica por PCR usando las cartillas que contienen secuencias de ARN polimerasa iniciación. Ahora, la plantilla de ADN amplificada se transcribe in vitro con nucleótidos marcados con hapteno. Este riboprobe marcado hapteno está listo para el paso de hibridación.
Los embriones están preparados para hibridación mediante fijación con formol, un cross-linking reactivo que estabiliza proteínas y protege contra RNasas. Después de la fijación, el formaldehído se elimina el embrión se lava varias veces con tampón fosfato salino que contiene una pequeña cantidad de detergente, como interpolación. Para eliminar los lípidos celulares y facilitar la penetración de la sonda en los tejidos, los embriones se deshidratan en una serie gradual de lavados de metanol, por ejemplo: 25%, 50%, 75%, 100% metanol. Los embriones se pueden preservar en metanol al 100% hasta por un mes (o más) a-20 ° C.
Para preparar los embriones para hibridación, deben ser rehidratados por una serie gradual de metanol lavados con progresivamente menos metanol por lavado. Los embriones entonces son digeridos con una proteasa para facilitar la difusión de riboprobe en los tejidos. La etiqueta riboprobe se agrega al embrión y la hibridación se lleva a cabo.
Se realizan lavados de la hibridación para quitar hibridaciones no específicas. RNasas A un T1 se agregan remover incompleto cruzado por hibridación sondas por digerir RNA monocatenario. Las sondas hibridadas se detectan con un anticuerpo-enzima conjugado que se une al hapteno-etiquetados riboprobes. Como se mencionó anteriormente, enzimas como la fosfatasa alcalina están conjugadas hapteno específicos anticuerpos y se detectaron mediante la adición de sustratos enzimáticos para provocar un cambio de color. Producto de la reacción forma un precipitado de color púrpura oscuro marcar la ubicación de los mRNA expresado, como se ve en este ejemplo.
Ahora que sabes todo-Monte hibridación en situ , echemos un vistazo a algunas aplicaciones de la técnica.
Conjunto de montaje en situ el hibridación se ha utilizado para ayudar a los científicos hacer frente a enfermedades letales transmitidas por mosquitos como la malaria, el dengue y la enfermedad de West Nile. Por la caracterización de los genes implicados en el desarrollo y la reproducción de mosquitos, nuevos insecticidas biológicos o químicos pueden estar diseñados para mejor mosquitos de destino la realización de la enfermedad.
Otra aplicación de esta técnica consiste en la caracterización de la expresión génica cambios en los patrones asociados con la exposición a teratógenos, o a agentes que interfieren con el desarrollo fetal.
Aquí, todo Monte en situ el hibridación fue utilizado en un modelo de pez cebra de síndrome de alcoholismo fetal para identificar los genes cuyos patrones de expresión se cambian después de la exposición al alcohol. Esto puede ayudar en el desarrollo de terapias para mitigar las consecuencias de la exposición del alcohol en el útero.
Conjunto de montaje en situ el hibridación puede utilizarse también para validar cambios fenotípicos asociados con enfermedades congénitas. Se introdujeron mutaciones asociadas con el síndrome de Bardet-Biedl en embriones de pez cebra mediante mRNAs mutante producida sintéticamente. Después de un período definido de tiempo, los embriones fueron divididos en grupos basados en la severidad de los defectos. Visualización de la expresión de genes corriente abajo del gen mutado se utilizó para validar los cambios fenotípicos. Por lo tanto, conjunto de montaje en situ hibridación en combinación con calificación fenotípica puede facilitar una mejor comprensión de los roles de mutaciones específicas subyacentes defectos de desarrollo.
Sólo ha visto video en todo montaje en situ hibridación de Zeus. Esta técnica es una poderosa herramienta que permite la caracterización espacial y temporal precisa de la expresión génica dentro de un organismo. Conjunto de montaje en situ el hibridación se está utilizando actualmente para generar un atlas de patrones de expresión génica durante el desarrollo de una multitud de organismos modelo. Estos estudios pueden facilitar el desarrollo de nuevas terapias para tratar enfermedades humanas, incluyendo el cáncer. ¡Gracias por ver!
