El ensayo de bioluminiscencia del ATP

The ATP Bioluminescence Assay

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Cell Biology

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The ATP Bioluminescence Assay

4.3: The Transwell Migration Assay

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08:32 min

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April 30, 2023

Overview

En luciérnagas, la enzima luciferase convierte un compuesto llamado luciferin en oxyluciferin y produce como resultado la luz o “luminiscencia”. Esta reacción requiere energía derivada del ATP para proceder, por lo que los investigadores han aprovechado de la interacción de luciferin luciferasa para medir los niveles de ATP en las células. Dado el papel del ATP como moneda de la célula de energía, el ensayo de bioluminiscencia de ATP puede proporcionar la penetración en el metabolismo celular y la salud general de la célula.

En este video, Zeus habla sobre respiración celular, específicamente revisar cómo el metabolismo de la glucosa resulta en la producción de ATP. Esto es seguido por los principios de la prueba de bioluminiscencia de ATP y un protocolo generalizado de esta técnica. Por último, un estudio de cómo los investigadores actualmente están usando el ensayo de bioluminiscencia de ATP para evaluar viabilidad celular en una variedad de condiciones experimentales.

Procedure

El ensayo de bioluminiscencia de ATP es una técnica común utilizada para cuantificar los niveles de ATP y detectar las células vivas, metabólicamente activas. ATP o trifosfato de adenosina es la principal fuente de energía para todos los organismos vivos, y por “todos” nos referimos a todos. A nivel celular, se genera ATP a través de un conjunto de procesos metabólicos que se llama respiración celular.

Hoy, analizaremos brevemente las vías implicadas en la respiración celular. A continuación, a introducir los principios de la prueba de bioluminiscencia de ATP y pasar por un protocolo paso a paso para realizar este método. Por último, veremos cómo los científicos están aplicando esta técnica en su investigación actual.

Permite comenzar con la introducción de la respiración celular. Este fenómeno implica varios procesos metabólicos, pero nos centraremos en la que uno trata de metabolismo de la glucosa.

En el citoplasma, la vía de glucólisis convierte la glucosa en piruvato y en el proceso genera dos moléculas de ATP. Piruvato es transportado a la mitocondria, donde se convierte en acetil coenzima A, un proceso que también se genera dióxido de carbono. Mientras que en la mitocondria, acetil-coenzima A entonces entra el ácido tricarboxílico o ciclo TCA, durante el cual otra vez se genera dióxido de carbono, como son las moléculas de alta energía del NADH y FADH2. Estas moléculas, en definitiva, “llevan” electrones en la cadena de transporte de electrones o ETC.

Dentro de lo etc., los electrones son transferidos secuencialmente entre complejos de diferentes proteínas en la membrana mitocondrial interna, antes de convertir el oxígeno al agua. Durante este proceso, los protones son “bombeados” en el espacio del intermembrane de mitocondrias. ATP se produce realmente cuando estos protones hacia la matriz mitocondrial a medida que pasan a través de una proteína llamada sintasa de ATP. Juntos, el ciclo TCA y etc. como resultado la síntesis de 36 moléculas de ATP. Degradación de otras moléculas nutrientes, como grasas y proteínas, puede también alimentar en el ciclo TCA y ETC, llevando a producción de ATP.

Ahora que sabemos cómo las células generan ATP, vamos a aprender acerca de los principios detrás del ensayo de bioluminiscencia de ATP, que se utiliza comúnmente para medir los niveles intracelulares de esta molécula.

Estructuralmente, la ATP tiene una base de adenina, un azúcar ribosa y tres grupos fosfato, el último de los cuales está conectado por enlaces de alta energía. Estos bonos de liberan energía cuando se rompen, y el ensayo de bioluminiscencia de ATP aprovecha esta energía.

Básicamente, este análisis requiere el luciferin compuesto, que se obtiene de “brillantes” organismos como luciérnagas, y su correspondiente enzima catalizador llamada luciferasa. En presencia de oxígeno, luciferasa deriva energía de ATP y convierte luciferin en oxyluciferin. Subproductos de esta reacción son pirofosfato, que es dos grupos fosfato de ATP — conversión a Adenosín Monofosfato o AMP, dióxido de carbono y luz o luminiscencia. Luminiscencia es leída por un luminómetro, una máquina que cuantifica la emisión de luz. Puesto que la cantidad de luminiscencia producida es directamente proporcional a la cantidad de ATP, es un buen indicador de viabilidad celular y el metabolismo.

Ahora que usted entiende los principios de la prueba de bioluminiscencia de ATP, vamos a esbozar un protocolo general.

