Name: Imagiologia estruturas celulares no embrião vivo Zebrafish (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Aprenda a imaginar organelas subcelulares, como mitocôndrias e centrossomos, em embriões vivos de Danio rerio usando microscopia confocal e de campo amplo. Esta técnica permite estudar dinâmicas celulares in vivo sem procedimentos cirúrgicos.

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P.E. é apoiado pelo Grupo de Treinamento em Pesquisa 1373 da Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) e pela Escola de Pós-Graduação da Technische Universität München (TUM-GS). G.P. foi apoiado pelo TUM-GS. L.T. é apoiado por uma bolsa EMBO (EMBO ALTF 108-2013). O trabalho de D.P. sobre o peixe-zebra foi apoiado pela DFG por meio do Sonderforschungsbereich "Molecular Mechanisms of Neurodegeneration" (SFB 596); o Centro de Ciências Integradas de Proteínas (Munique) e o Sétimo Programa-Quadro da Comunidade Europeia (FP7/2007-2013) ao abrigo do acordo de subvenção n.º 200611 (MEMOSAD). Atualmente, ele é bolsista da New York Stem Cell Foundation-Druckenmiller e foi apoiado por uma bolsa da Academia Alemã de Ciências Leopoldina. L.G. é apoiado por financiamento da DFG através do SFB 870 "Montagem e Função de Circuitos Neuronais", Projeto A11. 
Somos gratos a Kristina Wullimann por manter nossas instalações de pesca, Yvonne Hufnagel pelo suporte técnico e Thomas Misgeld pelos comentários sobre o manuscrito. Somos gratos a R. Köster (Technische Universität Braunschweig) por fornecer o vetor M1 Medusa (pSKmemmRFP:5xUAS:H2B-CFP:5xUAS:Centrin2-YFP) a partir do qual clonamos Centrin-YFP e S.C. Suzuki e T. Yoshimatsu (Universidade de Washington) por fornecer o cerúleo 14xUAS:MA que usamos para gerar a construção repórter para fazer o CentrinFish. Agradecemos ainda a S.C. Suzuki e T. Yoshimatsu (Universidade de Washington) pela linha transgênica Otx2:Gal4, A. Sagasti pela construção Sensory:Gal4-VP16 (UCLA) e M. Nonet (Universidade de Washington em St. Louis) pelo vetor pCold Heart Tol2. Agradecemos a Bettina Schmid, Alexander Hruscha e Christian Haass (Centro Alemão de Doenças Neurodegenerativas de Munique - DZNE) por contribuírem para o desenvolvimento do MitoFish.

Os autores não têm nada a divulgar.

Aqui, demonstramos a versatilidade do sistema de expressão de Gal4 UAS-tag fluorescente para a mitocôndria, centrossomas e as membranas celulares do-tipos específicos de células in vivo em embriões de peixe-zebra. Muitas proteínas de fusão fluorescentes que rotular outros organelos e estruturas subcelulares podem ser encontrados na literatura publicada e pode ser obtido a partir do respectivo laboratório, fontes comerciais ou depositários plasmídeo não-comerciais (por exemplo, Addgene). Para conceber u...

