Ensayo de biotinilación en la superficie celular

Cell-surface Biotinylation Assay

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Cell Biology

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Cell-surface Biotinylation Assay

4.1: Detecting Reactive Oxygen Species

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April 30, 2023

Overview

Una célula puede regular la cantidad de proteínas particulares en su membrana de la célula por endocitosis, después de que proteínas de la superficie de la célula son efectivamente secuestradas en el citoplasma. Una vez dentro de una célula, las proteínas de la superficie pueden ser destruidas o “recicladas” a la membrana. El ensayo de Biotinilación superficial celular ofrece a los investigadores una manera de estudiar estos fenómenos. La técnica hace uso de un derivado de la biotina de molécula pequeña, que puede marcar proteínas de la superficie y luego ser dividido químicamente. Sin embargo, si la proteína de la superficie es endocytosed, el derivado de biotina estará protegido del escote. Por lo tanto, a analizar la etiqueta de biotina endocytosed uncleaved, los científicos pueden evaluar las cantidades de proteínas de la superficie internalizadas.

En este video, revisamos los conceptos del ensayo de Biotinilación, adentrarse en la estructura química del derivado de biotina y el mecanismo de su escote. Esto es seguido por un protocolo generalizado de la técnica y por último, una descripción de cómo los investigadores actualmente están usando para estudiar la dinámica de proteínas de superficie de diferentes células.

Procedure

Etiquetado de proteínas de la superficie de la célula con biotina presenta una poderosa herramienta para estudiar vías de transporte celular implicadas en la regulación de proteínas de la membrana. Una célula mantiene un sistema bien regulado de proteínas en la superficie, para que pueda recibir y responder a información extracelular a través de varias vías de señalización. Endocitosis, un proceso de englobamiento, se sugieren para estar implicado en la regulación de estas proteínas de la superficie de la célula causando su internalización. Por lo tanto, estas proteínas de etiquetado antes de endocitosis con agentes como la biotina ayuda a los científicos cuantificar su internalización y estudiar sus funciones en las vías celulares.

En este video, discutir los principios y la metodología de superficie de la célula Biotinilación ensayos y explorar algunas formas en que los científicos están adaptando este método hoy.

Primero revisemos los principios detrás del ensayo de Biotinilación de superficie de la célula.

Como se mencionó anteriormente, las células utilizan vías endocíticas para regular la densidad espacio-temporal y la distribución de proteínas de la superficie. Interiorizado las proteínas son transportadas a través de vías celulares específicas, que pueden ser llevados al lisosoma para su degradación, o reciclados hacia la superficie celular para una actividad continua. Biotinilación de superficie de la célula está diseñado para medir estos procesos.

La etiqueta utilizada en este ensayo, biotina, también conocida como vitamina H, es una molécula pequeña, soluble en agua. Un derivado utilizado de biotina para la superficie de los experimentos de etiquetado es el sulfo-NHS-SS-biotina, que consiste en el grupo sulfo, el grupo de éster N-hidroxi de succinimide, el enlace disulfuro y biotina. Vamos a simplificar esta enorme estructura sustituyendo la biotina con la letra “B”.

El grupo sulfo en esta estructura confiere una fuerte carga que hace que esta forma de membrana de biotina impermeant. Etiquetado de proteínas de la superficie de la célula se realiza mediante la adición de sulfo-NHS-SS-biotina para mantenerse a una temperatura que es restrictiva a la endocitosis de células. El grupo NHS reacciona con las aminas primarias en proteínas de la superficie, formando enlaces covalentes.

Luego, las células marcadas se mueven a una temperatura que es permisiva a endocitosis, durante el cual algunas de las proteínas marcadas internalizado. Finalmente, las células se mueven hacia atrás a la temperatura restrictiva dejar endocitosis. Con el fin de cuantificar específicamente proteínas internalizadas, hidrofílico, membrana impermeant reductor — como L-glutatión, se agrega. Esto reaccionan con los enlaces de disulfuro en biotina de sulfo-NHS-SS unendocytosed y unirse a grupos de biotina de. En este punto, restantes proteínas biotiniladas son aquellos cuyas etiquetas estaban protegidas desde el agente reductor debido a fueron previamente interiorizados.

Las células son luego sometidas a lisis, y las proteínas biotiniladas de endocitosis son aisladas a cuantificarse. Aislamiento se realiza mediante la adición de lysates de la célula a bolas sintéticas recubiertas con estreptavidina. Estreptavidina tiene una muy alta afinidad para la biotina, las proteínas biotiniladas se adhieren a los granos recubiertos. Se realiza una serie de pasos para eliminar proteínas contaminantes y por último una etapa de elución, se lavan para liberar proteínas encuadernadas. Las proteínas de la blanco entonces pueden ser analizadas mediante técnicas como el Western blot.

Desde entonces ya lo sabes los conceptos del ensayo de Biotinilación, echemos un vistazo a un protocolo generalizado que muestra cómo realizar este procedimiento para medir la endocitosis de proteínas de la superficie.

