Question 1

¿Qué es la fragmentación del ADN y cómo ocurre durante la apoptosis?

Accepted Answer

La fragmentación del ADN es una característica de la apoptosis donde el ADN cromosómico se escinde en fragmentos con extremos cortados. Las caspasas, enzimas en el citosol, activan la ADNasa activada por caspasa (CAD) al eliminar su inhibidor. La CAD activada viaja al núcleo y escinde el ADN cromosómico, creando fragmentos que se acumulan y señalan muerte celular.

Question 2

¿Cómo detecta las células apoptóticas el ensayo TUNEL?

Accepted Answer

El ensayo TUNEL marca fluorescentemente los extremos de ADN con hendiduras en células apoptóticas. La terminal desoxinucleotidil transferasa (TdT) cataliza la unión de nucleótidos de desoxiuridina trifosfato (dUTP) marcados fluorescentemente a grupos hidroxilo 3' libres en el ADN fragmentado. Esto crea células TUNEL positivas visibles bajo microscopía de fluorescencia.

Question 3

¿Cuáles son los pasos principales para realizar un ensayo TUNEL en secciones de tejido?

Accepted Answer

El protocolo del ensayo TUNEL incluye fijación de tejido usando paraformaldehído al 4%, crioseccionado en rebanadas de 10 µm, permeabilización con proteinasa K, adición de enzima TdT y dUTPs marcados, incubación durante 1-3 horas a 37°C, parada de la reacción con buffer de parada, y visualización con microscopía de fluorescencia.

Question 4

¿Por qué es necesaria la permeabilización del tejido antes de añadir los reactivos TUNEL?

Accepted Answer

La permeabilización permite que los reactivos TUNEL, particularmente la enzima TdT, penetren en el núcleo celular y accedan al ADN fragmentado. El tratamiento con Proteinasa K durante 5-15 minutos a 37°C crea poros en las membranas celulares, permitiendo que la enzima llegue a su sustrato dentro del núcleo.

Question 5

¿Cómo pueden los investigadores usar la tinción TUNEL para estudiar la apoptosis en enfermedades?

Accepted Answer

Los investigadores aplican la tinción TUNEL para examinar la apoptosis en varios contextos de enfermedad. Por ejemplo, los científicos la utilizan para evaluar la capacidad de respuesta de los tumores a los medicamentos al tratar muestras de tumores humanos con compuestos experimentales y medir el aumento de la apoptosis. La tinción TUNEL cuantifica la muerte celular al contar el porcentaje de células TUNEL positivas en secciones de tejido.

Question 6

¿Qué papel juegan las caspasas en la iniciación de la fragmentación del ADN?

Accepted Answer

Las caspasas son enzimas proteolíticas presentes en el citosol que ejecutan la apoptosis al escindir proteínas celulares. Activan la desoxirribonucleasa activada por caspasa (CAD) deshaciéndola de su inhibidor ICAD. Una vez activada, CAD entra en el núcleo y escinde el ADN cromosómico, produciendo el ADN fragmentado que los ensayos TUNEL detectan.

Question 7

¿Qué indica la tinción positiva de TUNEL sobre las células en una muestra de tejido?

Accepted Answer

Las células TUNEL positivas están experimentando apoptosis y contienen ADN fragmentado con extremos cortados marcados por dUTP fluorescente. Estas células aparecen fluorescentes bajo microscopía e indican muerte celular programada. El conteo de células TUNEL positivas proporciona una medida cuantitativa de apoptosis que ocurre en una sección de tejido.

El ensayo TUNEL - Cuestionario de evaluación