Name: Vivo에서 Photolabeling 신생아 쥐에 있는 조 혈 모 세포의 이동성 잠재력을 평가 하는 콜론에 셀의 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-10T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: 배우세요 신생아 쥐에서 포토라벨링을 이용한 결장 면역세포 이동성 분석 방법을. 이 기술은 장내 미생물 상호작용 및 면역세포 추적 연구에 활용됩니다.

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Nitya 자이나교는 NIH/NIAID 경력 전환 상 1K22AI116661-01에 의해 지원 되었다.

모든 동물 절차 승인 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 매사 추세 츠 종합 병원에서 준수와의 수행 했다.
주의:이 프로토콜 클래스 3b 레이저 (LG3)의 사용을 포함. LG3 레이저 안전 고글이이 레이저를 작동 하는 경우에 항상 사용 해야 합니다. 적절 한 교육 및 안전 지침 부상의 위험을 피하기 위해 따라야 합니다.
1. 디자인 및 레이저
<ol><li>라이트-발광 다이오드 (LED)를 연결 (405 nm, 19.3 mW, 1400 mA, 섬유 결합) 하는 LED 드라이버를 통해 오는 4 핀 M8 커넥터 케이블 LED에 연결. 조심 스럽게 연결 고정 하는 나사를 조입니다.</li>
	<li>Optogenetics 패치 케이블 LED를 연결 하기 전에 커넥터를 잡고 LED의 최대 개방 거기 있도록 빛은 볼 수 없는 장애물. 필요한 경우 이물질을 제거 하 여 optogenetics 패치 케이블을 삽입 구멍에 불어.</li>
	<li>커넥터 슬리브의 한쪽 끝에는 정을 삽입 하 여 섬유 광섬유 정 optogenetics 패치 케이블을 연결 합니다. 패치 케이블을 커넥터 슬리브의 다른 쪽 끝을 연결 합니다.  연결을 보호 하지만 구부리거나 광섬유를 정 맥에 휴식을 조심 하는 충분 한 압력을 적용 합니다. 참고: 연약한 섬유 광섬유 정 맥으로 덮여 있다 보호 모자 때마다 레이저 사용 되지 않습니다.</li>
	<li>0과 1.2 A. 설정 전류 제한에 지속적인 조정 손잡이와 연속파 (CW) 모드를 설정 하는 LED 드라이버</li>
</ol>2입니다. 결 장에서 세포의 Photoconversion
참고: 남성 및 여성 쥐 intracolonic 405 nm 빛에 드러낸 그들의 출생 후 1-2 일 및 나이의 1 주 전에 희생 되었다.
<ol><li>전원 콘센트에 대 한 액세스와 함께 어두운 위치를 확보. LED 드라이버를 콘센트에 꽂습니다. 참고:이 절차에서에서 수행 됩니다 최소한의 하얀 빛으로 주위 빛에 쥐의 긴 노출 셀의 원치 않는 photoconversion를 발생할 수 있습니다. 레드 빛 대신 사용 됩니다. 주의: 다음 단계는 동물 마 취의 사용을 포함 한다. 마 취의 관리 클래스 II 후드에서 또는 다른 적절 한 청소 시스템을 사용 하 여 일어난다. 현기증, 졸음, 또는 심지어 무 의식 흡입 마 취의 발생할 수 있습니다.</li>
	<li>4-5 %isoflurane 유도 상자에 100% o 2에 노출에 의해 마우스를 anesthetize. 단단히 꼬 집는 뒷 발 (응답) 하 여 마 취의 적절 한 깊이 확인 합니다. 약 2 %isoflurane 코 콘을 통해 마 취를 유지 합니다. 적절 한 후드 또는 마 취 청소 장치를 사용 하 여 처리기 isoflurane 노출을 방지 합니다.</li>