Empezar con células cultivadas refrigeradas a 4° C. Colóquelos en hielo para mantener la temperatura que es restrictiva a la endocitosis. A continuación, se añade el reactivo sulfo-NHS-SS-biotina impermeables de la membrana, y las células se incuban en la oscuridad durante aproximadamente 30 minutos. Esto permite suficiente tiempo para que las etiquetas de biotina unir covalentemente a las proteínas de la superficie. Las células entonces se quitan del hielo y se incubó a 37° C durante aproximadamente 30 minutos. A esta temperatura, proteínas de la superficie biotinilado son endocytosed. Tras la incubación, las células se enfrían a 4° C, y se agrega hidrofílico agente reductor como la L-glutatión. Esto reacciona con disulfuro y libera los grupos de biotina de la etiqueta, las proteínas unendocytosed.

A continuación, las células son lisis por centrifugación, así rompiendo las membranas celulares y proteínas biotiniladas de exponer. A continuación, lisados se agregan a perlas recubiertas de estreptavidina y proteínas biotiniladas pueden enlazar. Los granos se lavan con tampón de fosfato frío salina y eluídas con un tampón que contiene detergentes y agentes reductores. Estos reactivos desnaturalizar proteínas dependientes de los granos y permitan su recuperación en el efluente. Las proteínas en el eluido se separan sobre la base de su masa molecular por electroforesis en gel. Por último, Western blotting y sondeo de blot con anticuerpos específicos de proteína permite la visualización de la proteína diana. Porcentaje endocitosis proteínas se pueden cuantificar de las densidades resultantes de la banda.

Ahora que usted comprende la metodología de Biotinilación celular, vamos a ver cómo se utiliza en experimentos específicos.

La aplicación más común de este protocolo de Biotinilación es medir la velocidad endocíticas de proteínas de superficie celular específicos. Aquí, los científicos estaban interesados en la evaluación de la internalización del transportador de la dopamina o DAT. Siguiendo el protocolo estándar, los científicos fueron capaces de medir el porcentaje de endocitosis DAT. Se trata de un carril de inmunoblot representativos mostrando T, correspondiente a “importe” de proteína antes de internalización, S es para las muestras “despojado” donde las células nunca se permitió proceder a través de endocitosis pero tratadas con agente reductor y carril carril representa a resultados de proteínas “interiorizadas”.

Además de simplemente medir endocitosis de proteínas de la superficie, los científicos también examinan los efectos de las drogas en este proceso. En este estudio, los investigadores evaluaron la densidad superficial de DATs en respuesta al tratamiento con un activador de la proteína quinasa C (PKC), cuya acción se ha sugerido para inducir la internalización de la DAT. Los científicos confirmaron esto adaptando el protocolo de Biotinilación en vitro para uso en un ensayo ex vivo de tejido de cerebro de ratón. Los datos revelados una pérdida de aproximadamente 30% de DAT de la membrana de la célula, en respuesta a la activación de la PKC.

Por último, mediante la deformación del ensayo de Biotinilación, los científicos también pueden medir el reciclaje de proteínas de membrana. Aquí, los investigadores estaban investigando la proteína canal superficial, CFTR, responsable de conducir los iones del cloruro. Para evaluar el reciclaje, investigadores realizaron un protocolo de Biotinilación estándar en un grupo de células y modificación el protocolo para el segundo grupo de células mediante la adición de pasos después de unirse a la biotina de las proteínas de la superficie unendocytosed. Estos pasos adicionales incluidos aumento de la temperatura de nuevo a 37° C para permitir el reciclaje de algunos de la internalizada, biotina tagged proteínas receptoras. Calculando la diferencia entre las proteínas internalizadas antes y después de reciclaje se lleva a cabo, estos científicos fueron capaces de cuantificar CFTR por ciento reciclado hacia la membrana.

Acabo de ver introducción de Zeus ensayo de Biotinilación de superficie de la célula. El video describe el procedimiento de este ensayo y explica la reacción que ocurre en cada paso. Por último, exploramos algunos experimentos de ejemplo que demostraron la aplicabilidad de este método. ¡Como siempre, gracias por ver!

Transcript

Labeling of cell surface proteins with biotin presents a powerful tool to study cellular transport pathways involved in regulating membrane proteins. A cell maintains a tightly regulated set of proteins at the surface, so that it can receive and respond to extracellular information via several signaling pathways. Endocytosis, a process of engulfing, is suggested to be involved in regulation of these cell surface proteins by causing their internalization. Therefore, labeling these proteins before they are endocytosed with agents like biotin helps scientists quantify their internalization and study their roles in cellular pathways.

In this video, we will discuss the principles and methodology of cell-surface biotinylation assays, and explore some ways in which scientists are adapting this method today.

Let’s first review the principles behind the cell-surface biotinylation assay.

As mentioned earlier, cells use endocytic pathways to regulate the spatiotemporal density and distribution of surface proteins. Internalized proteins are transported through specific cellular pathways, following which they can be either shunted to the lysosome for degradation, or recycled back to the cell surface for continued activity. Cell-surface biotinylation is designed to measure these processes.