Conjunto de montaje en situ hibridación (WMISH) es una técnica común utilizada para la visualización de la ubicación de RNAs expresadas en embriones.…
Conjunto de montaje en situ el hibridación es una técnica poderosa que permite a los científicos a entender las bases moleculares del desarrollo embrionario. "Whole-mount" indica que el embrión entero se utiliza, no sólo un trozo de tejido. "In situ" es un frase en latín que significa "lugar." Y por último, la "hibridación" se refiere a la Unión complementaria de una molécula de ARN sintético producida a una transcripción de mRNA dentro de la célula de un organismo.
Este video muestran el procedimiento, los resultados esperados y las aplicaciones de esta técnica que puede permitir para una mejor comprensión de los trastornos del desarrollo.
Genes subyacentes morfogénesis del organismo se expresan en patrones restringidos temporal y espacial en el curso del desarrollo embrionario.
Sintéticamente producidas sondas de RNA, llamadas riboprobes, se utilizan para detectar mRNAs complementarios atando. Están etiquetados riboprobes con especiales nucleótidos que contiene "haptenos" como el dinitrofenol, biotina o digoxygenin. Los haptenos son moléculas que pueden provocar una respuesta inmune cuando se ata a las moléculas más grandes y por lo tanto son objetivos para la Unión de anticuerpos. Estos anticuerpos de detección son conjugados a enzimas como la peroxidasa de rábano o fosfatasa alcalina, que catalizan las reacciones químicas donde puede depositarse un colorante fluorescente o de color.
Tradicional en situ hibridación técnicas requieren la preparación de las secciones de tejido de un embrión para facilitar la detección de las estructuras internas. Como resultado, una evaluación completa de la expresión génica en todo el organismo tendrá que ser reconstruido a partir de las láminas de tejido de 5-6 μm con la ayuda de programas informáticos. Sin embargo, con el desarrollo de técnicas de montaje de conjunto, análisis de expresión génica sobre distancias más grandes en el embrión entero pueden ser obtenido.
Después de observar los principios del montaje en conjunto en situ el hibridación, vamos a ir a través del protocolo experimental paso a paso.
El primer paso de este procedimiento consiste en la identificación de la secuencia de destino en el organismo modelo para ser investigado. La blanco de secuencia de la DNA entonces se amplifica por PCR usando las cartillas que contienen secuencias de ARN polimerasa iniciación. Ahora, la plantilla de ADN amplificada se transcribe in vitro con nucleótidos marcados con hapteno. Este riboprobe marcado hapteno está listo para el paso de hibridación.
Los embriones están preparados para hibridación mediante fijación con formol, un cross-linking reactivo que estabiliza proteínas y protege contra RNasas. Después de la fijación, el formaldehído se elimina el embrión se lava varias veces con tampón fosfato salino que contiene una pequeña cantidad de detergente, como interpolación. Para eliminar los lípidos celulares y facilitar la penetración de la sonda en los tejidos, los embriones se deshidratan en una serie gradual de lavados de metanol, por ejemplo: 25%, 50%, 75%, 100% metanol. Los embriones se pueden preservar en metanol al 100% hasta por un mes (o más) a-20 ° C.
Para preparar los embriones para hibridación, deben ser rehidratados por una serie gradual de metanol lavados con progresivamente menos metanol por lavado. Los embriones entonces son digeridos con una proteasa para facilitar la difusión de riboprobe en los tejidos. La etiqueta riboprobe se agrega al embrión y la hibridación se lleva a cabo.