	<li>위치 1을 사용 하 여 intracolonic 노출에 대 한 마 취 마우스 손을 아저씨는 검지 손가락과 엄지손가락으로 부드럽게 마우스의 뒷면. 복 부를 노출 하는 마우스를 넘겨. 마우스의 핑크 색상을 잃고 시작 하는 경우 또는 호흡 속도 천천히 시작 하는 경우는 그립을 풉니다. 반지와 작은 손가락 사이의 마우스의 꼬리를 보호 합니다.</li>
	<li>다른 한편으로는 정 맥에서 보호 캡을 제거 합니다. 유지 하면서 정 마우스의 중간에 평행의 긴 축 부드럽게 삽입 항문을 통해 섬유 광섬유 정 콜론으로 광섬유의 모든 5 m m 마우스 안에 있습니다. 참고:이 절차는 천천히, 그리고 신중 하지 저 승 벽 구멍을 수행 됩니다. 분은 정의 왜곡 하 고 방도 에이즈 콜론으로 발전.</li>
	<li>안전 고글을 착용 하 고 최대 값 (모든 방법 시계 방향으로) 현재 레이저를 증가. 마우스의 반투명 복 부에 보고 하 여 UV 빛의 존재를 확인 합니다. 참고: LG3 레이저 안전 고글은 극적으로 가시성을 감소. 동료 (입고 보호 장비) 레이저에서 고글을 donning 및 도움이 있다.</li>
	<li>노출 2 분 철수 정 약 1 m m의 총 빛 레이저에 콜론 모든 30의 빛에 노출 luminal 영역을 최대화 하기 위해. 2 분의 끝에, 해제 레이저.</li>
	<li>천천히 마우스에서은 정을 제거 합니다. 빈 따뜻한 케이지 마 취에서 회복 후, 홈 케이지를 마우스를 반환 합니다.</li>
</ol>3입니다. 창 자 세포의 고립
<ol><li>행 크의 균형 소금 솔루션/송아지 혈 청 (HBSS/CS) 버퍼의 1 L, 상피 스트립 버퍼의 200 mL, 500 mL의 세척 미디어, 그리고 ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) 200 mL를 준비-무료 세척 미디어. 참고: 시 약 볼륨 9의 샘플 크기에 대 한 계산 됩니다.<ol>
<li>HBSS 950 mL에 CS의 50 mL를 추가 하 여 (HBSS; 5 %CS) HBSS/CS 버퍼를 확인 합니다. 얼음에 그것을 저장 합니다.</li>
		<li>CS, 1 M DTT, 0.5 M EDTA의 2 mL 및 1 M HEPES 버퍼의 3 mL 200 µ L의 10ml 185 mL을 추가 하 여 상피 스트립 버퍼 [HBSS, 5 %CS, 1 m m dithiothreitol (DTT); 5 mM EDTA, 15 mM 4-(2-Hydroxyethyl) piperazine-1-ethanesulfonic 산 (HEPES) (pH 7.2-7.5)]를 준비 HBSS의. 37 ° C 물 욕조에 상피 스트립 버퍼를 놓습니다.</li>
		<li>HBSS 494 mL에 CS의 5 mL 및 0.5 M EDTA의 1 mL을 추가 하 여 세척 미디어 (HBSS; 1% CS 1 mM EDTA)를 확인 합니다. 실 온에서 보관 합니다.</li>
		<li>HBSS 195 mL에 2 mL의 CS와 1 m HEPES 3 mL를 추가 하 여 EDTA 무료 세척 미디어 (HBSS; 1% CS 15 mM HEPES)를 준비 합니다. 실 온에서 보관 합니다.</li>
		<li>FACS 버퍼 만들기 [버퍼링 하는 인산 염 (PBS) x 1 (pH 7.2 =); 2 %CS] CS의 10 mL PBS의 490 mL에 추가 하 여. 얼음에 그것을 저장 합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>60 x 10 m m 문화 접시 안에 70 µ m 셀 스 트레이너를 배치 하 여 조직 컬렉션 접시를 준비 합니다. 접시에 HBSS/CS 버퍼 (HBSS; 5 %CS 버퍼 단계 3.1.1에서에서 만든 및 얼음에 저장 된)의 10 mL를 추가 하 고 얼음에 그것을 배치.</li>
