Name: Isolatie en karakterisatie van extracellulaire blaasjes van volwassen Schistosoma japonicum (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: Leer de isolatie van extracellulaire blaasjes uit het kweekmedium van volwassen Schistosoma japonicum. Deze methode minimaliseert stress op de parasieten en levert zuivere EV's voor parasitologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Deze studie was, gedeeltelijk of in zijn geheel, ondersteund door nationale Natural Science Foundation van China (31472187 en 31672550) en de landbouwkunde en het programma van de innovatie van de technologie van de Chinese Academie van landbouwwetenschappen.

Alle dierproeven zijn goedgekeurd door de lokale ethische commissie van Shanghai veterinaire Research Institute, Chinese Academie van landbouwwetenschappen (toestaan nummer: SHVRIAU-14-0101).
1. in Vitro cultuur van Schistosomes
Opmerking: Schistosomes vertegenwoordigen een biohazard. Werknemers moeten het dragen van latex handschoenen helemaal tijden wanneer behandeling van wormen, schistosomal schorsingen of andere biologische materialen aanverwante. Nieuw-Zeeland konijnen waren besmet met ~ 2.000 cercariae via abdominale blootstelling. Schistosomes in de lever stadium werden verzameld uit konijnen die zijn besmet met S. japonicum cercariae op 28 dagen na infectie door perfusie van de lever en de lymfklieren aders. De procedures van worm collectie hebben aangeroepen in eerdere publicaties rapportage studies in muizen18.
<ol><li>Verzamelen van parasieten in een bekerglas van 500 mL. Was ze grondig en voorzichtig 3 x met 200 mL voorverwarmd (37 ° C) PBS (pH 7.4).</li>
	<li>Aparte ~ 200 worm paren voor elke petrischaal 90 mm. Daarna wassen de parasieten grondig en voorzichtig 2 x met 50 mL voorverwarmd (37 ° C) RPMI-1640 kweekmedium dat 100 U van penicilline en 100 mg/mL streptomycine.</li>
	<li>Handhaven van parasieten in voorverwarmde RPMI-1640-kweekmedium zonder antibiotica bij 37 ° C minder dan 5% CO,2 bij een dichtheid van ~ 5 worm paren /mL voor 2 h in 90 mm Petri schotel 40 mL. Notities: Het RPMI 1640-medium mag geen serum bevatten, anders exogene extracellulaire vesikel zal worden ingevoerd.</li>
</ol>2. pre-behandelde voorwaarde Media
<ol><li>Verzamel het kweekmedium en centrifugeer dan het medium bij 4 ° C bij 2.000 × g gedurende 30 min tegmental puin worm te verwijderen van de eieren.</li>
	<li>Het supernatant overbrengen in een verse buis en filtert vervolgens de oplossing met behulp van een filter van de spuit 0,22 µm.</li>
	<li>Verzamelen van de gefilterde oplossing in een dialyzed zak (moleculair gewicht cut-off: 3.5kD) en klik vervolgens dialyze de oplossing om met 8% PEG8000-oplossing bij 4 ° C's nachts. Notities: Deze stap is belangrijk voor de verrijking van SjEVs voor het verhogen van het rendement van de SjEVs isolatie.</li>
</ol>3. isolatie van SjEVs
<ol><li>Breng de dialyzed oplossing over in een nieuwe buis en voeg vervolgens 0.5 volumes van het totale exosome isolatie reagens.</li>
	<li>Meng de oplossing goed door de vortexing of op en neer pipetteren teneinde homogeniteit van de oplossing te waarborgen.</li>
	<li>Incubeer het mengsel bij 2 ° C tot 8 ° C's nachts.</li>
	<li>Centrifugeer het mengsel bij 15.000 × g gedurende 1 uur bij 2 ° C tot 8 ° C.</li>
	<li>Gecombineerd en verwijder het supernatant. Notities: EVW bevinden zich in de pellet aan de onderkant van de buis (niet zichtbaar in de meeste gevallen).</li>
	<li>Resuspendeer de pellet EVs in 2 mL PBS en sla de EVs-oplossing bij-80 ° C tot verdere analyse.</li>
</ol>4. karakterisering van het EVW door het westelijke bevlekken