Na imagem in vivo proporciona a visualização direta de comportamentos celulares no contexto mais fisiológica. A transparência de embriões de peixe-zebra, o seu desenvolvimento rápido e externa e uma rica variedade de ferramentas genéticas que permitem a marcação fluorescente têm contribuído para o crescente uso de microscopia in vivo para elucidar a dinâmica dos eventos fundamentais de desenvolvimento. Estudos de imagem do desenvolvimento do sistema nervoso no peixe-zebra tem, por exemplo, expandiu enormemente o nosso conhecimento do comportamento das células progenitoras neurais eo destino de seus descendentes, incluindo a sua subseqüente migração, diferenciação e integração de circuitos 1-8. O palco já está definido para investigar a dinâmica subcelulares subjacentes a esses comportamentos celulares. De fato, peixe-zebra já estão sendo exploradas como ferramentas para a biologia celular vivo. Agora é possível visualizar mitocôndrias 9-11, centrossomas 2,8,12-14, Golgi 15, O citoesqueleto de microtúbulos 4 e actina 16, endossomas e 17 componentes da membrana apical 1,18 complexo, entre outras estruturas subcelulares em embriões de peixe-zebra in vivo. Até agora, muito do que se sabe sobre a função destes organelos vem do estudo do seu comportamento em células em cultura. Embora estudos in vitro produziram tremenda visão sobre biologia celular, células em cultura não representa totalmente a complexidade da situação in vivo e, portanto, não refletem necessariamente a função e dinâmica de organelos subcelulares in vivo. Embriões de peixe-zebra oferecer uma alternativa viável em alternativa vivo para examinar a dinâmica subcelulares. Como vertebrados, peixe-zebra possuem diversos sistemas de órgãos (por exemplo, retina neural) que são homólogos aos encontrados em espécies de mamíferos. Para além disso, os embriões de peixe-zebra são cada vez mais utilizadas para modelar doenças humanas 19,20 </sup&gt;, incluindo os relacionados com a função centrosomal (por exemplo, microcefalia 21 e amaurose 22 congênita de Leber) e função mitocondrial (por exemplo, doença de Parkinson 23, Tauopatias 10,24 e síndrome de Barth 25). imagiologia in vivo a nível celular e subcelular nestes casos irá permitir uma melhor compreensão da biologia celular subjacente a estes estados patológicos. O objetivo geral dos métodos descritos aqui é fornecer um guia completo para investigar organelas e outras estruturas subcelulares em embriões de peixe-zebra usando em microscopia de luz vivo. O todo o fluxo de trabalho envolvido na visualização e rastreamento estruturas subcelulares in vivo é descrito - a partir de rotulagem abordagens genéticas, para gerar expressam transitoriamente e peixes transgénicos estáveis, e, finalmente, para imagiologia utilizando de campo amplo e microscopia confocal. Enquanto cada um destes Procedures é utilizado por numerosos laboratórios de peixe-zebra, os protocolos descritos são otimizados e simplificado para investigar a dinâmica das estruturas subcelulares. Dois aspectos específicos do trabalho aqui descrito garante menção: Em primeiro lugar, a utilização do sistema de expressão de Gal4 UAS-em múltiplas configurações geneticamente organelos etiqueta integrada tipos de células específicos. Em segundo lugar, uma comparação directa de grande campo e microscopia confocal a estruturas subcelulares de imagem in vivo. As estratégias actuais geneticamente organelos de etiquetas e de outras estruturas subcelulares no peixe-zebra, quer fazer uso de ARNm tampado 