Espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN)

La espectroscopia de resonancia magnética nuclear, o RMN, es un método importante para determinar la estructura molecular y la pureza de las muestras en química orgánica.

En la espectroscopia de RMN, las muestras se exponen a un fuerte campo magnético. Al exponerse, ciertos núcleos hacen transición, o resuenan, entre niveles de energía discretos. La brecha de energía entre estos niveles se puede medir y visualizar como espectros. Estos datos se pueden utilizar para dilucidar la estructura química de la muestra.

No todos los núcleos tienen las propiedades necesarias para ser activos por RMN. Los isótopos comunes estudiados son 1H, 2H, 13C, 19F y 31P.

Este video presentará los principios detrás de la RMN, paso a paso a través de preparaciones de ejemplo de muestras de RMN de diferentes etapas de una reacción química y discutirá varias aplicaciones.

En el instrumento de RMN, se utilizan nitrógeno líquido y helio para enfriar un imán superconductor. El imán aplica un campo magnético constante a una muestra. Dentro de la muestra, los núcleos atómicos con un número impar de protones y/o neutrones se alinearán con el campo, adoptando un estado de baja energía, o contra él, adoptando un estado de alta energía.

La diferencia de energía entre los dos niveles es la frecuencia de resonancia, que depende de la intensidad del campo aplicado y del tipo de núcleo. Para los imanes utilizados en RMN, el valor está en el rango de radiofrecuencia o RF.

Una bobina de RF excita la muestra con un pulso de radiofrecuencia, moviendo los núcleos de baja energía al estado superior, antes de volver a ella. La bobina detecta estos cambios en la magnetización, que se muestran como picos.

La fuerza de la RMN radica en su capacidad para distinguir los núcleos, en este caso el hidrógeno, por su entorno químico. Los electrones de los átomos vecinos bloquearán, o "protegerán", los núcleos de parte del campo magnético. Este campo efectivo cambia la frecuencia de resonancia para los núcleos particulares, lo que se denomina desplazamiento químico. En el etanol, los protones de metileno, hidroxilo y metilo tienen frecuencias de resonancia únicas. La determinación del área debajo de cada pico dilucida el número de cada tipo de protón.

Dado que los instrumentos con diferentes intensidades magnéticas cambiarán las frecuencias de resonancia, se hace referencia a una molécula estándar agregada a la muestra, a menudo tetrametilsilano o TMS. El desplazamiento químico de las frecuencias es muy pequeño, a menudo se informa en partes por millón, o ppm.

Cuando se utiliza un imán fuerte con alta resolución, los picos a veces se dividen en subpicos. Esto es causado por los núcleos vecinos, algunos de los cuales están alineados con el campo magnético, otros en contra; cambiando aún más el campo efectivo aplicado a los núcleos. En el etanol, los 2 protones de metileno dividen el pico de metilo dos veces en un triplete, y los 3 protones de metilo dividen el pico de metileno tres veces en un cuarteto. La distancia de la división, o acoplamiento en J, está relacionada con la distancia de los núcleos, lo que ayuda en el descubrimiento cualitativo.

Ahora que comprende los principios básicos detrás de la RMN, revisemos un procedimiento de ejemplo que utiliza la RMN de protones para monitorear la síntesis de chalcona a partir de un aldehído y una cetona.

Comience usando una pipeta Pasteur para agregar una pequeña cantidad del material de partida a un vaso de precipitados. Pase a la campana extractora y diluya el material de partida con 0,7 ml de disolvente deuterado. Se utilizan disolventes deuterados, ya que la frecuencia de resonancia del deuterio está fuera del rango de los protones.

Utilice una pipeta Pasteur para añadir 0,7 ml del material de partida diluido en un tubo de RMN limpio de 5 mm, llenando los 4,5 a 5 cm inferiores. Tape el tubo de RMN y etiquételo. Agite suavemente el tubo, teniendo cuidado de evitar el contacto entre la muestra y el tapón. Luego, inserte el tubo en la ruleta.

Limpie el exterior del tubo y la centrifugadora con 2-propanol y pañuelos de laboratorio. A continuación, coloque el conjunto de muestra en el medidor de profundidad y calibre la profundidad de inserción.

Después de la calibración, cargue el conjunto de muestras en el espectrómetro de RMN, ya sea manualmente o utilizando un muestreador automático. Por último, utilice una estación de trabajo informática para adquirir el espectro de RMN.

