Realización de cromatografía en capa fina 1D

La cromatografía en capa fina, o TLC, es un método cromatográfico utilizado para separar mezclas de compuestos no volátiles, comúnmente utilizados en química orgánica.

La TLC se realiza en una placa con respaldo de vidrio o plástico. Se marca una línea de base en la placa, junto con etiquetas. La mezcla que se está examinando y los compuestos de referencia se disuelven en un disolvente apropiado y se aplican cerca del borde inferior de la placa de TLC en pequeños puntos. La placa se coloca en un frasco, ¿y un solvente? (la fase móvil) separa la mezcla en función de las propiedades físicas de cada componente.

A pesar de que las técnicas de separación más pesadas con instrumentos tienen más poder de resolución que la TLC, es la velocidad y el bajo costo lo que hace que la TLC sea una técnica atractiva para el análisis cualitativo sobre la marcha. Este video demostrará la preparación, operación y análisis de la cromatografía en capa fina.

Las técnicas cromatográficas incluyen una fase estacionaria y otra móvil. En TLC, la fase estacionaria consiste en una fina capa de material fijada a la placa. El material es una sustancia polar, como el gel de sílice. La fase móvil es un líquido no polar que se desplaza hacia arriba por la capa adsorbente por acción capilar. A medida que la fase móvil se mueve hacia arriba en la placa, arrastra los componentes de cada punto, que posteriormente se separan en función de la polaridad.

Los compuestos que son menos polares pasarán más tiempo en la fase móvil a medida que se eleva por la placa. Los compuestos que son más polares son más atraídos por la fase estacionaria y, por lo tanto, no se moverán tan lejos en la placa.

La separación se lleva a cabo en un contenedor en desarrollo. Estos pueden ser frascos con tapa o vasos de precipitados cubiertos con papel de aluminio. Use el recipiente más pequeño disponible que acomode la placa TLC para acelerar la separación.

La fase móvil, o disolvente en desarrollo, debe ser lo menos polar posible para una buena separación. Aquí se muestra una serie eluotrópica para gel de sílice, una lista de fases móviles comunes en orden de aumento de la potencia de extracción.

Se pueden probar varias fases móviles simultáneamente. En un plato limpio, localice la muestra disuelta varias veces, al menos a 2 cm de distancia. Aplique suficiente fase móvil en cada punto para formar un círculo de 1-2 cm de diámetro.

Marque la distancia que recorre la fase móvil. Si la fase móvil no es lo suficientemente polar, la muestra permanecerá cerca del punto inicial. Si la fase móvil es demasiado polar, toda la muestra migrará con el frente del disolvente. Una fase móvil adecuada mostrará anillos bien separados, con el anillo más externo aproximadamente el 50% de la distancia al frente solvente.

Si es necesario, se pueden mezclar dos fases móviles miscibles en proporciones variables para obtener las propiedades deseadas. En este caso, una mezcla 1:1 de acetato de etilo y hexano era demasiado polar, pero una mezcla 1:20 se separó adecuadamente.

Con la fase móvil elegida, está listo para comenzar a desarrollar la placa.

Para comenzar el procedimiento, corte una placa TLC disponible en el mercado al tamaño deseado. Si el plato tiene un respaldo de vidrio, márcalo con un cortador de vidrio y rompe con cuidado a lo largo de la línea.

Con un lápiz, marque una línea de base a aproximadamente 1 cm de la parte inferior del plato. Marque la ubicación donde se detectarán las muestras a lo largo de la línea. Asegúrese de que las manchas estén al menos a 1 cm del borde y a 3 mm de distancia. etiquételos apropiadamente.

Las muestras sólidas deben disolverse en un disolvente adecuado. Los disolventes más comunes son los hexanos, el acetato de etilo o el diclorometano. Utilice el disolvente menos polar que disuelva la muestra.

Extraiga la mezcla de muestra y disolvente con un capilar de vidrio. Toque suavemente la punta en la ubicación deseada en la placa TLC y retírela inmediatamente. Es importante no perturbar la fase estacionaria.

Mantenga el lugar lo más pequeño posible, ya que esto conduce a una mejor separación. Si se necesita más muestra, se pueden aplicar manchas sucesivamente en cada ubicación. Deje que el solvente se seque entre aplicaciones. Se puede utilizar una corriente de aire para secar disolventes menos volátiles.