1,4,8 ou construções de ADN com base em elementos promotores conduzir directamente a expressão de proteínas de fusão 9,14,15. Transcrito in vitro de ARN em tampado resultados rápida e expressão ampla, que não é específico do tecido entanto. Além disso, os níveis de expressão diminuir ao longo do tempo, como o RNA tampado é diluído ou degradados. Assim, o uso de ARN baseadoconstrói para examinar a dinâmica de organelos em fases posteriores do desenvolvimento é limitado (geralmente até 3 dias pós-fertilização). Estas limitações podem ser superadas utilizando construções de ADN, em que o controlo espacial e temporal de expressão é determinada por elementos promotores específicos. Quando construções de ADN com base são utilizados no contexto do sistema Gal4-UAS melhorias significativas para os níveis de expressão do transgene são observados 26,27. Neste sistema de expressão bipartido, de tipo célula elementos promotores específicos dirigir a expressão de um activador transcricional Gal4, enquanto que os genes repórter são clonados a jusante da sequência de activação a montante Gal4 de ligação (UAS). Através da combinação de UAS de Gal4 repórteres com condutores apropriados, a expressão pode ser restringida a tipos específicos de células, evitando a necessidade de clonar genes repórter diferentes promotores para trás cada vez que é desejado um padrão de expressão específico. Além disso, a expressão de vários genes repórter pode ser UAScomandado por um único activador Gal4. O sistema Gal4-UAS proporciona, assim, uma abordagem genética versátil e flexível para a rotulagem subcelular. Wide-campo e microscopia confocal são os burros de carga da maioria dos laboratórios. sistemas de campo amplo tipicamente usam uma lâmpada de arco como uma fonte de luz e detectar a luz emitida com uma câmara sensível que é colocado na extremidade do percurso de luz. Esta modalidade de imagem é normalmente restrito a amostras finas como fora de foco de luz obscurece a informação em foco em amostras mais espessas. Microscópios confocal diferem dos sistemas de campo amplo, na medida em que são construídos para favorecer os sinais que se originam a partir do plano focal sobre aqueles que se originam fora de foco (ou seja, &quot;seccionamento óptico&quot;) 28. Para atingir o seccionamento de um orifício óptico é colocado no caminho de emissão em posição conjugada com a fonte de luz pontual. Os lasers são usados ​​como fontes de luz e os sinais são detectados com tubos fotomultiplicadores (PMTs). Praticamente, um laserfeixe é passado através da amostra de ponto-a-ponto e a emissão de fluorescência em cada ponto (pixel) é detectada pelo PMT. Aqui nós imagem as mesmas estruturas subcelulares em viver embriões de peixe-zebra usando tanto de campo amplo e microscopia confocal para proporcionar uma comparação directa de ambas as modalidades de microscopia. O objectivo subjacente de fornecer tais comparações é oferecer diretrizes para a escolha da técnica de microscopia mais apropriado para a questão específica na mão. Usando as abordagens descritas aqui demonstramos Gal4-UAS base rotulagem genética das mitocôndrias e centrossomas. Essas organelas são gravadas em diferentes tipos de células do sistema nervoso e em células musculares utilizando todo o campo e microscopia confocal para demonstrar a adequação de cada modalidade de imagem. Os métodos descritos aqui podem ser facilmente adaptado para a investigação de outros organelos e estruturas subcelulares no embrião do peixe-zebra vivos.