<ol><li>Bepaal de eiwitconcentratie van het SjEVs monster, bijvoorbeeld door BCA assay.</li>
	<li>10-20 µg van het EVW in 22.5 µL RIPA buffer voor te bereiden. Voeg vervolgens 7,5 µL van 4 x laden buffer en warmte gedurende 5 minuten bij 95 ° C.</li>
	<li>Afzonderlijke SjEVs proteïnen door 12% SDS-pagina gel.</li>
	<li>Breng de eiwitten aan Membraan PVDF en vervolgens sonde met anti-CD63 antilichamen (1:1, 000 verdunning), gevolgd door het sonderen met anti-konijn IgG-HRP (1:5, 000 verdunning).</li>
	<li>Gebruik van ECL detectie reagens voor membraan ontwikkeling en detecteren de signalen door een chemiluminescentie imaging systeem.</li>
</ol>5. de karakterisering van het EVW door transmissie-elektronenmicroscopie
<ol><li>Voeg 2 µL van geïsoleerde SjEVs tot 200 mesh formvar beklede rasters en dan laat ze drogen bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Vlek met 2% Phosphotungstic zuur voor 1 min en vervolgens laat ze drogen bij kamertemperatuur.</li>
	<li>De rasters op de monsterhouder van de transmissie-elektronenmicroscoop laden en blootgesteld aan een 80 kV elektronenstraal voor beeldopname.</li>
</ol>6. SjEVs Label met PKH67 en cel opname Assay
Notities: Alle volgende stappen werden uitgevoerd bij kamertemperatuur (20-25 ° C), tenzij anders aangegeven.
<ol><li>Pipetteer 5 µg SjEVs oplossing in een conische bodem polypropyleen buis en pas het volume aan 12 mL door RPMI 1640 medium toe te voegen.</li>
	<li>Centrifugeer het SjEVs bij 110.000 × g gedurende 90 min bij 4 ° C om SjEVs pellet.</li>
	<li>Na het centrifugeren, moet u zorgvuldig de bovendrijvende substantie gecombineerd. Opmerking: De PKH67 ethanolbevattend kleurstof moet niet worden toegevoegd direct naar de SjEV pellet, aangezien dit in heterogene kleuring en verminderde levensvatbaarheid resulteren zou.</li>
	<li>Bereid een 2 x EV schorsing oplossing door toevoeging van 1 mL verdunningsmiddel C naar de SjEV pellet; om ervoor te zorgen volledige dispersie, resuspendeer met zachte pipetteren.</li>
	<li>Net voordat hij kleuring in verdunningsmiddel C, stelt u een vers 2 x kleurstof oplossing door toevoeging van 2 µL van de PKH67 ethanolbevattend kleurstof oplossing aan 1 mL verdunningsmiddel C in een centrifugebuis polypropyleen en vermenging goed te verspreiden.</li>
	<li>Voeg snel de 1 mL 2 x EV schorsing (stap 6.4) 1 ml 2 x kleurstof oplossing (stap 6.5) en onmiddellijk meng het monster door pipetteren.</li>
	<li>Laat het mengsel bij kamertemperatuur gedurende 4 minuten inwerken.</li>
	<li>Stop de kleuring door toevoeging van 4 mL FBS en vervolgens Incubeer gedurende 1 minuut.</li>
	<li>Toevoegen RPMI1640 medium om het volume aan 12 mL en vervolgens Centrifugeer bij 110.000 × g bij 4 ° C voor 90 min.</li>
	<li>Verwijder het supernatant en RPMI1640 medium om resuspendeer de PKH67 met het label SjEV pellets toevoegen.</li>
	<li>Centrifugeer bij 110.000 × g bij 4 ° C voor 90 min te wassen eenmaal en voegt u PBS om resuspendeer de SjEVs pellets.</li>
</ol>7. SjEVs-Cell opname Assay
<ol><li>Zaad zoogdiercellen zoals NCTC kloon 1469 cellen of HEK293T cellen in 6-Wells-platen (2 × 105 cellen per putje) en 's nachts de cellen cultuur.</li>
	<li>Voeg 5 µg SjEVs PKH67-geëtiketteerd en vervolgens cultuur cellen bij 37 ° C gedurende 2-4 uur.</li>
	<li>Na incubatie het medium verwijderen en de cellen met PBS tweemaal wassen.</li>
	<li>Herstellen van de cellen met de 4% formaldehyde oplossing gedurende 15 minuten en twee keer meer met PBS gewassen.</li>
	<li>Vlek celkernen met 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI).</li>
	<li>Observeer de cellen met behulp van fluorescentie microscopie.</li>
</ol>

