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La espectroscopia de fluorescencia de rayos X, o XRF, es una técnica analítica no destructiva que se utiliza para realizar análisis elementales de muestras a temperatura ambiente.
XRF se puede aplicar a una amplia gama de muestras, incluidas biológicas, forenses, ambientales e incluso obras de arte. Las muestras también pueden tomar una variedad de formas, como polvos, cristales y líquidos. En XRF, una muestra es bombardeada con un haz de rayos X, lo que hace que emita rayos X secundarios a una energía más baja, que se denominan radiación fluorescente.
Aunque se la conoce como una técnica de fluorescencia, la XRF difiere de la microscopía de fluorescencia tradicional en que no utiliza luz visible de baja energía ni moléculas activas con luz.
Este video presentará los conceptos básicos de XRF y demostrará cómo recopilar mapas elementales de una muestra biológica.
Cuando un fotón de suficiente energía choca con un átomo, la energía es absorbida, excitando uno de los electrones de la capa externa. A medida que el electrón se relaja, emite un fotón secundario, generalmente de menor energía. Este proceso se conoce como fluorescencia. A diferencia de los fotones de baja energía, como los utilizados en la microscopía de fluorescencia, los fotones de rayos X son lo suficientemente energéticos como para expulsar completamente los electrones fuertemente retenidos de una capa interna. Un electrón de una capa de mayor energía caerá entonces en la vacante. Se libera un fotón proporcional a la diferencia de energía entre las dos capas. Cada elemento emite un conjunto único de fotones, o espectro, que se puede utilizar para identificar el elemento y determinar la cantidad presente. Este fenómeno se conoce como fluorescencia de rayos X.
Una vez que se ha recogido un espectro elemental, se pueden aislar las señales de los elementos de interés. Las mediciones se pueden tomar en múltiples ubicaciones en una muestra, generando una imagen, un píxel a la vez. Este proceso se conoce como escaneo de trama. Posteriormente se pueden generar imágenes de todos los elementos de interés. Estos mapas elementales proporcionan información valiosa sobre la muestra. Con un conocimiento de XRF, ahora está listo para preparar una muestra de célula biológica para generar mapas elementales.
Para comenzar, primero prepare y esterilice una ventana de nitruro de silicio, que mantendrá la muestra en su lugar para el escaneo. Ten cuidado, ya que son muy frágiles. Oriente la ventana de modo que quede plana hacia arriba. A continuación, coloque la ventana en una placa de cultivo y adhiérala a la placa con pequeños trozos de cinta adhesiva.
Finalmente, esterilice la ventana de nitruro de silicona con radiación UV durante 1 hora.
Ahora que la ventana ha sido esterilizada, la muestra se puede fijar a ella. Primero, sostenga la placa de cultivo en ángulo y agregue medios a un lado de la placa. Alivie lentamente la inclinación para cubrir la ventana. Agregue las células al plato de la misma manera e incube.
Observe periódicamente las células bajo un microscopio óptico hasta que estén listas para usar.
En una campana de flujo laminar, aspire suavemente los medios de la placa.
Luego, enjuague las células con solución salina tamponada con fosfato para eliminar el exceso de medios.
Aspire el PBS y fije las células con paraformaldehído. Después de 20 minutos, retire la mezcla y deséchela como residuo peligroso.
Retire la ventana del plato y seque rápidamente los bordes y la hendidura posterior de la ventana con una toallita Kimwipe. Coloque la ventana sobre una superficie limpia para que se seque.
Una vez que la muestra esté seca, verifique la presencia de células en la ventana con un microscopio óptico.
Con esmalte de uñas transparente, asegure la ventana a un soporte de aluminio.
Inserte el portamuestras en la montura del instrumento y, a continuación, coloque la montura en la platina de posicionamiento de los microscopios de rayos X.
Coloque la ventana de muestra en el punto focal de la óptica del microscopio de rayos X, con un ángulo de 45 grados con respecto al haz incidente.
Salga del área del instrumento y realice los pasos restantes de forma remota para minimizar la exposición a los rayos X.
Abra el obturador y use la óptica para enfocar el haz de rayos X monocromático hasta un tamaño de punto submicrométrico.
La posición del punto se puede visualizar con una cámara precalibrada. Con las etapas de posicionamiento, determine la anchura y la altura adecuadas necesarias para rasterizar la muestra.
Recoja un espectro de prueba del elemento de interés con un tiempo de permanencia de 1 ? 2 segundos.
En el espectro de prueba, elija un tiempo de exploración adecuado para proporcionar una relación señal-ruido suficiente para los elementos de interés.
A continuación, determine la resolución necesaria para la muestra. La resolución debe ser menor que las características de interés, pero mayor que el tamaño del punto. Finalmente, programe el escaneo en el software de escaneo y recoja la imagen.
En este experimento, se realizó un mapa elemental de una célula para varios elementos diferentes. Muchos metales, como el cobre, el hierro y el zinc, son nutrientes importantes en la célula y se identificaron claramente dentro de la célula.
Al determinar dónde se encuentra cada metal en la célula, se puede dilucidar información valiosa sobre sus procesos celulares normales. Además, se pueden entender las enfermedades relacionadas con los metales.
La fluorescencia de rayos X se utiliza en una amplia gama de campos científicos. La naturaleza no destructiva de XRF permite su uso en el estudio de artefactos históricos. Los historiadores del arte utilizan la técnica para determinar los pigmentos utilizados originalmente en las obras de arte. Esto puede dilucidar información sobre la obra, como la procedencia, los colores que se han desvanecido con el tiempo y la autenticidad. Los científicos forenses también utilizan XRF en la investigación de la escena del crimen. Cuando se dispara un arma, el área circundante está cubierta con residuos de disparos. Los residuos de disparos contienen pólvora, cebador de ignición y metal del casquillo y la bala. La información recopilada con XRF puede identificar al culpable y el arma utilizada.
Otro campo de estudio que se presta a la fluorescencia de rayos X es la paleontología. Aquí, se recopila información elemental de un fósil de trilobite, un artrópodo marino que vivió hace más de 250 millones de años.
Al caracterizar la composición elemental de los fósiles, se puede obtener nueva información sobre la vida extinta hace mucho tiempo. Las muestras mejor conservadas pueden incluso proporcionar la composición de tejidos blandos que se han deteriorado hace mucho tiempo.
Acabas de ver la introducción de JoVE a la fluorescencia de rayos X. Ahora debe comprender la teoría de la espectroscopia de rayos X y cómo recopilar información elemental de una amplia gama de fuentes.
¡Gracias por mirar!