The tag used in this assay, biotin—also known as vitamin H—is a small, water-soluble molecule. A commonly used derivative of biotin for surface labeling experiments is the sulfo-NHS-SS-biotin, which consists of the sulfo group, the N-hydroxy succinimide ester group, the disulfide bond, and of course biotin. Let’s simplify this huge structure by replacing biotin with the letter “B.”

The sulfo group in this structure imparts a strong charge that makes this form of biotin membrane impermeant. Labeling of cell surface proteins is done by adding sulfo-NHS-SS-biotin to cells maintained at a temperature that’s restrictive to endocytosis. The NHS group reacts with the primary amines on surface proteins, forming covalent bonds.

Then, the labeled cells are moved to a temperature that is permissive to endocytosis, during which some of the labeled proteins will be internalized. Finally, cells are moved back to the restrictive temperature to stop endocytosis. In order to specifically quantify internalized proteins, a hydrophilic, membrane-impermeant reducing agent—like L-glutathione—is added. This will react with the disulfide bonds on unendocytosed sulfo-NHS-SS biotin, and cleave biotin groups off. At this point, remaining biotinylated proteins are those whose labels were protected from the reducing agent because they were previously internalized.

Cells are then lysed, and the endocytosed biotinylated proteins are isolated to be quantified. Isolation is usually performed by adding cell lysates to synthetic beads coated with streptavidin. Since streptavidin has an extremely high affinity for biotin, the biotinylated proteins attach themselves to the coated beads. A series of washing steps to remove contaminating proteins, and lastly an elution step, is performed to release bound proteins. The target proteins can then be analyzed by techniques like Western blotting.

Since now you know the concepts behind the biotinylation assay, let’s look at a generalized protocol showing how to perform this procedure to measure endocytosis of surface proteins.

Start with cultured cells cooled to 4°C. Place them on ice to maintain the temperature that is restrictive to endocytosis. Next, the membrane impermeable sulfo-NHS-SS-biotin reagent is added, and cells are incubated in the dark for approximately 30 minutes. This allows sufficient time for biotin labels to covalently attach to the surface proteins. Cells are then removed from ice and incubated at 37°C for approximately 30 minutes. At this temperature, biotinylated surface proteins are endocytosed. Following incubation, the cells are cooled to 4°C, and a hydrophilic reducing agent like L-glutathione is added. This reacts with disulfide bonds and releases the biotin groups from labeled, unendocytosed proteins.

Next, cells are lysed by centrifugation, thus breaking cell membranes and exposing biotinylated proteins. Following this, lysates are added to streptavidin-coated beads and biotinylated proteins are allowed to bind. Beads are washed with cold phosphate buffered saline and eluted with a buffer containing detergents and reducing agents. These reagents denature bound proteins off beads and enable their recovery in the eluate. Proteins in the eluate are separated on the basis of their molecular mass by gel electrophoresis. Lastly, Western blotting and probing of the blot with protein-specific antibodies allow visualization of the target protein. Percentage endocytosed protein can be quantified from the resulting band densities.

Now that you understand the methodology of cell biotinylation, let’s look at how it’s used in specific experiments.

The most common application of this biotinylation protocol is to measure the endocytic rate of specific cell surface proteins. Here, scientists were interested in evaluating the internalization of dopamine transporter or DAT. By following the standard protocol, scientists were able to measure the percentage of endocytosed DATs. This is a representative immunoblot showing lane T, corresponding to “total” amount of protein before internalization, lane S is for “stripped” samples where cells were never allowed to proceed through endocytosis but treated with reducing agent, and lane I represents results of “internalized” proteins.

In addition to just measuring endocytosis of surface proteins, scientists also examine the effects of drugs on this process. In this study, researchers assessed the surface density of DATs in response to treatment with an activator of protein kinase C (PKC), whose action has been suggested to induce DAT internalization. Scientists confirmed this by adapting the in vitro biotinylation protocol for use in an ex vivo assay on mouse brain tissue. The data revealed an approximately 30% loss of DAT from the cell membrane, in response to PKC activation.

Lastly, by tweaking the biotinylation assay, scientists can also measure recycling of membrane proteins. Here, researchers were investigating the surface channel protein, CFTR, responsible for conducting chloride ions. To assess recycling, researchers performed a standard biotinylation protocol in one group of cells, and modified the protocol for the second group of cells by adding steps after cleaving biotin off of the unendocytosed surface proteins. These additional steps included raising the temperature back to 37°C to allow recycling of some of the internalized, biotin tagged receptor proteins. By calculating the difference between the internalized proteins before and after recycling takes place, these scientists were able to quantify percent CFTR recycled back to the membrane.

You just watched JoVE’s introduction to cell-surface biotinylation assay. The video described the procedural steps of this assay, and explained the reaction occurring at each step. Lastly, we explored some example experiments that demonstrated the applicability of this method. As always, thanks for watching!

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