En primer lugar, las células se siembran en una placa de 96 pocillos que contienen medios de cultivo. Las células se platean en varias densidades por triplicado, para tener en cuenta la variación de la densidad-dependiente. Puesto que los pozos más externo no están rodeados de otros pozos en los cuatro lados, la tasa de temperatura y la evaporación en estos pozos puede ser variable. Por lo tanto, las células no se platean en los pozos de exteriores, y en cambio están llenas de agua para evitar la variación todo el plato de evaporación y temperatura que puede afectar la reacción. Las placas se incuban luego durante la noche a 37° C para permitir que las células se adhieren a las placas de cultura.

Luego, que se quita los medios de comunicación, luciferasa y luciferin se añaden a cada pocillo y la placa se coloca en un agitador durante 5-15 minutos para facilitar la reacción. A continuación, una porción de la mezcla de cada pozo se transfiere a una placa de 96 pocillos blanca; a menudo se utilizan placas blancas reflejan la luz hacia arriba, lo que permite una lectura más precisa de la luminescencia. Además, las burbujas deben evitarse, pues puede interferir con los análisis posteriores. Como la señal de luminiscencia puede disminuir con el tiempo, la placa se lee dentro de 10-12 minutos en un luminómetro.

Para analizar los resultados de luminómetro, se calcula un valor promedio de la luminescencia de pozos con la misma densidad de la célula. Comparando los datos de luminosidad obtenidos de esta manera las muestras sanas de control y células tratadas, los investigadores pueden evaluar los efectos de un tratamiento específico sobre la viabilidad y el metabolismo, específicamente mediante la detección de luminiscencia disminuida en el grupo experimental.

Ahora que has visto cómo realizar un ensayo de bioluminiscencia de ATP, vamos a discutir sus aplicaciones de la investigación.

Los científicos siempre están tratando de desarrollar nuevos antivirales que no dañar o matar las células del huésped. En este estudio, las células mamíferas se siembran en una placa de pocillos e infectadas con un virus específico. Varios compuestos antivirales fueron agregados a estas muestras, y se generaron curvas de concentración-respuesta de registro para calcular la concentración efectiva 50 o CE50. EC50 es la concentración del compuesto en el que la célula viabilidad es 50 por ciento. Este es un parámetro utilizado para evaluar la citotoxicidad del compuesto.

Niveles de ATP también pueden producir pistas acerca de la actividad mitocondrial en diversas condiciones. Aquí, el ensayo de bioluminiscencia de ATP se realizó sobre los preparativos de la mitocondria derivado de hígado de roedor y las células musculares, que ayudó a los investigadores a evaluar el alcance de la función mitocondrial en los tejidos normales. Lo importante, este protocolo podría ampliarse para proporcionar una manera de examinar la función mitocondrial en Estados de enfermedad.

Los científicos también están utilizando este análisis para investigar posibles tratamientos contra el cáncer en sistemas in vivo . En este ejemplo, las células humanas del tumor fueron modificadas para luciferase expresa e inyectadas en los cerebros de ratones vivos. Después de que las células del tumor se establecieron en estos animales, fueron tratados con un fármaco contra el cáncer. Un análisis posterior en vivo ATP bioluminiscencia reveló que las células tumorales en ratones expuestos a drogas tenían niveles más bajos de ATP.

Sólo ha visto la introducción de Zeus para el ensayo de bioluminiscencia de ATP. Ahora debe estar familiarizado con las vías de respiración celular y el protocolo utilizado para medir el ATP, que es el producto final de estas vías. El ensayo de bioluminiscencia de ATP sirve como una herramienta de proyección excelente para los biólogos celulares interesado en estudiar el efecto de factores fisiológicos y patológicos en el metabolismo celular y la viabilidad. ¡Como siempre, gracias por ver!

Transcript

The ATP bioluminescence assay is a common technique used to quantify ATP levels and detect living, metabolically active cells. ATP or adenosine triphosphate is the primary source of energy for all living organisms, and by “all” we mean ALL. At the cellular level, ATP is generated through a set of metabolic processes called cellular respiration.

Today, we’ll briefly discuss the pathways involved in cellular respiration. Next, we’ll introduce the principles behind the ATP bioluminescence assay, and go through a step-by-step protocol for performing this method. Finally, we’ll see how scientists are applying this technique in their current research.

Lets begin by introducing cellular respiration. This phenomenon involves several metabolic processes, but we’ll focus on the one dealing with glucose metabolism.

