نقص الأكسجين المسبق للخلية السلف المستمدة من نخاع كمصدر لتوليد خلايا شوان الناضجة

يتمثل الهدف العام من تقنية زراعة الخلايا هذه في إثراء السلائف العصبية في نخاع العظم لتسهيل تمايزها إلى خلايا شوان الوظيفية. وتتطرق هذه الطريقة إلى قضية أساسية في الطب التجديدي والخلايا الجذعية: كيفية استخدام مصدر محدود من السلائف العصبية لتوليد خلايا دبقية للمساعدة في إعادة نمو المحاور العصبية وإعادة الميالين بعد الإصابات الرضحية. وتكمن ميزة هذه التقنية في استخدام تهيئة زراعية فعالة لتسهيل توسيع الخلايا العصبية من الخلايا السدوية لنخاع العظم لاستخدامها في العلاج الخلوي الذاتي.

بعد يومين من الزرع، قم بإزالة 75% من الوسط المستنفد والخلايا غير الملتصقة، واغسل الخلايا الملتصقة بثلاث غسلات من محلول PBS بحجم 10 مليمتر. بعد الغسلة الثالثة، استبدل محلول PBS بـ 10 مليلتر من وسط نمو الخلايا السدوية لنخاع العظم، أو MSC، وأعد المزرعة إلى الحاضنة. ومن المفترض أن تظهر المستعمرات المرئية بحلول اليوم السادس أو السابع.

في اليوم العاشر، اغسل المزرعة بمحلول PBS طازج وفك ارتباط الخلايا باستخدام 1.5 milliliters من كاشف تفكيك الخلايا الإنزيمي المؤتلف. بعد خمس دقائق عند 37 درجة مئوية، أضف ثلاثة milliliters من وسط نمو MSC لتحييد التفاعل واجمع الخلايا المنفصلة عن طريق الطرد المركزي. أعد تعليق الراسب في خمسة milliliters من وسط نمو MSC طازج وازرع الخلايا بكثافة 4 × 10⁴ خلية لكل سنتيمتر مربع في طبق زراعة أنسجة جديد بقطر 10 centimeter.

يجب أن تصل الخلايا إلى درجة تلاقي تتراوح بين 80 إلى 90% خلال يومين من عملية تمرير الخلايا. وبالنسبة للتهيئة المسبقة بنقص الأكسجين، قم أولاً بتحرير مشبك الحلقة وتنظيف الأجزاء المكشوفة باستخدام 70% ethanol. ثم قم بتفكيك غرفة نقص الأكسجين إلى مكوناتها ووضعها داخل غطاء تدفق صفائحي للتعقيم تحت الأشعة فوق البنفسجية لمدة 15 دقيقة.

بعد ذلك، اغسل مستنبت الخلايا الجذعية الميزنشيمية (MSC) التي وصلت نسبة تلاحمها إلى 80 إلى 90% باستخدام 10 milliliters من PBS كما تم توضيحه للتو، وعالج المستنبتات بوسط نمو MSC طازج مضاف إليه 25 millimolar من hepes. ضع المستنبت المعالج داخل غرفة نقص الأكسجين التي أعيد تجميعها وأحكم ربط المشبك الحلقي. قم بسد النهايات المتصلة بالغرفة لضمان عدم تسرب الغاز، ثم قم بتدفق خليط غازي مكون من 99%nitrogen و1%oxygen إلى داخل الغرفة بمعدل تدفق قدره 10 liters في الدقيقة.

بعد مرور خمس دقائق، ضع الحجرة في حاضنة زراعة الخلايا لمدة 16 ساعة. وفي صباح اليوم التالي، قم بفصل الخلايا كما تم توضيحه للتو وجمعها عن طريق الطرد المركزي. أعد تعليق الراسب في وسط الخلايا السلفية العصبية، وازرع 6 × 10³ خلية لكل سنتيمتر مربع في أطباق منخفضة الالتصاق مكونة من 6 آبار لزراعتها عند 37 درجة مئوية و5% CO2 لمدة 12 يومًا.

يجب ملاحظة تكوّن كرات خلوية كبيرة غير ملتصقة بحلول اليوم السادس أو السابع. مع ظهور عدد أكبر من الكرات العصبية في المزارع المجهزة بظروف نقص الأكسجة مقارنة بتلك التي خضعت لظروف الأكسجة الطبيعية بحلول الأيام من 10 إلى 12. وفي اليوم 12، استخدم ماصة سعة 10 milliliters لنقل الكرات العصبية إلى أنبوب مخروطي سعة 15 milliliters وجمع الكرات العصبية عن طريق الطرد المركزي.

أعد تعليق الكرات في وسط DMEM/F12 وزع من خمس إلى 10 كرات عصبية لكل سنتيمتر مربع على أطباق ذات 6 آبار مغلفة بالبولي-D-لايسين واللامينين في 1.5 ملليلتر من وسط تحريض الخلايا الدبقية لكل بئر. حافظ على المزرعة الخلوية للكرات لمدة سبعة أيام على الأقل، مع تجديد الوسط كل ثلاثة أيام. ولحصاد عقد الجذر الظهري، انقل الجنين الأول إلى طبق زراعة بقطر 10 سنتيمتر يحتوي على PBS بدرجة حرارة الغرفة تحت مجهر تشريحي في وضع الانبطاح، ثم أدخل ملقط تشريح دقيق على جانبي الحبل الشوكي.