<ol><li>Tetta, C., Ghigo, E., Silengo, L., Deregibus, M. C., Camussi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+as+an+emerging+mechanism+of+cell-to-cell+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles as an emerging mechanism of cell-to-cell communication.</a> Endocrine. 44 (1), 11-19 (2013).</li>
<li>Abels, E. R., Breakefield, X. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+to+Extracellular+Vesicles%3A+Biogenesis%2C+RNA+Cargo+Selection%2C+Content%2C+Release%2C+and+Uptake%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Introduction to Extracellular Vesicles: Biogenesis, RNA Cargo Selection, Content, Release, and Uptake.</a> Cell Mol Neurobiol. 36 (3), 301-312 (2016).</li>
<li>Riaz, F., Cheng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome-like+vesicles+of+helminths%3A+implication+of+pathogenesis+and+vaccine+development%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Exosome-like vesicles of helminths: implication of pathogenesis and vaccine development.</a> Ann Transl Med. 5 (7), 175(2017).</li>
<li>Zhang, H. G., Grizzle, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+and+cancer%3A+a+newly+described+pathway+of+immune+suppression%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Exosomes and cancer: a newly described pathway of immune suppression.</a> Clin Cancer Res. 17 (5), 959-964 (2011).</li>
<li>Colombo, M., Raposo, G., Thery, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis%2C+secretion%2C+and+intercellular+interactions+of+exosomes+and+other+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 30, 255-289 (2014).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circular+RNA+is+enriched+and+stable+in+exosomes%3A+a+promising+biomarker+for+cancer+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Circular RNA is enriched and stable in exosomes: a promising biomarker for cancer diagnosis.</a> Cell Res. 25 (8), 981-984 (2015).</li>
<li>Marcilla, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+in+parasitic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles in parasitic diseases.</a> J Extracell Vesicles. 3, 25040(2014).</li>
<li>Cwiklinski, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Extracellular+Vesicles+of+the+Helminth+Pathogen%2C+Fasciola+hepatica%3A+Biogenesis+Pathways+and+Cargo+Molecules+Involved+in+Parasite+Pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">The Extracellular Vesicles of the Helminth Pathogen, Fasciola hepatica: Biogenesis Pathways and Cargo Molecules Involved in Parasite Pathogenesis.</a> Mol Cell Proteomics. 14 (12), 3258-3273 (2015).</li>
<li>Buck, A. H., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25421927">Exosomes secreted by nematode parasites transfer small RNAs to mammalian cells and modulate innate immunity.</a> Nat Commun. 5, 5488(2014).</li>
<li>Sotillo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+secreted+by+Schistosoma+mansoni+contain+protein+vaccine+candidates%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles secreted by Schistosoma mansoni contain protein vaccine candidates.</a> Int J Parasitol. 46 (1), 1-5 (2016).</li>
<li>Nowacki, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+and+small+non-coding+RNA-enriched+extracellular+vesicles+are+released+by+the+pathogenic+blood+fluke+Schistosoma+mansoni%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Protein and small non-coding RNA-enriched extracellular vesicles are released by the pathogenic blood fluke Schistosoma mansoni.</a> J Extracell Vesicles. 4, 28665(2015).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome-like+vesicles+derived+by+Schistosoma+japonicum+adult+worms+mediates+M1+type+immune-+activity+of+macrophage%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitol+Res%22%5BJournal%5D)">Exosome-like vesicles derived by Schistosoma japonicum adult worms mediates M1 type immune- activity of macrophage.</a> Parasitol Res. 114 (5), 1865-1873 (2015).</li>
<li>Koh, Y. Q., Almughlliq, F. B., Vaswani, K., Peiris, H. N., Mitchell, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome+enrichment+by+ultracentrifugation+and+size+exclusion+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci+%28Landmark+Ed%29%22%5BJournal%5D)">Exosome enrichment by ultracentrifugation and size exclusion chromatography.</a> Front Biosci (Landmark Ed). 23, 865-874 (2018).</li>
<li>Safdar, A., Saleem, A., Tarnopolsky, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+of+endurance+exercise-derived+exosomes+to+treat+metabolic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">The potential of endurance exercise-derived exosomes to treat metabolic diseases.</a> Nat Rev Endocrinol. 12 (9), 504-517 (2016).</li>
<li>Livshits, M. A., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26616523">Isolation of exosomes by differential centrifugation: Theoretical analysis of a commonly used protocol.</a> Sci Rep. 5, 17319(2015).</li>
<li>Zhu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Release+of+extracellular+vesicles+containing+small+RNAs+from+the+eggs+of+Schistosoma+japonicum%5BTitle%5D)+AND+%22Parasit+Vectors%22%5BJournal%5D)">Release of extracellular vesicles containing small RNAs from the eggs of Schistosoma japonicum.</a> Parasit Vectors. 9 (1), 574(2016).</li>
<li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+S.+japonicum+exosome-like+vesicles+reveals+their+regulatory+roles+in+parasite-host+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of S. japonicum exosome-like vesicles reveals their regulatory roles in parasite-host interactions.</a> Sci Rep. 6, 25885(2016).</li>
<li>Lewis, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schistosomiasis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Schistosomiasis.</a> Curr Protoc Immunol. , Chapter 19 Unit 19 11(2001).</li>
<li>Cheng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+miRNAs%3A+roles+in+cancer+diagnosis%2C+prognosis+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Circulating miRNAs: roles in cancer diagnosis, prognosis and therapy.</a> Adv Drug Deliv Rev. 81, 75-93 (2015).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Recente studies over EVs hebben aangetoond dat Schistosoma die EVS een belangrijke rol in9,12,16, gastheer-pathogeen interacties3,spelen. Naar verdere adres hun regelgevende taken, is het essentieel om te isoleren van EVs van schistosomes. Hier beschrijven we een alternatieve methode om SjEV te isoleren. Deze methode levert de omvang van een breed scala van SjEVs, van 100 nm tot 400 nm, in volw...