<table><tbody><tr><td>Agarose (2-hidroxietilagarose)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4018-10G</td><td>Aquecedor de bloco tipo VII de baixa temperatura de gelificação</td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Thermomixer compact</td></tr><tr><td>Ca(NO3)2 Nitrato de cálcio hidratado, 99,996%&nbsp;</td><td>Aldrich</td><td>202967-50g</td><td>Para preparar a câmera CCD 30x da</td></tr><tr><td>Danieau</td><td>Qimaging</td><td>Retiga Exi Fast 1394</td><td></td></tr><tr><td>Revestida de Cerâmica Dumont #5 Fórceps</td><td>Dumont - Ferramentas de Ciência Fina</td><td>11252-50</td><td>#5 Fórceps</td></tr><tr><td>Microscópio confocal de varredura a laser</td><td>Olympus</td><td>FV1000 Fluoview</td><td></td></tr><tr><td>Aquecedor de pratos de cultura</td><td>Warner Instrument Corporation</td><td>DH-35</td><td>Anel de aquecimento</td></tr><tr><td>Sal de metanossulfato de etilo 3-aminobenzoato</td><td>PharmaQ</td><td>Tricaine PharmaQ-25g</td><td>Tricaína (anestésico)</td></tr><tr><td>Microscópio de dissecação de fluorescência</td><td>Leica</td><td>M205 FA</td><td></td></tr><tr><td>Kit GeneClean</td><td>MP Biomedicals</td><td>111001200</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultura com fundo de vidro</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-0-14-C Placa de</td><td>Petri de 35 mm, micropoço de 14 mm, lamínula nº 0</td></tr><tr><td>Agulhas de vidro</td><td>World Precision Instruments Inc.&nbsp;</td><td>TW100F-4</td><td>Para microinjeções</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375-250g</td><td>Para preparar 30x Graxa</td></tr><tr><td>de Alto Vácuo</td><td>Danieau's Dow Corning&nbsp;</td><td>DCC000001242 150g</td><td>de graxa de dióxido de silício</td></tr><tr><td>KCl 99%</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>S7643-5kg</td><td>Para preparar 30x</td></tr><tr><td>MgSO4.7H2O de Danieau &nbsp; &nbsp; Sulfato de magnésio heptahidratado 98+% reagente A.C.S</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230291-500g</td><td>Para preparar 30x</td></tr><tr><td>Microinjetor Danieau&nbsp;</td><td>Pontas de microcarregador Eppendorf</td><td></td><td>FemtoJet</td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>930001007</td><td>0.5-20 ul</td></tr><tr><td>Micromanipulador</td><td>Maerzhaeuser Wetzlar</td><td>MM33 Rechts / 00-42-101-0000 / M3301R</td><td></td></tr><tr><td>Suporte de micropipeta</td><td>Intracel P</td><td>/ N 50-00XX-130-1</td><td></td></tr><tr><td>mMESSAGE mMACHINE SP6 Kit de transcrição</td><td>Ambion</td><td>AM1340</td><td>Para transcrever PCS-Transposase</td></tr><tr><td>NaCl BioXtra >99.5%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541-1kg</td><td>Para preparar 30x Nanofotômetro</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> Danieau's <td>Para medir a concentração de DNA/RNA</td></tr><tr><td>Extrator</td> de <td>agulhas Instrumento Sutter</td><td>P-1000</td><td>Flaming/Brown</td></tr><tr><td>NIR Apo 40x/0.80W&nbsp;</td><td>Objetiva Nikon</td><td></td><td>de cone de imersão</td></tr><tr><td>em água N-Feniltioureia Grau I, aprox. 98%</td><td>Sigma</td><td>P7629-10G</td><td>PTU (previne pigmentação)</td></tr><tr><td>Placas de Petri</td><td>Sarstedt AG&nbsp;</td><td>821472</td><td>92 x 16mm&nbsp;</td></tr><tr><td>Moldes de plástico&nbsp;</td><td>Ferramentas de Ciência Adaptativa</td><td>TU-1</td><td>Para microinjeções</td></tr><tr><td>Tampa de Plexiglas - com um furo</td><td>Feito sob medida</td><td></td><td>O furo na tampa de Plexiglas deve ser 3 mm maior que o diâmetro da objetiva do cone de imersão em água</td></tr><tr><td>Coador de chá (Plástico)</td><td></td><td></td> <td>Para coletar ovos de peixe-zebra</td></tr><tr><td>Controlador de temperatura</td><td>Warner Instrument Corporation</td><td>TC-344B</td><td>Dual Automatic Temperature </td></tr><tr><td>Pipetas de transferência</td> de controlador <td>Sarstedt AG&nbsp;</td><td>86.1171</td><td>pipetas de transferência de plástico de 3.5mL</td></tr><tr><td>UMPlanFI 100x/1.00W</td><td>Olympus</td><td></td><td>Objetiva de cone de imersão em água</td></tr><tr><td>UMPlanFLN 20x/0.50W&nbsp;</td><td>Olympus</td><td></td><td>Microscópio de campo amplo de objetiva de cone de imersão em água</td></tr><tr><td></td><td>Olympus</td><td>BX51WI</td><td></td></tr><tr><td>PTU (estoque de 50x)</td><td></td><td></td> <td>Dissolver 76 mg de PTU em 50 ml de água destilada Mexer vigorosamente à temperatura ambiente&nbsp; Armazenar a -20 oC em alíquotas de 1 ml Usar a 1x solução de trabalho</td></tr><tr><td>Tricaína (20x Stock)</td><td></td><td></td><td>Dissolver 200 mg de Tricaína em 48 ml de água destilada Adicionar 2 ml de base Tris 1M (pH9) Ajustar para pH 7&nbsp; Armazenar a -20 oC em alíquotas de 1 ml Usar a 1x solução de trabalho</td></tr><tr><td>Solução de Danieau (30x Estoque)</td><td></td><td></td><td>1.740 mM&nbsp; NaCl&nbsp; 21 mM&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; KCl&nbsp; 12 mM&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; MgSO4.7H2O&nbsp; 18 mM&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Ca (NO3)2 150 mM&nbsp; &nbsp; &nbsp; Amortecedor HEPES&nbsp; Água destilada até 1 L&nbsp; Loja em 4 oC&nbsp; Uso em solução de trabalho 0,3x</td></tr></tbody></table>