باستخدام التشريح غير الحاد، افصل الحبل الشوكي عن الأنسجة الرخوة المحيطة باستعمال الملقط لاستئصال الحبل الشوكي على طول فتحة الرقبة وجذع الذيل. قم بإزالة الأنسجة الرخوة المتبقية من الحبل الشوكي المحرر حتى لا يتبقى سوى الحبل الشوكي، وجذور الأعصاب، وعقدة الجذر الظهري المتصلة. افصل عقد الجذر الظهري الفردية عن جذور الأعصاب المتصلة بها.

بعد ذلك، استخدم قلم ماصة مجهز بطرف ماصة سعة 1 ml لنقل ما يصل إلى 100 من العقد الجذرية الظهرية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ml يحتوي على PBS. اجمع العقد عن طريق الطرد المركزي وأعد تعليق الرواسب في 200 µL من كاشف تفكيك الخلايا الإنزيمي المؤتلف لكل أنبوب. بعد 10 دقائق عند 37 °C، قم بطرد العقد الجذرية الظهرية مركزياً مرة أخرى، ثم استخدم طرف ماصة سعة 200 µL لتفتيت الرواسب برفق في وسط صيانة عصبونات العقد الجذرية الظهرية.

قم بزراعة خلايا العقد الجذرية الظهرية بكثافة 5 × 10³ خلية لكل سنتيمتر مربع على أطباق ذات 6 آبار مغطاة بـ poly-D-lysine واللامينين، وذلك في 1.5 مل من وسط صيانة عصونات العقد الجذرية الظهرية لكل بئر. بعد يومين من الزراعة عند 37 درجة مئوية و5% CO2، اغسل الخلايا وأعد مزارع الخلايا العصبية إلى الحاضنة في وسط تنقية عصونات العقد الجذرية الظهرية الجديد لمدة يومين آخرين. بعد ثلاث إلى أربع دورات صيانة وتنقية، يجب أن تعطي مزارع خلايا العقد الجذرية الظهرية نتيجة إيجابية للمؤشر العصبي Tuj-1 ونتيجة سلبية لمؤشر الخلايا الدبقية S100 beta.

في اليوم السابع من زراعة الخلايا الشبيهة بخلايا شوان، اشطف الخلايا بمحلول PBS ثم قم بفصلها باستخدام 0.5 milliliters من كاشف فصل الخلايا الإنزيمي المؤتلف لكل بئر عند 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. أعد تعليق كتلة الخلايا في وسط الزراعة المشتركة وازرع الخلايا الشبيهة بخلايا شوان فوق زراعة عصبونات العقد الجذرية الظهرية المنقاة بكثافة 1 times 10³ cells per square centimeter لمدة 14 يوماً من الزراعة المشتركة عند 37 درجة مئوية و 5%CO2. تُظهر الخلايا الجذعية الميزنكيمية (MSCs) السليمة مورفولوجيا مستدقة، وذلك على عكس المظهر الرباعي للخلايا الجذعية الميزنكيمية التي تم الحفاظ عليها لعدد كبير من الممرات وفقدت قدرتها متعددة الإمكانات.

يجب أن تُظهر مستعمرات الخلايا الجذعية الميزنكيمية (MSC) الموسعة تعبيراً عن واسمات MSC، وغياب واسمات الخلايا الجذعية المكونة للدم، والقدرة على التمايز إلى سلالات دهنية وعظمية وغضروفية. وتُظهر مزارع MSC السليمة التي خضعت للتكييف المسبق بنقص الأكسجة كرات عصبية أكبر من حيث العدد والحجم. كما يمكن تأكيد نقاء شبكة عصبونات العقدة الجذرية الظهرية من خلال التعبير عن الواسم العصبي Tuj-1 والغياب المتزامن لواسم خلايا شوان S100.

بعد 14 يوماً من الزراعة المشتركة مع عصبونات العقد الجذرية الظهرية، تكتسب الخلايا الشبيهة بخلايا شوان السمات والخصائص الوظيفية لخلايا شوان الناضجة الملتزمة بمصيرها. وبمجرد إتقان هذه العملية، يمكن توسيع المجموعة الفرعية من السلائف العصبية إما في الخلايا الجذعية الميزنكيمية من نخاع العظم (BMSCs) البشرية أو الجرذية خلال 10 أيام إذا تم تنفيذ تقنية توسيع الخلايا بشكل صحيح. وأثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر التأكد من أن عينة الخلايا الجذعية الميزنكيمية من نخاع العظم تحتوي على سلائف عصبية موجبة للنيستين (nestin)، وأنه قد تمت إزالة جميع السلائف المكونة للدم الموجبة لـ CD45.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية الحصول على BMSCs، وكيفية إثراء المجموعة الفرعية من السلائف العصبية، وتوجيه تمايز السلائف العصبية إلى خلايا شوان ملتزمة بمصير خلوي محدد لاستخدامها في تعزيز إعادة نمو المحاور العصبية وإعادة الميالين بعد الإصابة. باتباع هذا الإجراء، يمكن اشتقاق الغراء المياليني، مثل خلايا شوان الناضجة، لاستخدامها في تطوير علاجات لإصابات وأمراض إزالة الميالين في كل من الجهاز العصبي الطرفي والمركزي.