4.11: El ensayo de bioluminiscencia del ATP

El ensayo de bioluminiscencia de ATP es una técnica común utilizada para cuantificar los niveles de ATP y detectar células vivas metabólicamente activas. El ATP o trifosfato de adenosina es la principal fuente de energía para todos los organismos vivos, y por ?todos? nos referimos a TODOS. A nivel celular, el ATP se genera a través de un conjunto de procesos metabólicos llamados respiración celular.

Hoy, discutiremos brevemente las vías involucradas en la respiración celular. A continuación, presentaremos los principios detrás del ensayo de bioluminiscencia de ATP y repasaremos un protocolo paso a paso para realizar este método. Por último, veremos cómo los científicos están aplicando esta técnica en sus investigaciones actuales.

Comencemos introduciendo la respiración celular. Este fenómeno implica varios procesos metabólicos, pero nos centraremos en el que tiene que ver con el metabolismo de la glucosa.

En el citoplasma, la vía de glucólisis convierte la glucosa en piruvato y, en el proceso, genera dos moléculas de ATP. El piruvato se transporta a las mitocondrias, donde se convierte en acetil-coenzima A, un proceso que también genera dióxido de carbono. Mientras aún se encuentra en las mitocondrias, la acetil-coenzima A entra en el ciclo del ácido tricarboxílico o TCA, durante el cual se genera nuevamente dióxido de carbono, al igual que las moléculas de alta energía de NADH y FADH2. Estas moléculas, en última instancia, ?transportan? electrones en la cadena de transporte de electrones o ETC.

Dentro del ETC, los electrones se transfieren secuencialmente entre diferentes complejos de proteínas en la membrana mitocondrial interna, antes de convertir el oxígeno en agua. Durante este proceso, los protones son ?bombeados? en el espacio intermembrana de las mitocondrias. En realidad, el ATP se produce cuando estos protones vuelven a entrar en la matriz mitocondrial a medida que pasan a través de una proteína llamada ATP sintasa. Juntos, el ciclo del TCA y el ETC dan como resultado la síntesis de 36 moléculas de ATP. La descomposición de otras moléculas de nutrientes, como las grasas y las proteínas, también puede alimentar el ciclo del TCA y el ETC, lo que conduce a la producción de ATP.

Ahora que sabemos cómo las células generan ATP, conozcamos los principios detrás del ensayo de bioluminiscencia de ATP, que se usa comúnmente para medir los niveles intracelulares de esta molécula.

Estructuralmente, el ATP tiene una base de adenina, un azúcar ribosa y tres grupos fosfato, el último de los cuales está conectado por enlaces de alta energía. Estos enlaces liberan energía cuando se rompen, y el ensayo de bioluminiscencia de ATP aprovecha esta energía.

Básicamente, este ensayo requiere el compuesto de luciferina, que se obtiene de organismos "brillantes" como las luciérnagas, y su correspondiente enzima catalizadora llamada luciferasa. En presencia de oxígeno, la luciferasa obtiene energía del ATP y convierte la luciferina en oxiluciferina. Los subproductos de esta reacción son el pirofosfato, que son dos grupos de fosfato obtenidos a partir del ATP, convirtiéndolo en monofosfato de adenosina o dióxido de carbono AMP, y la luz o luminiscencia. La luminiscencia es leída por un luminómetro, una máquina que cuantifica la emisión de luz. Dado que la cantidad de luminiscencia producida es directamente proporcional a la cantidad de ATP, esto sirve como un buen indicador de la viabilidad y el metabolismo celular.

Ahora que comprende los principios detrás del ensayo de bioluminiscencia de ATP, describamos un protocolo general.

Primero, las células se siembran en una placa de 96 pocillos que contiene medios de cultivo. Las celdas se colocan en varias densidades por triplicado, para tener en cuenta la variación dependiente de la densidad. Dado que los pozos más exteriores no están rodeados por otros pozos en los cuatro lados, la temperatura y la tasa de evaporación en estos pozos pueden ser variables. Por lo tanto, las celdas no se colocan en los pozos exteriores, sino que se llenan de agua para evitar la evaporación de toda la placa y la variación de temperatura que puede afectar la reacción. Luego, las placas se incuban durante la noche a 37? C para permitir que las células se adhieran a las placas de cultivo.

A continuación, se retira el medio, se añade luciferasa y luciferina a cada pocillo, y se coloca la placa en un agitador durante 5-15 minutos para facilitar la reacción. A continuación, una porción de la mezcla de cada pocillo se transfiere a una placa blanca de 96 pocillos; A menudo se utilizan placas blancas, ya que reflejan la luz hacia arriba, lo que permite lecturas de luminiscencia más precisas. Además, se deben evitar las burbujas, ya que podrían interferir con los análisis posteriores. Como la señal de luminiscencia puede disminuir con el tiempo, la placa se lee en un plazo de 10 a 12 minutos en un luminómetro.

Para analizar los resultados del luminómetro, se calcula un valor medio de luminiscencia a partir de pozos con la misma densidad de celdas. Al comparar los datos de luminiscencia recopilados de esta manera tanto de muestras de control sanas como de células tratadas, los investigadores pueden evaluar los efectos de un tratamiento específico sobre la viabilidad y el metabolismo, específicamente buscando una disminución de la luminiscencia en el grupo experimental.

Ahora que ha visto cómo realizar un ensayo de bioluminiscencia de ATP, analicemos sus aplicaciones de investigación.

Los científicos siempre están tratando de desarrollar nuevos antivirales que no dañen ni maten las células huésped. En este estudio, las células de mamíferos se sembraron en una placa de pocillos múltiples y se infectaron con un virus específico. A estas muestras se les añadieron diversos compuestos antivirales y se generaron curvas logarítmicas de concentración-respuesta para calcular la concentración efectiva cincuenta o CE50. EC50 es la concentración de compuesto a la que la viabilidad celular es del 50 por ciento. Este es un parámetro comúnmente utilizado para evaluar la citotoxicidad de un compuesto.

Los niveles de ATP también pueden proporcionar pistas sobre la actividad mitocondrial en diversas condiciones. Aquí, el ensayo de bioluminiscencia de ATP se realizó en preparaciones de mitocondrias derivadas de células hepáticas y musculares de roedores, lo que ayudó a los investigadores a evaluar el alcance de la función mitocondrial en tejidos normales. Es importante destacar que este protocolo podría ampliarse para proporcionar una forma de examinar la función mitocondrial en estados de enfermedad.

Los científicos también están utilizando este ensayo para investigar posibles tratamientos contra el cáncer en sistemas in vivo. En este ejemplo, se modificaron células tumorales humanas para expresar luciferasa y se inyectaron en el cerebro de ratones vivos. Después de que las células tumorales se establecieron en estos animales, se trataron con un medicamento contra el cáncer. Un ensayo posterior de bioluminiscencia de ATP in vivo reveló que las células tumorales de los ratones expuestos al fármaco tenían niveles más bajos de ATP.

Acabas de ver la introducción de JoVE al ensayo de bioluminiscencia ATP. Ahora debería estar familiarizado con las vías de respiración celular y el protocolo utilizado para medir el ATP, que es el producto final de estas vías. El ensayo de bioluminiscencia ATP sirve como una excelente herramienta de cribado para los biólogos celulares interesados en estudiar el efecto de los factores fisiológicos y patológicos en el metabolismo y la viabilidad celular. Como siempre, ¡gracias por mirar!