Se realizan lavados de la hibridación para quitar hibridaciones no específicas. RNasas A un T1 se agregan remover incompleto cruzado por hibridación sondas por digerir RNA monocatenario. Las sondas hibridadas se detectan con un anticuerpo-enzima conjugado que se une al hapteno-etiquetados riboprobes. Como se mencionó anteriormente, enzimas como la fosfatasa alcalina están conjugadas hapteno específicos anticuerpos y se detectaron mediante la adición de sustratos enzimáticos para provocar un cambio de color. Producto de la reacción forma un precipitado de color púrpura oscuro marcar la ubicación de los mRNA expresado, como se ve en este ejemplo.
Ahora que sabes todo-Monte hibridación en situ , echemos un vistazo a algunas aplicaciones de la técnica.
Conjunto de montaje en situ el hibridación se ha utilizado para ayudar a los científicos hacer frente a enfermedades letales transmitidas por mosquitos como la malaria, el dengue y la enfermedad de West Nile. Por la caracterización de los genes implicados en el desarrollo y la reproducción de mosquitos, nuevos insecticidas biológicos o químicos pueden estar diseñados para mejor mosquitos de destino la realización de la enfermedad.
Otra aplicación de esta técnica consiste en la caracterización de la expresión génica cambios en los patrones asociados con la exposición a teratógenos, o a agentes que interfieren con el desarrollo fetal.
Aquí, todo Monte en situ el hibridación fue utilizado en un modelo de pez cebra de síndrome de alcoholismo fetal para identificar los genes cuyos patrones de expresión se cambian después de la exposición al alcohol. Esto puede ayudar en el desarrollo de terapias para mitigar las consecuencias de la exposición del alcohol en el útero.
Conjunto de montaje en situ el hibridación puede utilizarse también para validar cambios fenotípicos asociados con enfermedades congénitas. Se introdujeron mutaciones asociadas con el síndrome de Bardet-Biedl en embriones de pez cebra mediante mRNAs mutante producida sintéticamente. Después de un período definido de tiempo, los embriones fueron divididos en grupos basados en la severidad de los defectos. Visualización de la expresión de genes corriente abajo del gen mutado se utilizó para validar los cambios fenotípicos. Por lo tanto, conjunto de montaje en situ hibridación en combinación con calificación fenotípica puede facilitar una mejor comprensión de los roles de mutaciones específicas subyacentes defectos de desarrollo.
Sólo ha visto video en todo montaje en situ hibridación de Zeus. Esta técnica es una poderosa herramienta que permite la caracterización espacial y temporal precisa de la expresión génica dentro de un organismo. Conjunto de montaje en situ el hibridación se está utilizando actualmente para generar un atlas de patrones de expresión génica durante el desarrollo de una multitud de organismos modelo. Estos estudios pueden facilitar el desarrollo de nuevas terapias para tratar enfermedades humanas, incluyendo el cáncer. ¡Gracias por ver!
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Conjunto de montaje en situ el hibridación es una técnica poderosa que permite a los científicos a entender las bases moleculares del desarrollo embrionario. "Whole-mount" indica que el embrión entero se utiliza, no sólo un trozo de tejido. "In situ" es un frase en latín que significa "lugar." Y por último, la "hibridación" se refiere a la Unión complementaria de una molécula de ARN sintético producida a una transcripción de mRNA dentro de la célula de un organismo.
Este video muestran el procedimiento, los resultados esperados y las aplicaciones de esta técnica que puede permitir para una mejor comprensión de los trastornos del desarrollo.
Genes subyacentes morfogénesis del organismo se expresan en patrones restringidos temporal y espacial en el curso del desarrollo embrionario.
Sintéticamente producidas sondas de RNA, llamadas riboprobes, se utilizan para detectar mRNAs complementarios atando. Están etiquetados riboprobes con especiales nucleótidos que contiene "haptenos" como el dinitrofenol, biotina o digoxygenin. Los haptenos son moléculas que pueden provocar una respuesta inmune cuando se ata a las moléculas más grandes y por lo tanto son objetivos para la Unión de anticuerpos. Estos anticuerpos de detección son conjugados a enzimas como la peroxidasa de rábano o fosfatasa alcalina, que catalizan las reacciones químicas donde puede depositarse un colorante fluorescente o de color.