imagiologia estruturas celulares no embrião vivo zebrafish

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

A imagem in vivo fornece acesso sem precedentes ao comportamento dinâmico das estruturas celulares e subcelulares em seu contexto natural. A realização de tais experimentos de imagem em vertebrados superiores, como mamíferos, geralmente requer acesso cirúrgico ao sistema em estudo. A acessibilidade óptica do peixe-zebra embrionário e larval permite que esses procedimentos invasivos sejam contornados e permite imagens no organismo intacto. De fato, o peixe-zebra é agora um modelo bem estabelecido para visualizar comportamentos celulares dinâmicos usando microscopia in vivo em uma ampla gama de contextos de desenvolvimento, desde a proliferação até a migração e diferenciação. Um desenvolvimento mais recente é o uso crescente de peixe-zebra para estudar eventos subcelulares, incluindo tráfego mitocondrial e dinâmica de centrossomas. A relativa facilidade com que essas estruturas subcelulares podem ser geneticamente marcadas por proteínas fluorescentes e o uso de técnicas de microscopia de luz para imaginá-las está transformando o peixe-zebra em um modelo in vivo de biologia celular. Aqui descrevemos métodos para gerar construções genéticas que marcam organelas fluorescentemente, destacando mitocôndrias e centrossomas como exemplos específicos. Usamos o sistema bipartido Gal4-UAS em várias configurações para restringir a expressão a tipos de células específicos e fornecer protocolos para gerar peixes transgênicos estáveis e com expressão transitória. Finalmente, fornecemos diretrizes para a escolha de métodos de microscopia de luz mais adequados para a dinâmica subcelular de imagens.

Aqui o uso de largura de campo e microscopia confocal para a mitocôndria de imagem e centrossomas em viver embriões de peixe-zebra está diretamente comparados e contrastados. Dependendo da localização das células em que a dinâmica de organelos devem ser examinadas e a frequência inerente dos eventos específicos subcelulares, em geral, quer de campo amplo ou microscopia confocal é a melhor escolha. Nós fotografada organelos nos neurónios RB localizados na superfície do embrião e em célula...

A imagem do comportamento dinâmico de organelas e outras estruturas subcelulares in vivo pode lançar luz sobre sua função em condições fisiológicas e de doença. Aqui, apresentamos métodos para marcar geneticamente duas organelas, centrossomas e mitocôndrias, e imagens de sua dinâmica em embriões vivos de peixe-zebra usando microscopia de campo amplo e confocal.

Imagiologia estruturas celulares no embrião vivo Zebrafish

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

O objetivo geral deste método de imagem é estudar organelas subcelulares em um vertebrado in vivo. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da biologia celular neuronal, como a dinâmica de mitocôndrias ou centríolos em um contexto in vivo. A principal vantagem desta técnica é que todo o experimento pode ser realizado em um vertebrado intacto, sem a necessidade de qualquer procedimento cirúrgico.Este método pode fornecer informações não apenas sobre a dinâmica subcelular em condições fisiológicas, mas também pode ser aplicado a estudos de modelos de tese, como a doença de Alzheimer. Após gerar embriões com expressão transitória por microinjeção, ou obter embriões de linhagens transgênicas estáveis, de acordo com o protocolo descrito, ao final do primeiro dia, selecione os ovos mortos ou não fertilizados. Usando uma pipeta plástica de transferência, transfira os embriões viáveis para solução de Danieau contendo PTU 1x para prevenir a formação de pigmento, e mantenha os embriões em solução de Danieau contendo PTU 1x até a seleção para expressão do transgene.No dia do experimento de imagem, utilize um microscópio estereoscópico de fluorescência para analisar e

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Neste vídeo, demonstramos um método pelo qual para analisar o cérebro em desenvolvimento em embriões vertebrados zebrafish viver em resolução única célula por microscopia confocal. Isso inclui o método pelo qual injetamos o embrião do zebrafish de uma única célula e, posteriormente, montar e imagem do cérebro em desenvolvimento.

