2.9: Pluripotencialidad inducida

Las células madre pluripotentes inducidas, al igual que las células madre embrionarias humanas, pueden diferenciarse en casi cualquier célula del cuerpo y, por lo tanto, son muy prometedoras en el campo de la medicina regenerativa.

Las células madre embrionarias humanas, o hESCs, se obtienen a partir de embriones preimplantacionales, mientras que las células somáticas totalmente diferenciadas se utilizan para generar células madre pluripotentes inducidas, que también se conocen como iPSCs.

En este vídeo, va a aprender sobre los principios básicos detrás de la generación de iPSC, un protocolo paso a paso para inducir la pluripotencia en células diferenciadas y algunas de las muchas aplicaciones y modificaciones posteriores de este protocolo.

Comencemos discutiendo los principios detrás de la generación de iPSC a partir de tipos de células somáticas.

Las células diferenciadas, como las células de la piel o las neuronas, son las que tienen el destino decidido. Se comprometen a realizar una función en particular. Por otro lado, las células madre pluripotentes son aquellas cuyo destino está indeciso, y pueden diferenciarse en cualquier tipo de célula.

El proceso de cambiar la identidad de una célula ya diferenciada a un estado pluripotente se denomina reprogramación celular. Esto implica cambiar el patrón de expresión génica en la célula, ya que el número y los tipos de proteínas producidas por una célula juegan un papel importante en la definición de la identidad de una célula.

Una de las formas de inducir la reprogramación celular es induciendo la expresión de ciertos factores de transcripción. Los factores de transcripción son proteínas que se unen a secuencias reguladoras dentro de un gen. Algunas de estas secuencias se denominan "promotores" y, por lo tanto, promueven la transcripción de un gen. Algunos factores de transcripción pueden influir en la expresión de numerosos genes, lo que tiene un gran impacto en la identidad celular.

Los cuatro factores de transcripción clásicos que se ha demostrado que inducen pluripotencia son Oct4, Sox2, cMyc y Klf4. Estos factores también se conocen como factores Yamanaka, en honor al investigador que descubrió sus efectos de reprogramación.

Se pueden utilizar múltiples métodos para inducir la expresión de estos factores de transcripción. El método más común y eficiente es el uso de un virus modificado para entregar los genes del factor de transcripción al núcleo, donde se integrarán en el genoma.

En este método, los genes que codifican los cuatro factores Yamanaka se empaquetan individualmente en diferentes retrovirus y se añaden a células diferenciadas. Cuando las células se exponen a virus modificados, una pequeña fracción de células diferenciadas se infecta con los cuatro virus portadores de factores de transcripción. Comienzan a desdiferenciarse hasta que se forman grandes grupos esféricos de células madre pluripotentes. La formación de grupos ayuda a las iPSC a crear un microambiente similar a las células madre in vivo y, por lo tanto, les ayuda a mantener su pluripotencia.

Ya que ya conoces los principios básicos que subyacen a la generación de iPSCs, vamos a repasar un protocolo general para inducir la pluripotencia en fibroblastos embrionarios de ratón, o MEFs, utilizando un sistema de transducción viral.

Antes de comenzar este procedimiento, tenga en cuenta que los virus pueden infectar las células de su cuerpo, por lo que es extremadamente importante seguir las pautas de seguridad.

Para comenzar el proceso de transfección, el medio de cultivo se retira de una placa que contiene una alta densidad de MEF y las células se lavan con una solución tampón. A continuación, se añade una solución que contiene una enzima degradadora de proteínas, como la tripsina, para levantar las células del fondo de la placa. A continuación, se añade el medio de cultivo a la placa y las células desprendidas se transfieren a un tubo de centrífuga.

Después de la centrifugación, el pellet se vuelve a suspender en el medio de cultivo. A continuación, se cuentan las células y se ajusta la concentración para que un número óptimo de células puedan infectarse con el virus al día siguiente. Incuba las células durante la noche.

Una vez que las células se han asentado en su nueva placa, los medios viejos se reemplazan por medios nuevos y se agregan a la placa virus modificados que contienen los factores de transcripción deseados. A continuación, las células se incuban con los virus durante el tiempo suficiente para permitir que se produzca la infección. Después de la incubación, el medio que contiene virus libres se elimina y se reemplaza con medio de células madre embrionarias frescas.

Durante 2-3 semanas después de la transformación, las células deben crecer a 37? en una incubadora, y los medios de cultivo deben ser reemplazados diariamente.

Después de este período de tiempo, las colonias de iPSC que se parecen a las colonias de células madre embrionarias deben volverse lo suficientemente grandes como para ser recogidas. Las colonias se pueden transferir a un plato fresco que contenga un medio con factores de crecimiento apropiados y se puede permitir que crezcan más. Para confirmar la pluripotencia, una parte de la población celular se tiñe con marcadores de pluripotencia.

Ahora que ha visto cómo generar iPSC a partir de celdas diferenciadas, echemos un vistazo a algunas aplicaciones posteriores y modificaciones de este método tan útil.

Una característica importante de las iPSC es que se pueden utilizar para generar casi cualquier célula del cuerpo. Este ejemplo muestra la generación de células del músculo cardíaco, llamadas cardiomiocitos, a partir de iPSC. Para ello, las iPSCs se transfieren a placas no adherentes que les permiten formar cuerpos embrioides, que son agregados de células madre pluripotentes. Los cuerpos embrioides se cultivan en un medio especializado que contiene suero y ácido ascórbico, lo que mejora la diferenciación cardíaca. La diferenciación exitosa se puede observar fácilmente cuando algunas células comienzan a latir.

Dado que las iPSC pueden diferenciarse potencialmente en cualquier tipo de célula, también pueden formar un organismo completo, como un ratón. Esto se puede hacer mediante un ensayo llamado complementación tetraploide. En primer lugar, un embrión tetraploide, un embrión que contiene cuatro juegos de cromosomas, se forma fusionando dos células de un embrión temprano mediante un campo eléctrico. Se permite que el embrión tetraploide se desarrolle hasta la etapa de blastocisto. A continuación, las iPSC se inyectan en el blastocisto, que a su vez se trasplanta a una hembra receptora para la gestación. Las células tetraploides solo pueden formar estructuras extraembrionarias como la placenta, por lo que los animales resultantes de este método se derivan completamente de iPSC.

Algunos investigadores modifican el procedimiento de reprogramación para hacer más eficiente el proceso de identificación de células reprogramadas con éxito. Por ejemplo, en este experimento, los MEFs con la capacidad de expresar proteína verde fluorescente bajo la influencia del promotor Oct4 ayudaron a los investigadores a identificar fácilmente las células que han adquirido pluripotencia.

Acabas de ver el vídeo de JoVE sobre la generación de células madre pluripotentes inducidas. En este vídeo se revisan los principios que subyacen a este procedimiento y un protocolo paso a paso para generar iPSCs a partir de células diferenciadas. También revisamos cómo se podría aplicar o modificar este método para experimentos en el laboratorio.

El descubrimiento de las iPSC ha tenido un gran impacto en el campo de la biología de las células madre, ya que tiene un enorme potencial para desarrollar terapias que puedan emplearse para tratar trastornos degenerativos. Aunque se ha avanzado mucho con las iPSC, el obstáculo que aún queda por superar es el riesgo asociado de cáncer. Los procedimientos de reprogramación actuales tienen el potencial de dar lugar a un crecimiento celular no regulado que puede dar lugar al cáncer. Por lo tanto, se requiere más investigación para usar realmente las iPSC clínicamente. Como siempre, ¡gracias por mirar!