	<li>마우스를 통해 적절 한 마 취의 청소를 사용 하 여 흡입된 isoflurane의 과다를 안락사 (에 약 3 분 노출 > 4% isoflurane 100% O2또는 방 공기에서). 호흡의 명백한 중단 후 반사 운동, 뒷 발을 확고 하 게 곤란 하 여 깊은 고통의 부재를 확인 (집게를 사용 하는 것이 좋습니다). 수술가 위 또는 새로운 면도칼을 사용 하 여 잘린 통해 안락사 확인 합니다. 참고: 자 궁 경부 전위 크기와 동물의 나이 때문에이 단계에 대 한 권장 하지 않습니다. 이러한 방법은 안락사에 AVMA 지침을 2013와 일치 되며 MGH IACUC에 의해 승인.</li>
	<li>복 부를 열고 깨끗 한 집게와가 위를 사용 하 여 콜론을 수확. 마우스의 복 부를 노출 콜론의 1 측에 내장을 반영 합니다. 먼저 그것은 단지 (항문)으로 원심 transecting에 의해 전체 콜론 제거 맹 하. 그런 다음 집게와 콜론을 단단히 잡고, 항문에 요도 통해 잘라가 위를 사용 합니다. 최대한 항문 주변으로 콜론을 잘라. 콜론을 제거 후 비장 수확 (4.1-4.2 아래 단계를 참조). 참고: photoconversion 프로토콜만 신생아의 콜론 (섬유 광섬유 정 5 m m)의 25%를 대상으로, 하는 동안 전체 콜론 셀 격리에 도움이 수확 이다.</li>
	<li>결 장 그리고 건조 종이 타월에 내용을 밀어 집게를 사용 하 여 콜론을 청소. 조직 문화 접시의 커버에 붙여넣기 콜론 잘게 잘라를 다음 페 트리 접시에 셀 스 트레이너를이 붙여넣기를 전송 면도날을 사용 하 여 균질.</li>
	<li>깨끗 한 8 m m 긴 자기 저 어 바는 여과기를 추가 하 고 9 위치 자력 접시에 접시를 놓고. 800 rpm에 자석 볶음 바 속도 설정 하 고 실 온에서 5 분에 대 한 셀을 품 어. 버퍼를 삭제 하 고 HBSS/cs (는 HBSS; 5 %CS 버퍼 단계 3.1.1에서에서 만든 및 얼음에 저장 된) 10 mL를 사용 하 여 세척을 반복 합니다. 세척 후에 버퍼를 삭제 합니다.</li>
	<li>셀 스 트레이너를 prewarmed 상피 스트립 버퍼 (는 HBSS, 5 %CS, 1mm DTT; 5 mM EDTA, 15 mM HEPES [pH 7.2-7.5] 버퍼 하 단계 3.1.2에서 37 ° C 물 욕조에 저장)의 10 mL를 추가 하 여 상피 세포를 분리 하 고 800 rpm는 3에서 30 분 저 어 7 ° C 인큐베이터입니다. 보육의 끝에, 깨끗 한 15 mL 튜브에 상피 분수에서 풍성 하 게 하는 버퍼를 전송 합니다. 참고: 상피와 관련 된 셀 (장 상피 세포 및 장 상피 세포)는 발표는 버퍼에 그대로 lamina propria 에 셀11단계 동안 셀 스 트레이너에서 남아 있는 동안.<ol>
<li>실 온에서 5 분 동안 700 x g에서 농축된 장 상피 분수 (IELs) 원심 삭제는 상쾌한 고 FACS 버퍼의 1 mL에 셀 펠 릿 resuspend. 3.15 단계에서 사용 하기 위해 얼음에 그것을 저장 합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>셀 스 트레이너 2 내 lamina propria 분수를 씻어 HBSS/CS와 x. 이렇게 하려면 셀 스 트레이너를 HBSS/CS 솔루션 (HBSS, 얼음에 저장 된 단계 3.1.1에서에서 만들어진 5 %CS 버퍼) 10 mL를 추가 하 고 37 ° C 배양 기에서 5 분 800 rpm에서 그것을 저 어. 각 세척 후 버퍼를 삭제.</li>