Extracellulaire blaasjes (EVs) zijn een bevolking van kleine membraan-gebonden blaasjes ingekapseld en verschillende eiwitten, lipiden, nucleïnezuren. Recente studies aangetoond dat de EVs een cruciale rol in de cel-cel communicatie, en betrokken bij de regulering van tal van fysiologische processen zijn, met inbegrip van cel ontwikkeling, immuunregulatie, angiogenese en cel migratie2, 3,4,5. Vergaren van bewijs geeft aan dat de EVs, circulerende exosomes, en hun lading miRNA mogelijke biomarkers voor bepaalde ziekten6vertegenwoordigt.
Verschillende protozoa zoals Trichomonas vaginalis, Trypanosoma cruzien Leishmania spp., hebben aangetoond te kunnen afscheiden van EVs; wormen zijn bovendien bevonden om afscheiden van EVW in levende gastheren7. Betrokken te worden bij de handhaving van de infectie, pathogeniteit8en9van de immuunregulatie is parasitaire EVs gebleken. De nieuwste studies in schistosomes beide Schistosoma mansoni (S. mansoni) 10,11 en S. japonicum12 hebben aangegeven dat volwassen schistosomes afscheiden exosome-achtige blaasjes die mogelijk deelnemen aan de functionele voorschriften van specifieke biologische processen.
Tot op heden, zijn verschillende methoden gebruikt om extracellulaire blaasjes, zoals ultracentrifugatie, ultrafiltratie13, het gebruik van polymeer gebaseerde reagentia, grootte-uitsluiting chromatografie en immunoaffinity isolatie isoleren. Deze verschillende methoden beschikken over hun eigen voordelen en beperkingen14. In het algemeen ultracentrifugatie wordt beschouwd als de gouden standaard methode om vesikel te isoleren. Deze methode is echter lijden van de beperking van mogelijke EV aggregatie14.
In schistosomes, een paar methoden zijn gemeld voor EV isolatie: deze omvatten ultracentrifugatie11,12,10 en het gebruik van commerciële EV isolatie kit16 voor verschillende stadia (eieren16, schistosomula11, volwassen schistosomes10,12,17). Gezien het feit dat microvesicles van een breed scala van grootte variërend van enkele honderden nanometer duizend nanometer, ontwikkelden we een alternatieve methode die met het gebruik van Bank centrifuge, ultrafiltratie en een commerciële EV isolatie kit combineert te isoleren van de EVs uit volwassen Schistosoma japonicum. De geïsoleerde EVs meestal bezat een diameter van 100-400 nm en met succes door de ontvangende cellen waren geïnternaliseerd.