In the cytoplasm, the glycolysis pathway converts glucose to pyruvate, and in the process generates two ATP molecules. Pyruvate is transported into the mitochondria, where it is converted to acetyl-coenzyme A—a process that also generates carbon dioxide. While still in the mitochondria, acetyl-coenzyme A then enters the tricarboxylic acid or TCA cycle, during which carbon dioxide is again generated, as are the high-energy molecules of NADH and FADH2. These molecules ultimately “carry” electrons into the electron transport chain or ETC.

Within the ETC, electrons are sequentially transferred between different protein complexes in the inner mitochondrial membrane, before converting oxygen to water. During this process, protons are “pumped” into the intermembrane space of mitochondria. ATP is actually produced when these protons enter back into the mitochondrial matrix as they pass through a protein called ATP synthase. Together, the TCA cycle and ETC result in the synthesis of 36 ATP molecules. Breakdown of other nutrient molecules, such as fats and proteins, can also feed into the TCA cycle and ETC, leading to ATP production.

Now that we know how cells generate ATP, let’s learn about the principles behind the ATP bioluminescence assay, which is commonly used to measure intracellular levels of this molecule.

Structurally, ATP has an adenine base, a ribose sugar, and three phosphate groups—the latter of which are connected by high-energy bonds. These bonds release energy when broken, and the ATP bioluminescence assay capitalizes on this energy.

Basically, this assay requires the luciferin compound, which is obtained from “glowing” organisms like fireflies, and its corresponding catalyst enzyme called luciferase. In the presence of oxygen, luciferase derives energy from ATP and converts luciferin into oxyluciferin. Byproducts of this reaction are pyrophosphate, which is two phosphate groups obtained from ATP—converting it to adenosine monophosphate or AMP—carbon dioxide, and light or luminescence. Luminescence is read by a luminometer, a machine that quantifies light emission. Since the amount of luminescence produced is directly proportional to the amount of ATP, this serves a good indicator of cell viability and metabolism.

Now that you understand the principles behind the ATP bioluminescence assay, let’s outline a general protocol.

First, cells are seeded in a 96-well plate containing culture media. Cells are plated at various densities in triplicate, to account for density-dependent variation. Since the outer-most wells are not surrounded by other wells on all four sides, the temperature and evaporation rate in these wells may be variable. Therefore, cells are not plated in the outer wells, and instead they are filled with water to avoid plate-wide evaporation and temperature variation that may affect the reaction. Plates are then incubated overnight at 37°C to allow the cells to adhere to the culture plates.

Then, the media is removed, luciferase and luciferin are added to each well, and the plate is placed on a shaker for 5–15 minutes to facilitate the reaction. Next, a portion of the mixture from each well is transferred to a white 96-well plate; white plates are often used as they reflect light upwards, allowing for more accurate luminescence readings. In addition, bubbles should be avoided, as they could interfere with subsequent analyses. As the luminescence signal can decrease over time, the plate is read within 10–12 minutes on a luminometer.

To analyze the luminometer results, an average luminescence value is calculated from wells with the same cell density. By comparing luminescence data collected in this manner from both healthy control samples and treated cells, researchers can evaluate the effects of a specific treatment on viability and metabolism—specifically by looking for decreased luminescence in the experimental group.

Now that you’ve seen how to perform an ATP bioluminescence assay, let’s discuss its research applications.

Scientists are always trying to develop new antivirals that don’t harm or kill host cells. In this study, mammalian cells were seeded in a multiwell plate and infected with a specific virus. Various antiviral compounds were added to these samples, and log concentration-response curves were generated to calculate the effective concentration fifty or EC50. EC50 is the concentration of compound at which cell viability is 50 percent. This is a commonly used parameter to assess a compound’s cytotoxicity.

ATP levels can also yield clues about mitochondrial activity under various conditions. Here, the ATP bioluminescence assay was performed on preparations of mitochondria derived from rodent liver and muscle cells, which helped researchers assess the extent of mitochondrial function in normal tissues. Importantly, this protocol could be extended to provide a way to examine mitochondrial function in disease states.

Scientists are also using this assay to investigate potential cancer treatments in in vivo systems. In this example, human tumor cells were modified to express luciferase and injected into the brains of living mice. After the tumor cells became established in these animals, they were treated with an anti-cancer drug. A subsequent in vivo ATP bioluminescence assay revealed that tumor cells in drug-exposed mice had lower ATP levels.

You’ve just watched JoVE’s introduction to the ATP bioluminescence assay. You should now be familiar with the cellular respiration pathways and the protocol used to measure ATP, which is the end product of these pathways. The ATP bioluminescence assay serves as an excellent screening tool for cell biologists interested in studying the effect of physiological and pathological factors on cell metabolism and viability. As always, thanks for watching!

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