	<li>샘플 2 세척 세척 미디어에 x. 셀 스 트레이너를 세척 미디어 (HBSS; 1% CS 1 mM EDTA 버퍼를 단계 3.1.3에서 실내 온도에 저장) 10 mL를 추가 하 고 37 ° C 배양 기에서 15 분 800 rpm에서 그것을 저 어. 각 세척 후 버퍼를 삭제.<ol>
<li>사용 후 세척 미디어, 단계 3.14에서에서 사용에 대 한 얼음에 저장 합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>샘플 2 세척 HBSS x/CS. 셀 스 트레이너를 HBSS/CS 버퍼 (HBSS; 5 %CS 버퍼 단계 3.1.1에서에서 만든 얼음에 저장 되어 있는)의 10 mL를 추가 하 고 37 ° C 배양 기에서 5 분 800 rpm에서 그것을 저 어. 각 세척 후 버퍼를 삭제.</li>
	<li>EDTA 무료 워시 버퍼에서 조직 품 어. 셀 스 트레이너를 EDTA 무료 워시 버퍼 (HBSS; 1% CS 15 mM HEPES 버퍼를 단계 3.1.4에서 실내 온도에 저장)의 10 mL를 추가 하 고 교 반 하지 않고 실 온에서 10 분 동안 접시를 품 어. 이 단계의 끝에 버퍼를 삭제 합니다.</li>
	<li>워시 샘플 2 x HBSS/CS 효소 솔루션을 준비 하 고. HBSS/cs (HBSS; 5 %CS 버퍼 단계 3.1.1 얼음에 저장 된에서) 10 mL를 추가할 셀 스 트레이너를 버퍼링 하 고 37 ° C 배양 기에서 10 분 800 rpm에서 그것을 저 어. 각 세척 후 버퍼를 삭제.<ol>
<li>효소 솔루션 준비 (씻고 EDTA 무료 버퍼; 0.1 mg/mL DNase 나; 167 mg/mL 콜라) 두 번째 세척 기간 동안: 9 밀리 그램을 추가 DNase의 나, EDTA 무료의 90 mL을 동결 건조 된 콜라의 15 mg 세척 버퍼. 실 온에서 솔루션을 저장 합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>Lamina propria 분수 lamina propria 림프 톨 (LPLs)을 얻기 위해 셀 여과기에 포함 된 소화. 효소 솔루션의 10 mL를 추가 (EDTA 무료 워시 버퍼; 0.1 mg/mL DNase I; 167 mg/mL 콜라 버퍼 3.12.1 단계에서 만든 및 실내 온도에 저장) 셀 스 트레이너를 37 ° C 배양 기에서 45 분 800 rpm에서 그것을 저 어. 참고: LPLs 효소 소화 후 솔루션으로 해제 됩니다.<ol>
<li>셀을 포함 하는 효소 솔루션을 수집 하 고 50 mL 원뿔 관으로 새로운 셀 스 트레이너를 통해 필터링.</li>
	</ol></li>
	<li>효소 솔루션에서 콜라 활동을 차단 하는 필터링 된 셀에 차가운 세척 미디어 (는 HBSS; 1% CS 1 mM EDTA 버퍼링 단계 3.1.3에서에서 만들어지고 저장 단계 3.9.1에서에서 얼음에) 20 mL를 추가 합니다. 실 온에서 6 분 700 x g에서 튜브 원심 삭제는 상쾌한 고 resuspend FACS 버퍼의 1 mL에 LPLs를 포함 하는 펠 릿.</li>
	<li>(3.7.1 단계)에서 IEL과 (3.14 단계)에서 LPL 분수 결합 하 고 흐름 cytometric 분석에 대 한 형광 활용 된 항 체와 그들을 얼룩 (단계 5 참조). 참고: IEL와 LPL 분수 수 있습니다 얼룩이 질 별도로 구획 정보를 원하는 경우.</li>