<table><tbody><tr><td>Materiaal</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Total Exosome Isolation Reagent (van celkweekmedium)</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>4478359</td><td>Voor het isoleren van S. japonicum extracellulaire vesikels</td></tr><tr><td>PKH67</td><td>Sigma-aldrich</td><td>MINI67</td><td>Voor het labelen van EV's</td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>11875119</td><td>Voor parasietcultuur</td></tr><tr><td>Penicilline-Streptomycine</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>0,22 μm spuitfilter</td><td>Merck</td><td>SLGP033RB</td><td></td></tr><tr><td>SnakeSkin dialyseslang</td><td>Thermo SCIENTIFIC</td><td>68035</td><td></td></tr><tr><td>PEG8000</td><td>Sangon Biotech</td><td>A100159&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>RIPA</td><td>Beyotime</td><td>P0013B</td><td></td></tr><tr><td>EMD Millipore&trade; Immobilon&trade; Western Chemiluminescent HRP Substraat (ECL)</td><td>Fisher scientific</td><td>WBKLS0100&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>4083</td><td></td></tr><tr><td>BCA-kit</td><td>Beyotime</td><td>P0010</td><td></td></tr><tr><td>CD63-antilichamen</td><td>Sangon Biotech</td><td>D160973-0025</td><td></td></tr><tr><td>PVDF</td><td>Bio-Rad</td><td>1704273</td><td></td></tr><tr><td>Formvar/Carbon 400 mesh</td><td>Ted Pella</td><td>01754-F</td><td></td></tr><tr><td>Fosfowolfraamzuur</td><td>Ted Pella</td><td>19402</td><td></td></tr><tr><td>anti-muis IgG-HRP</td><td>CWBIO</td><td>CW0102</td><td></td></tr><tr><td>NCTC clone 1469 cellen</td><td>ATCC</td><td>ATCC&reg; CCL-9.1&trade;</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>HyClone</td><td>SV30087.02</td><td></td></tr><tr><td>Apparatuur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GE chemoluminescentie beeldvormingssysteem</td><td>GE</td><td>ImageQuant LAS4000mini</td><td></td></tr><tr><td>Transmissie-elektronenmicroscopie</td><td>Hitachi</td><td>H-7600</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q water</td><td>Milli-Q</td><td>Milli-Q Elix</td><td></td></tr><tr><td>Eppendor Centrifuge&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>Centrifuge 5804R</td><td></td></tr><tr><td>ZetaSizer Nano</td><td>Malvern</td><td>ZetaSizer Nano ZS&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuge</td><td>Beckman</td><td>Optima L-100 XP Ultracentrifuge</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>ESCO</td><td>CCL-107B</td><td></td></tr><tr><td>Microscoop</td><td>Zeiss</td><td>Zeiss Axio Observer Z1</td><td></td></tr></tbody></table>

isolatie en karakterisatie van extracellulaire blaasjes van volwassen schistosoma japonicum

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

Extracellulaire blaasjes (EVs) zijn membraanachtig blaasjes uitgebracht door een aantal van de cellen in de extracellulaire communicatie. EVW vertegenwoordigen een bevolking van heterogene blaasjes, waarvan groottewaaier tussen 40 en 1000 nm. Geaccumuleerde bewijs aangegeven dat EVs spelen een belangrijke regelgevende rol in pathogene agens-gastheer interacties. Een diep begrip van Schistosoma EVW moet inzicht verwerven in de mechanismen die ten grondslag liggen aan de Schistosoma-gastheer interacties, ontwikkeling van nieuwe strategieën tegen schistosomiasis. Hier, streven wij naar verdere studie EVs functies in schistosomes door de presentatie van een protocol voor de isolatie en de karakterisering van het EVW van volwassen Schistosoma japonicum (S. japonicum). EVW werden geïsoleerd van in vitro cultuur medium gebruik van centrifugeren gecombineerd met een commerciële exosome isolatie kit. De geïsoleerde S. japonicum EVs (SjEVs) doorgaans bezitten een diameter van 100-400 nm en worden gekenmerkt door transmissie elektronische microscopie en het westelijke bevlekken. Het gebruik van PKH67 kleurstof-geëtiketteerden SjEVs heeft aangetoond dat SjEVs door de ontvangende cellen zijn geïnternaliseerd. Over het geheel genomen biedt onze protocol een alternatieve methode voor het isoleren van EVs van volwassen schistosomes; de geïsoleerde SjEVs mogelijk geschikt voor functionele analyse.