Genere espectros de RMN utilizando este procedimiento para cada uno de los materiales de partida de la reacción. Para la síntesis de chalcona, se deben generar espectros tanto para el metoxibenzaldehído como para el metilacetofenona.

A continuación, realice la síntesis de la muestra combinando los materiales de partida y los reactivos en un matraz para comenzar la reacción.

A intervalos de 30 minutos, retire una pequeña alícuota de la mezcla de reacción con una pipeta Pasteur y agregue 3 gotas a un tubo de RMN limpio.

Diluya este producto de reacción crudo con solvente deuterado y prepárese para la RMN utilizando el procedimiento descrito anteriormente.

A medida que avanza la reacción, se formará un precipitado amarillo. Cuando se complete la reacción, lave y filtre el precipitado y genere espectros de RMN para el producto de reacción purificado.

Ahora que hemos generado espectros de RMN en cada etapa de la reacción química, vamos a analizarlos.

Los picos de los espectros de RMN para cada uno de los materiales de partida se asignan a diferentes grupos de protones dentro de la molécula de acuerdo con sus cambios químicos y el número de protones que contribuyen a cada pico. Aquí, asignamos los 4 grupos principales de protones para metilacetofenona y metoxibenzaldehído, observando el pico de aldehído entre 9,5 y 10,5 ppm. Al comparar los espectros de RMN de los productos crudos de la reacción en diferentes puntos temporales, se dilucida la evolución de la reacción química que sintetiza la chalcona. Por ejemplo, el pico de aldehído del material de partida, metoxibenzaldehído, todavía está presente después de 30 minutos de reacción, pero desaparece por completo después de 3 h, lo que significa la finalización de la reacción.

Al examinar el espectro del producto purificado, podemos asignar cada pico a un grupo de protones en la estructura de la chalcona. Por ejemplo, examinando los picos 3 y 4 vemos que sus integrales son ambas uno, correspondiendo a grupos que contienen solo un protón.

Los picos 3 y 4 son los llamados dobletes que indican un protón vecino. Ambos tienen constantes de acoplamiento J de 16 Hz, lo que sugiere que los protones están situados a través de un doble enlace E. Al asignar todos los picos de RMN del producto de reacción purificado, confirmamos la síntesis de una chalcona pura.

La espectroscopia de RMN tiene una amplia gama de aplicaciones y se utiliza en muchos campos científicos y médicos.

En esta aplicación, la RMN de protones se utiliza para verificar la síntesis y la estructura tanto del diamidocarbeno como de la mononoamidocarbina, cuyos espectros de RMN tienen diferentes patrones de división de picos. Estos carbenos también generaron productos de reacción aparentemente diferentes cuando se combinaron con fósforo blanco; DAC1 generó un producto de reacción de color rojo brillante, mientras que MAAC2 produjo un producto de color naranja brillante. Estas diferencias en los productos de reacción se confirmaron utilizando una segunda aplicación de RMN, 31P? RMN, que genera espectros basados en las diferencias en la frecuencia de resonancia de los núcleos de fósforo.

En este caso, se utilizaron imágenes de resonancia magnética nuclear, o IRM, para generar un mapa anatómico del cerebro y seleccionar las regiones cerebrales de interés. A continuación, se utilizó la espectroscopia de RMN para generar espectros de metabolitos clave. Finalmente, mediante resonancia magnética se evaluaron los cambios en el metabolismo cerebral en diferentes condiciones experimentales.

En esta aplicación, se utilizó RMN para analizar las propiedades de unión y proponer una estructura 3D de un péptido de unión al cobre. En primer lugar, se compararon los espectros de RMN para los estados no unidos y unidos al cobre del péptido. A continuación, utilizando técnicas de RMN bidimensional más avanzadas, se evaluaron diferentes posibles conformaciones de la estructura del péptido. Finalmente, estas restricciones estructurales derivadas de la RMN se utilizaron para desarrollar una estructura tridimensional propuesta para el péptido no unido.

Acabas de ver la introducción de JoVE al análisis de RMN. Ahora debe comprender los principios subyacentes detrás de la generación y el análisis de espectros de RMN, así como un procedimiento para la preparación de muestras de RMN.

¡Gracias por mirar!