</ol>4입니다. 비장에서 세포의 고립
<ol><li>Microcentrifuge 튜브에 FACS 버퍼의 500 µ L을 추가 하 여 컬렉션 튜브를 준비 합니다. 얼음에 그것을 저장 합니다.</li>
	<li>콜론 (3.4 단계)를 제거한 후 전체 비장을 수확 하 고 컬렉션 튜브에 배치 합니다. 얼음에 조직을 저장 합니다.</li>
	<li>실내 온도 상쾌한 떨어져 aspirate에서 5 분에 대 한 300 x g [마이크로 원심 분리기]에서 샘플 약 1 분 원심 분리기에 대 한 microcentrifuge 튜브에 비장 균질 전기 조직 균질 화기를 사용 하 여.</li>
	<li>삼투성 세포에 의해 세포 죽음을 시작 하려면 염화 염화 칼륨 (ACK) 세포의 용 해 버퍼의 500 µ L에서 샘플을 resuspending 하 여 적혈구 세포를 수행 합니다. 실 온에서 1-2 분을 품 어 다음 FACS 버퍼의 725 µ L에서 resuspend을 샘플을 수 있습니다.</li>
	<li>실내 온도 상쾌한 떨어져 aspirate에서 5 분에 대 한 300 x g [마이크로 원심 분리기]에서 샘플 원심 FACS 버퍼의 500 µ L에 펠 릿을 resuspend 하 고 새로운 microcentrifuge 튜브로 40 µ m 셀 스 트레이너를 통해 필터링. 새로운 microcentrifuge 튜브 전체 샘플 전송 및 흐름 cytometric 분석에 대 한 형광 활용 된 항 체와 얼룩 (단계 5 참조).</li>
</ol>5. Dendra-r+ 세포를 사용 하 여 흐름 Cytometry 식별
<ol><li>실내 온도 상쾌한 떨어져 aspirate에서 5 분에 대 한 300 x g [마이크로 원심 분리기]에서 IEL/LPL, 비장 샘플 원심</li>
	<li>믹스를 얼룩이 지는 항 체의 100 µ L에 산 탄을 resuspend. 샘플 당 FACS 버퍼의 100 µ L를 붙일 활용 된 안티 CD45 항 체의 1 µ L을 추가 하 여 혼합을 얼룩이 지는 항 체를 준비 합니다. 참고: 적정 항 체 사용 실험 전에 cytometry 최적 농도 결정 하기 위해 채도 바인딩 발생 합니다 중요 하다.</li>
	<li>(어두운 곳)에 얼음에 35 분 샘플을 품 어.</li>
	<li>FACS 버퍼의 300 µ L에서 샘플을 resuspend 하 고 실 온에서 5 분에 대 한 300 x g [마이크로 원심 분리기]에서 원심. 발음은 상쾌한 고 FACS 버퍼의 325 µ L에서 샘플을 resuspend. 교류 cytometer에 샘플을 분석 합니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

상호 작용 하 고 결 장에서 microbiota에 의해 영향을 하는 셀의 특성을 확인 하 고 중요 하 고 어떻게 막 microenvironment에서 정보는 시체의 나머지 부분에 릴레이의 이해를 촉진 한다. 창 자 관련 셀 마이그레이션 공부에 대 한 한 가지 방법은 그들의 조직을 추적 패턴12,13함수를 받는 쥐로 입양 전송 다음 창 자 관련 된 세포의 필요 합니다. 이 접근은 제한으로 전송 된 특정 셀 종류만을 추적할 수 있습니다. 또한, 조직 및 정화 과정에서 세포의 고립에서 발생 하는 아티팩트 vivo에서 철새 프로세스를 방해 수 있습니다. 더 많은 최근 내 시경 photoconversion 프로토콜 창 자 세포가 마우스를 사용 하 여 라벨을 보고14이었다. 이 연구는 성인 쥐에 백혈구는 소장에서의 광범위 한 매매 발견.