Om te kwantificeren van de opbrengst van geïsoleerde SjEVs met behulp van de beschreven protocol, gebruikt wij BCA eiwit assay voor toegang tot de eiwitconcentratie van de geïsoleerde SjEVs van 28-daagse volwassen schistosomes. Zoals blijkt uit tabel 1, varieerde de eiwitconcentratie SjEV 208 µg tot 250 µg per 100 mL medium (tabel 1). De grootte van de deeltjes, zoals bepaald door de Malvern nanoparticle analyse, vermeld dat de geïsoleerde SjEVs van 100 v...

Hier presenteren we een protocol om te beschrijven van extracellulaire blaasjes (EVs) isolatie in in vitro gekweekte medium uit volwassen Schistosoma japonicum.

Isolatie en karakterisatie van extracellulaire blaasjes van volwassen Schistosoma japonicum

Extracellular vesicles (EVs) are membranous vesicles released by a variety of cells into the extracellular microenvironment. EVs represent a population of ...

Het algemene doel van deze procedure is om extracellulaire vesicles te isoleren uit het medium van in vitro gekweekte volwassen Schistosoma japonicum. Deze methode kan efficiënt EV isoleren in in vitro kweekmedium van volwassen Schistosoma japonicum. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het efficiënt extracellulaire vesicles kan isoleren uit kortdurend in vitro kweekmedium, wat de stress kan minimaliseren die mogelijk resulteert in niet-fysiologische EV-secretie.De demonstratie zal worden uitgevoerd door Juntao Liu, een technicus uit mijn lab. Verzamel de parasieten in een beker van 500 milliliter en was ze grondig maar voorzichtig drie keer met 200 milliliter warm PBS. Houd de wasbeurten kort en gebruik zwaartekrachtsedimentatie om de parasieten te scheiden.Plaats vervolgens op 90-millimeter schaaltjes ongeveer 200 wormparen per schaaltje. Was de parasieten in het schaaltje nog twee keer met behulp van zwaartekrachtsedimentatie. Gebruik voor deze wasbeurten warm RPMI-medium aangevuld met pen-strep.Vervang de tweede wasbeurt door 40 milliliter van het medium zonder antibiotica. Kweek vervolgens de parasieten gedurende twee uur bij 37 graden Celsius onder 5% koolstofdioxide. Na twee uur breng je het medium van de schalen over in centrifugeerbuizen en pool je de eieren en wormdebris bij 2.000 g gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius.Verzamel vervolgens het supernatant en breng het over in een verse buis. Filter vervolgens het supernatant door een 0,22-micron spuitfilter en verzamel de gefilterde oplossing in een dialysezak met een moleculair gewicht van 3,5 kilodalton. Dialyseer vervolgens de oplossing met behulp van 8% PEG8000-oplossing bij vier graden Celsius gedurende de nacht.Deze stap is belangrijk om de opbrengst van extracellulaire vesicles te verhogen. De volgende dag breng je de gedialyseerde oplossing over in een nieuwe buis en voeg je 0,5 volumes van het totale exosome-isolatiereagens toe. Meng de oplossing tot het homogeen is en incubeer het gedurende de nacht bij ongeveer vijf graden Celsius.De volgende ochtend centrifugeer je het mengsel gedurende een uur bij 15.000 g en ongeveer vijf graden Celsius. Aspeer vervolgens het supernatant en gooi het weg, en suspendeer het EV-pellet in twee milliliter PBS. Het pellet zal waarschijnlijk niet zichtbaar zijn.Voor western blot-analyse bepaal je eerst de eiwitconcentratie van het monster, bijvoorbeeld met behulp van de BCA-test. Bereid vervolgens 10 tot 20 microgram EV's in 22,5 microliter RIPA-buffer voor. Voeg vervolgens 7,5 microliter 4X laadbuffer toe en verwarm het mengsel gedurende vijf minuten bij 95 graden Celsius.Na de warmtebehandeling scheid je de extracellulaire vesicle-eiwitten op een 