Tradicional en situ hibridación técnicas requieren la preparación de las secciones de tejido de un embrión para facilitar la detección de las estructuras internas. Como resultado, una evaluación completa de la expresión génica en todo el organismo tendrá que ser reconstruido a partir de las láminas de tejido de 5-6 μm con la ayuda de programas informáticos. Sin embargo, con el desarrollo de técnicas de montaje de conjunto, análisis de expresión génica sobre distancias más grandes en el embrión entero pueden ser obtenido.
Después de observar los principios del montaje en conjunto en situ el hibridación, vamos a ir a través del protocolo experimental paso a paso.
El primer paso de este procedimiento consiste en la identificación de la secuencia de destino en el organismo modelo para ser investigado. La blanco de secuencia de la DNA entonces se amplifica por PCR usando las cartillas que contienen secuencias de ARN polimerasa iniciación. Ahora, la plantilla de ADN amplificada se transcribe in vitro con nucleótidos marcados con hapteno. Este riboprobe marcado hapteno está listo para el paso de hibridación.
Los embriones están preparados para hibridación mediante fijación con formol, un cross-linking reactivo que estabiliza proteínas y protege contra RNasas. Después de la fijación, el formaldehído se elimina el embrión se lava varias veces con tampón fosfato salino que contiene una pequeña cantidad de detergente, como interpolación. Para eliminar los lípidos celulares y facilitar la penetración de la sonda en los tejidos, los embriones se deshidratan en una serie gradual de lavados de metanol, por ejemplo: 25%, 50%, 75%, 100% metanol. Los embriones se pueden preservar en metanol al 100% hasta por un mes (o más) a-20 ° C.
Para preparar los embriones para hibridación, deben ser rehidratados por una serie gradual de metanol lavados con progresivamente menos metanol por lavado. Los embriones entonces son digeridos con una proteasa para facilitar la difusión de riboprobe en los tejidos. La etiqueta riboprobe se agrega al embrión y la hibridación se lleva a cabo.
Se realizan lavados de la hibridación para quitar hibridaciones no específicas. RNasas A un T1 se agregan remover incompleto cruzado por hibridación sondas por digerir RNA monocatenario. Las sondas hibridadas se detectan con un anticuerpo-enzima conjugado que se une al hapteno-etiquetados riboprobes. Como se mencionó anteriormente, enzimas como la fosfatasa alcalina están conjugadas hapteno específicos anticuerpos y se detectaron mediante la adición de sustratos enzimáticos para provocar un cambio de color. Producto de la reacción forma un precipitado de color púrpura oscuro marcar la ubicación de los mRNA expresado, como se ve en este ejemplo.
Ahora que sabes todo-Monte hibridación en situ , echemos un vistazo a algunas aplicaciones de la técnica.
Conjunto de montaje en situ el hibridación se ha utilizado para ayudar a los científicos hacer frente a enfermedades letales transmitidas por mosquitos como la malaria, el dengue y la enfermedad de West Nile. Por la caracterización de los genes implicados en el desarrollo y la reproducción de mosquitos, nuevos insecticidas biológicos o químicos pueden estar diseñados para mejor mosquitos de destino la realización de la enfermedad.
Otra aplicación de esta técnica consiste en la caracterización de la expresión génica cambios en los patrones asociados con la exposición a teratógenos, o a agentes que interfieren con el desarrollo fetal.
Aquí, todo Monte en situ el hibridación fue utilizado en un modelo de pez cebra de síndrome de alcoholismo fetal para identificar los genes cuyos patrones de expresión se cambian después de la exposición al alcohol. Esto puede ayudar en el desarrollo de terapias para mitigar las consecuencias de la exposición del alcohol en el útero.
