Realización de cromatografía en capa fina 1D

1. Placas TLC

1. Los adsorbentes comunes para TLC son el gel de sílice, la alúmina y la celulosa. Las placas TLC están disponibles comercialmente con una variedad de propiedades. Elija una placa TLC y córtela a un tamaño adecuado (aproximadamente 5 cm x 5 cm es suficiente para la mayoría de las aplicaciones). Para los platos TLC con respaldo de vidrio, marque el vidrio con una regla y un cortador de vidrio, luego rompa con cuidado a lo largo de la línea.

2. Manchado

1. Disuelva la muestra en un disolvente adecuado para hacer una solución de aproximadamente el 1%. Si es posible, el disolvente debe ser no polar. Las fracciones de cromatografía en columna y otras soluciones diluidas se pueden utilizar sin diluir si el soluto está presente a una concentración entre el 0,2% y el 2,0%.
2. Marque la línea de base con un lápiz a aproximadamente 1,0 cm de la parte inferior del plato. Coloque las manchas al menos a 1,0 cm del borde del plato y etiquételas adecuadamente.
3. Las manchas se pueden aplicar con un capilar de vidrio. Para detectar la placa TLC, sumerja el capilar en la solución para aspirar una pequeña cantidad de líquido. Toque suavemente la punta en la ubicación deseada en la placa TLC y retírela inmediatamente.
4. Alternativamente, aplique las manchas con una jeringa de microlitros administrando aproximadamente 1 μL de solución para cada aplicación.
5. Las manchas se pueden aplicar sucesivamente en cada lugar, teniendo cuidado de no perturbar la superficie del adsorbente con el observador. Deje que el solvente se seque entre aplicaciones.

3. Elegir un solvente en desarrollo

1. Es preferible utilizar el disolvente menos polar posible para una buena separación. Los solventes comunes para TLC incluyen hexano, acetato de etilo, diclorometano y metanol (Tabla 1).
2. Una forma conveniente de encontrar una fase móvil apropiada es localizar la placa TLC con una muestra. Aplique suficiente disolvente directamente sobre la mancha para formar un círculo de disolvente de 1-2 cm de diámetro. Marca la circunferencia del círculo. Tras la visualización, un solvente apropiado mostrará anillos bien separados, con el anillo más externo aproximadamente el 50% de la distancia desde el centro hasta el frente del solvente.
3. Puede ser necesario ajustar la polaridad de la fase móvil eligiendo dos disolventes miscibles y probándolos en proporciones variables. Ejemplos de mezclas comunes son los hexanos con acetato de etilo y el diclorometano con metanol.

4. Desarrollo

1. Coloque la placa TLC manchada en una cámara de revelado que contenga el solvente de revelado adecuado. La línea de solvente debe estar por debajo de la línea de base marcada en la placa TLC.
2. La cámara de revelado puede ser un frasco con tapa o un vaso de precipitados cubierto con papel de aluminio o película de plástico. Use el recipiente más pequeño disponible que pueda acomodar la placa TLC.
3. No permita que el disolvente llegue al borde superior de la placa. Cuando el frente del disolvente (el límite donde termina la parte húmeda del adsorbente) esté a 5-10 mm de la parte superior de la placa, retire la placa TLC de la cámara de revelado y marque el frente del disolvente con un lápiz antes de que el disolvente se seque.

5. Visualización

1. Las manchas de color se pueden visualizar inmediatamente y marcar con un lápiz. A menudo, las manchas no son visibles y, por lo tanto, deben visualizarse por algún otro método.
2. A menudo, el adsorbente TLC contiene un indicador fluorescente. Las manchas se pueden visualizar con una lámpara ultravioleta (UV) de mano. Los compuestos que apagan la fluorescencia aparecerán como manchas oscuras cuando la placa se irradie con luz ultravioleta de onda corta (254 nm). Los compuestos fluorescentes producirán puntos brillantes cuando se irradien con luz ultravioleta de una longitud de onda adecuada. Marca el centro de cada punto con un lápiz.
3. Las manchas también se pueden visualizar aplicando un reactivo de visualización o una tinción a la placa de TLC. El reactivo de visualización se puede aplicar sumergiendo la placa en el reactivo o limpiando la placa con una bola de algodón saturada con un reactivo no corrosivo.
4. Una solución al 20% de ácido fosfomolíbdico en etanol es útil para la visualización de la mayoría de los compuestos orgánicos. Las manchas aparecen al calentar la placa con una pistola de calor o en un horno.
5. Se pueden utilizar otros reactivos para la visualización de clases específicas de compuestos. Por ejemplo, el reactivo de ninhidrina se utiliza para la visualización de aminoácidos y la 2,4-dinitrofenilhidracina para aldehídos y cetonas.

6. Análisis

1. El factor de retardo (R_f) es la relación entre la distancia que recorre un compuesto por una placa de TLC y la distancia que recorre el disolvente. Esto se puede determinar midiendo la distancia desde la línea de base hasta el centro de la mancha y dividiendo el valor por la distancia desde la línea de base hasta el frente del solvente.
   
2. La R_f de un compuesto es característica de sus propiedades físicas y depende de factores como la temperatura, el tamaño de la muestra y el espesor y la actividad del adsorbente, la temperatura y el tamaño de la muestra.
3. Para confirmar que un desconocido es idéntico a un compuesto conocido, se debe ver un estándar en la misma placa TLC. Sustancias idénticas tendrán la misma característica R_f.