12% SDS-PAGE-gel. Nadat de gel is gelopen, worden de eiwitten overgebracht naar een PVDF-membraan. Probeer het membraan met anti-CD63-antilichamen bij een verdunning van één op 1.000.Behandel vervolgens het membraan met anti-konijn IgG-HRP bij een verdunning van één op 5.000. Gebruik nu een ECL-detectiereagens om het membraan te ontwikkelen en voer vervolgens een analyse uit op een chemiluminescentie-beeldvormingssysteem. Begin met het overbrengen van vijf microgram monster naar een polypropyleen ultracentrifugebuis en pas het volume aan tot 12 milliliter met RPMI-1640-medium.Centrifugeer vervolgens het monster gedurende 90 minuten bij 110.000 g en vier graden Celsius. Na de centrifugatie aspeer je voorzichtig het supernatant en gooi je het weg. Bereid vervolgens een 2X extracellulair vesicle-suspensie voor door één milliliter verdunningsvloeistof C toe te voegen aan het pellet.Resuspendeer het pellet met voorzichtig pipetteren. Bereid nu een verse 2X kleurstofoplossing voor. Voeg twee microliter van de PKH67 ethanolische kleurstof toe aan één milliliter verdunningsvloeistof C in een microfugebuis en meng goed.Kleur vervolgens het monster door de twee oplossingen te mengen en het mengsel gedurende vier minuten op kamertemperatuur te incuberen. Stop vervolgens de kleuring door vier milliliter FBS toe te voegen en nog een minuut te wachten. Voeg vervolgens RPMI-1640-medium toe om het volume aan te passen tot 12 milliliter en centrifugeer de suspensie om de gekleurde vesicles te isoleren.Verwijder en gooi het supernatant weg. Resuspendeer vervolgens de gepelletiseerde PKH67-gelabelde EV's in 12 milliliter RPMI-1640-medium. Herhaal vervolgens de centrifugatie, maar verzamel deze keer de vesicles in één milliliter PBS.Voor de opnametest bereid je overnachtsculturen van zoogdiercellen in zes-putjesplaten. Voeg de volgende ochtend vijf microgram PKH67-gelabelde vesicles toe aan elke put en zet de kweek voort gedurende twee tot vier uur. Na de incubatie verwijder je het medium en was je de cellen twee keer met PBS.Fixeer vervolgens de cellen gedurende 15 minuten, was ze twee keer met PBS en kleuren ze met DAPI voor beeldvorming. Schistosomen in de leverfase werden verzameld van konijnen 28 dagen na infectie. Extracellulaire vesicles werden vervolgens verzameld van de schistosomenwormen en geanalyseerd.Hun deeltjesgrootte, zoals bepaald door Malvern nanodeeltjesanalyse, varieerde tussen de 100 en 400 nanometer, met de meerderheid van de populatie rond de 220 nanometer. Transmissie-elektronenmicroscopie onthulde dat de extracellulaire vesicles rond waren en een diameter hadden tussen de 100 en 200 nanometer. Western blotting-analyse gaf aan dat de geïsoleerde extracellulaire vesicles werden herkend met behulp van CD63-antilichamen, wat een typische extracellulaire vesicle-marker is.Fluorescentiemicroscopie van PKH67-gelabelde extracellulaire vesicles die door de NCTC-klon 1469-cellen werden geïnternaliseerd, toonde aan dat de extracellulaire vesicles voornamelijk werden gedistribueerd in het cytoplasma van de ontvangende cellen. Na het bekijken van deze video zou je een goed begrip moeten hebben van hoe je EV in in vitro kweekmedium van volwassen Schistosoma japonicum kunt isoleren.

isolation-characterization-extracellular-vesicles-from-adult

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Hier bieden we een gedetailleerd protocol om te isoleren van kleine extracellulaire blaasjes (EVs) hele weefsel, met inbegrip van hersenen en tumor exemplaren. Deze methode biedt een reproduceerbare techniek om EVs extract van solide weefsel voor verder stroomafwaarts analyses.