Conjunto de montaje en situ el hibridación puede utilizarse también para validar cambios fenotípicos asociados con enfermedades congénitas. Se introdujeron mutaciones asociadas con el síndrome de Bardet-Biedl en embriones de pez cebra mediante mRNAs mutante producida sintéticamente. Después de un período definido de tiempo, los embriones fueron divididos en grupos basados en la severidad de los defectos. Visualización de la expresión de genes corriente abajo del gen mutado se utilizó para validar los cambios fenotípicos. Por lo tanto, conjunto de montaje en situ hibridación en combinación con calificación fenotípica puede facilitar una mejor comprensión de los roles de mutaciones específicas subyacentes defectos de desarrollo.
Sólo ha visto video en todo montaje en situ hibridación de Zeus. Esta técnica es una poderosa herramienta que permite la caracterización espacial y temporal precisa de la expresión génica dentro de un organismo. Conjunto de montaje en situ el hibridación se está utilizando actualmente para generar un atlas de patrones de expresión génica durante el desarrollo de una multitud de organismos modelo. Estos estudios pueden facilitar el desarrollo de nuevas terapias para tratar enfermedades humanas, incluyendo el cáncer. ¡Gracias por ver!
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Q1: What does whole-mount in situ hybridization allow scientists to visualize?
Whole-mount in situ hybridization enables visualization of expressed RNA locations throughout an entire embryo. Synthetically produced RNA probes, called riboprobes, bind complementarily to target mRNA transcripts. This reveals spatial and temporal patterns of gene expression across the whole organism, providing insights into developmental genetics techniques and applications.
Q2: How are riboprobes labeled for detection in whole-mount in situ hybridization?
Riboprobes are labeled with special nucleotides containing haptens, such as dinitrophenol, biotin, or digoxygenin. Haptens are molecules that elicit immune responses when attached to larger molecules, making them targets for antibody binding. Detection antibodies conjugated to enzymes like horseradish peroxidase or alkaline phosphatase then catalyze reactions that deposit fluorescent or colored dyes.
Q3: Why is embryo fixation with formaldehyde important before hybridization?
Formaldehyde fixation stabilizes proteins and protects embryos against RNases, which would otherwise degrade RNA. After fixation, embryos are washed with phosphate buffered saline containing detergent to remove formaldehyde. This preparation step ensures the embryo is ready for subsequent dehydration and probe penetration.
Q4: What is the advantage of whole-mount techniques over traditional tissue section methods?
Traditional in situ hybridization requires reconstructing gene expression from 5-6 micrometer tissue slices using computer software. Whole-mount techniques eliminate this limitation by allowing gene expression analysis over larger distances within the entire embryo. This provides a complete assessment of spatial and temporal gene expression patterns without computational reconstruction.
Q5: How are riboprobes generated for whole-mount in situ hybridization?
Target DNA sequences are first identified and amplified by PCR using primers containing RNA polymerase initiation sequences. The amplified DNA template is then transcribed in vitro with hapten-labeled nucleotides to produce labeled riboprobes. These probes are now ready for the hybridization step with embryonic tissues.
Q6: What role do post-hybridization washes play in the technique?
Post-hybridization washes remove nonspecific hybridizations and incompletely bound probes. RNases A and T1 are added to digest single-stranded RNA that did not properly hybridize. This ensures that only specifically hybridized probes remain, improving signal accuracy and reducing background noise in the final detection.
Q7: How is whole-mount in situ hybridization being applied to understand developmental disorders?
Researchers use whole-mount in situ hybridization to characterize gene expression changes associated with teratogens and congenital diseases. In zebrafish models of fetal alcohol syndrome, the technique identified genes with altered expression after alcohol exposure. Combined with phenotypic scoring, it validates how specific mutations underlying developmental defects affect gene expression downstream.
Capítulos en este video
0:00
Overview
0:56
Concepts Behind In Situ Hybridization
2:27
Target Identification and Probe Development
5:15
Applications
7:17
Summary