Vivem de imagem do cérebro Zebrafish embrionárias por microscopia confocal

Este protocolo descreve imagens de neurônios individuais ou de células da crista neural em embriões vivos zebrafish. Este método é usado para examinar comportamentos e localização celular actina microscopia de fluorescência usando lapso de tempo confocal.

Imagens ao vivo da motilidade celular e citoesqueleto de actina de neurônios individuais e células da crista neural em embriões Zebrafish

Chave para a compreensão dos processos morfogenéticos que forma o embrião precoce é a capacidade de células de imagem em alta resolução. Descrevemos aqui uma técnica para a rotulagem células isoladas ou pequenos aglomerados de células em embriões de peixe-zebra inteira com membrana-alvo Proteína Fluorescente Verde.

Rotulagem e Células de imagem no rombencéfalo Zebrafish

Imagem do desenvolvimento vascular cerebral em zebrafish larval é descrito. Técnicas para facilitar a imagens 3D e modificar o desenvolvimento vascular cerebral utilizando tratamentos químicos também são fornecidos.

Imagem e Reconstrução 3D de Estruturas cerebrovasculares em Embryonic Zebrafish

Descrito aqui é um protocolo para a imagem semi-automatizada de fluorescência de tecido específico em embriões de peixe-zebra.

Imagem semi-automatizada de Fluorescência de tecidos específicos em embriões Zebrafish

O método descrito aqui permite a análise de lapso de tempo de desenvolvimento de órgãos em embriões de peixe-zebra, usando um microscópio de dissecação de fluorescência capazes de realizar seccionamento óptico e estratégias simples de reajuste para corrigir desvio focal e planar.

Análise de Desenvolvimento de rim Zebrafish com imagem Time-lapse Usando um microscópio de dissecação Equipado para Seccionamento Optical

A mitose é crítica para todos os organismos vivos e os defeitos geralmente levam ao câncer e distúrbios do desenvolvimento. Usando este protocolo de imagem e o peixe-zebra como sistema modelo, os pesquisadores podem visualizar a mitose em um organismo vertebrado vivo e a infinidade de defeitos que surgem quando os processos mitóticos são defeituosos.

Observando mitótico Division e Dinâmica em um embrião de peixe-zebra ao vivo

Desenvolvimento de cílios é vital para a organogênese adequada. Este protocolo descreve um método otimizado para rotular e Visualizar células ciliadas do zebrafish.

Visualização de células Multiciliated no Zebrafish através de um protocolo combinado de toda montagem fluorescente In Situ da hibridação e imunofluorescência

Este protocolo demonstra a imunofluorescência seqüencial e immunohistochemistry em Cryosections dos embriões do zebrafish do cedo-estágio permitindo análises precisas da colocalização em populações específicas da pilha.

Imunofluorescência sequencial e imuno-histoquímica em embriões de zebrafish Crioseccionados

Este protocolo descreve uma abordagem para rotulagem e imagem multidimensional de zebrafish desenvolvimento precoce dos olhos. Descrevemos rotulagem, incorporação e imagens quadridimensionais (4D) usando microscopia confocal de varredura a laser, e considerações para otimizar a aquisição de conjuntos de dados para dissecção de mecanismos de morfogênese de copo óptico.

Imagem 4-Dimensional da Morfogense da Copa Óptica de Zebrafish

Uma estratégia de preparação de amostras para imagens de embriões iniciais de peixe-zebra dentro de um córion intacto usando um microscópio de folha de luz é descrita. Ele analisa as diferentes orientações que os embriões adquirem dentro do córion nos estágios de 70% de epibólia e gema e detalha estratégias de imagem para obter resolução em escala celular em todo o embrião usando o sistema de folha de luz.

Imagem de microscopia de folha de luz e estratégias de montagem para embriões iniciais de peixe-zebra

Aprenda a imaginar organelas subcelulares, como mitocôndrias e centrossomos, em embriões vivos de Danio rerio usando microscopia confocal e de campo amplo. Esta técnica permite estudar dinâmicas celulares in vivo sem procedimentos cirúrgicos.

Imagiologia estruturas celulares no embrião vivo Zebrafish

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