Winning van extracellulaire blaasjes uit hele weefsel

Dit artikel presenteert methoden voor het genereren, zuiveren en kwantificeren van Caenorhabditis elegans extracellulaire blaasjes.

Zuivering en analyse van Caenorhabditis elegans Extracellular Blaasjes

Het huidige protocol beschrijft de isolatie van microRNA's uit teken speekselklieren en gezuiverde extracellulaire blaasjes. Dit is een universele procedure die veelgebruikte reagentia en benodigdheden combineert. De methode maakt ook het gebruik van een klein aantal teken mogelijk, wat resulteert in hoogwaardige microRNA's die gemakkelijk kunnen worden gesequenced.

Isolatie van microRNA's van Tick Ex Vivo Speekselklierculturen en Extracellulaire Blaasjes

Hier beschrijven we de verrijking van kleine extracellulaire blaasjes afgeleid van leverkankerweefsel door middel van een geoptimaliseerde differentiële ultracentrifugatiemethode.

Een verrijkingsmethode voor kleine extracellulaire blaasjes afgeleid van leverkankerweefsel

Hier presenteren we een protocol om van milt afgeleide exosomen van muizen te isoleren met behulp van een combinatie van vertering met collagenase type I en ultracentrifugatie.

Isolatie en karakterisering van exosomen afgeleid van miltweefsels van muizen

Dit protocol heeft tot doel interstitiële extracellulaire blaasjes (SkM-EV's) van skeletspieren te isoleren en te zuiveren uit spierweefsel van knaagdieren door middel van mechanische onthechting, enzymatische dissociatie, filtratie en differentiële ultracentrifugatie. Het toont consistentie en betrouwbaarheid. De geïsoleerde SkM-EV's geven inzicht in spierhomeostase en -ziekten, met mogelijke toepassingen als diagnostische biomarkers of therapeutische voertuigen.

Enzymatische isolatie van interstitiële extracellulaire blaasjes van skeletspieren

Hier beschrijven we in vitro kweekomstandigheden, isolatie en verhoogde aanmaak van extracellulaire blaasjes (EV's) van Echinococcus granulosus. De kleine EV's werden gekenmerkt door dynamische lichtverstrooiing en transmissie-elektronenmicroscopie. De opname door beenmerg-afgeleide dendritische cellen en hun fenotypische modulatie werden bestudeerd met behulp van confocale microscopie en flowcytometrie.

Isolatie en dendritische celopname van kleine extracellulaire blaasjes van Echinococcus granulosus

Dit protocol beschrijft de isolatie van kleine extracellulaire blaasjes uit muisskeletspier en beenmerg met behulp van enzymatische vertering en grootte-uitsluitingschromatografie, waardoor reproduceerbare terugwinning van vesikelverrijkte fracties uit structureel complexe, laagopbrengstweefsels mogelijk is voor downstream moleculaire analyse.

Isolatie van kleine extracellulaire blaasjes uit muisskeletspier en beenmerg door grootte-uitsluitingschromatografie

Cercarial Transformatie en In vitro Teelt van Schistosoma mansoni Schistosomules

Schistosoma mansoni eieren zijn krachtige stimulatoren van de T-helper type 2 (Th2) immuunrespons, kenmerk van parasitaire infecties, astma en allergische ontsteking. Dit protocol maakt gebruik van S. mansoni ei injectie om een CD4 Th2 cytokine-geïnduceerde ontstekingsreactie in de long, gekenmerkt door long granuloomvorming rond het ei, eosinofilie en macrofaag alternatieve activatie te genereren.

Het gebruik van eieren van<em&gt; Schistosoma mansoni</em&gt; Als een<em&gt; In vivo</em&gt; Model van Helminth veroorzaakte longontsteking

Leer de isolatie van extracellulaire blaasjes uit het kweekmedium van volwassen Schistosoma japonicum. Deze methode minimaliseert stress op de parasieten en levert zuivere EV's voor parasitologisch onderzoek.

Isolatie en karakterisatie van extracellulaire blaasjes van volwassen Schistosoma japonicum

Meer video's verkennen