La placa TLC ya está lista para ser desarrollada. Coloque un trozo de papel de filtro en el fondo del frasco para aumentar la presión de vapor. Agregue la fase móvil a una profundidad que no alcance la línea de base. Tape el frasco cuando no esté en uso para que los vapores del solvente no se escapen.

Coloque con cuidado la placa TLC manchada en el frasco de revelado. Asegúrese de que la fase móvil esté por debajo de la línea de base. ¿Observas la evolución del frente solvente? ¿La vanguardia de la fase móvil? ya que se moverá rápidamente hacia arriba en el plato.

No permita que la fase móvil alcance el borde superior de la placa, ya que las bandas de muestra comenzarán a expandirse a través de la difusión. Una vez que el frente del disolvente se acerque a la parte superior, retire la placa de la cámara de revelado y marque el frente del disolvente con un lápiz antes de que el disolvente se seque.

Si los compuestos no están coloreados, se puede usar una lámpara UV para visualizar las manchas. El compuesto bloqueará la fluorescencia de fondo de la placa. Ajuste la lámpara a la configuración de onda corta e ilumine la placa seca. Con un lápiz, delinea las manchas visibles debajo de la lámpara. Con un lápiz, delinea las manchas visibles debajo de la lámpara.

Otra posible técnica de visualización es utilizar permanganato de potasio, un agente oxidante. Con unas pinzas, sumerja la placa en la mancha de permanganato.

Retire y frote el exceso de solución con una toalla de papel. En una campana extractora, caliente cuidadosamente la placa con una pistola de calor para visualizar las manchas. Usa un lápiz para marcar las manchas que aparezcan.

Una vez que se han visualizado los puntos, la sustancia de interés se puede comparar con los estándares, como se muestra aquí. En este ejemplo, la incógnita es la 1,3-difenilpropinona, un componente básico de la síntesis orgánica. Al comparar la banda con un estándar conocido y el cloruro de benzoilo, uno de los materiales de partida, se puede identificar el producto.

El factor de retardo, o Rf, se utiliza para identificar el compuesto desconocido. La Rf es la relación entre la distancia que recorre un compuesto por una placa TLC y la distancia que recorre la fase móvil. El factor se determina midiendo la distancia desde la línea de base hasta el punto y dividiendo por la distancia desde la línea de base hasta el frente de solvente.

La Rf de un compuesto dado depende de las condiciones utilizadas en el experimento, incluida la elección del solvente, el espesor y la actividad del adsorbente, la temperatura y el tamaño de la muestra. Se debe tener cuidado de mantener estos factores consistentes entre los experimentos.

Existen varias aplicaciones de la cromatografía en capa fina.

En este ejemplo, se estudió el contenido de triacilglicéridos de las glándulas sebáceas de los murciélagos. La fracción de la superficie lipídica se separó primero por polaridad en una placa TLC. A continuación, se retiró la banda de triacilglicéridos de la placa con una espátula. El polvo de sílice se transfirió a un tubo de microcentrífuga con solvente. Después de la centrifugación, la fase estacionaria se dejó en el fondo del tubo, mientras que los compuestos permanecieron disueltos en el solvente. Los triacilglicéridos fueron separados por otra propiedad física. En este caso, la segunda dimensión de la separación fue el tamaño molecular.

La TLC también se puede utilizar para controlar la progresión de una reacción química. En este ejemplo, el material de partida de la reacción se utilizó como estándar y se ejecutó junto con la solución de reacción en una placa TLC. Este proceso se repitió a intervalos específicos en el transcurso de la reacción. A medida que avanzaba la reacción, la banda del material de partida disminuía y la banda del producto se agrandaba. Cuando no hubo cambio en las bandas, o se consumió todo el material de partida, la reacción fue completa. ?

Por último, las placas de TLC se pueden utilizar en bioensayos. En este ejemplo, los compuestos se separaron del trébol rojo con TLC. A continuación, cada banda se colocó sobre bacterias que crecían en placas de agar. Las moléculas que mostraron un crecimiento bacteriano inhibido se analizaron más a fondo para determinar sus propiedades antimicrobianas.

Acabas de ver la introducción de JoVE a la cromatografía en capa fina. Ahora debe comprender la teoría subyacente de la separación, cómo elegir una fase móvil adecuada para su experimento y cómo configurar y operar una placa TLC. ¡Gracias por mirar!