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포유류 위장 항만 호스트1과 공생 관계에 존재 하는 박테리아의 종의 수백. 면역 세포 로컬 환경에 이러한 미생물과 평화공존을 적용 하 고 병원 체 침입에 대 한 보호벽을 설치. 따라서, 면역 세포와는 microbiota 간의 양방향 상호 작용은 숙주 면역 체계를 교육 하 고 병원 체를 면역 반응에 대 한 임계값을 설정 하는 공생 공동체 확립을 중요 합니다. 미생물 또는 dysbiosis, 구성, 수에서 변경 면역 항상성 교란 및 면역 중재 질병 타입-1 당뇨병 및 IBD2,3 로 이어지는 장 염증을 억제 하는 규제 회로 교란 .
기간 출생은 장내 미생물 지역 사회 동시에 면역 체계를 구축 하기 시작 하는 독특한 발달 창 후에 즉시4성숙. 출생 후 microbiota 안정, 자연스럽 게 발생 하는 지역 사회 구성 및 자주5의 변화 되지 않습니다. 면역 세포는 microbiota와 상호 작용 하는 두 가지 해 부 위치 내장-에서 lamina propria 와6장 상피에서 상주 합니다. 수많은 종류의 면역 세포 (수지상 세포, monocytes, 대 식 세포 등) 골수성 세포 뿐만 아니라 림프 톨 (T 세포, B 세포, 타고 난 림프 세포 등)을 포함 한 소장에 있습니다. 이러한 세포, 조 혈 모 세포로 알려진 다양 한 장 벽을 유지 하 고 항상성 유지 기능을 수행 합니다.
그들의 규정 하는 기능 장의 사이트에서 뿐만 아니라 점 막의 면역 세포 조직의 면역7,,89규제 미생물 메시지 여분 장 사이트를 반입할 수 있습니다. 성장 연구 관심 분야 이며 그들의 기능을 조사 하기 위해 장 조직을 마이그레이션할 면역 세포를 식별 하는 방법에 대 한 필요성을 강조. 여기 보고 프로토콜 레이블 셀에 photoconvertible 형광 단백질은 악용 상용 마우스 모델을 이용 한다. 팜과excised 쥐 편은 레스터 전환 활성화 시 빨간색 형광 자외선 (UV) 빛10녹색 형광 Dendra2 단백질을 표현 한다. 섬유 광섬유 정을 사용 하 여 신생아 쥐의 콜론에 405 nm 빛을 제공 하는에서 유래 했거나 콜론 통해 통과할 photoconverted 조 혈 모 세포는 비장에서 찾을 수 있습니다 설명 합니다.

<table><tbody><tr><td><강>레이저</강></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>발광 다이오드(LED)</td><td>THORLABS</td><td>M405FP1</td><td>주의: 이것은 클래스 3b 레이저입니다. 레이저를 사용할 때는 보안경을 착용해야 합니다. 1400mA의 전류로 405nm 파장을 방출합니다. 광섬유 결합입니다. SMA 커넥터를 수용합니다. </td></tr><tr><td>https://www.thorlabs.com/thorproduct.cfm?partnumber=M405FP1 LED 드라이버</td><td>THORLABS</td><td>LEDD1B</td><td>레이저를 통해 1200mA의 정전류를 구동합니다. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=2616</td></tr><tr><td>광유전학 패치 케이블</td><td>THORLABS</td><td>M87L01</td><td>SMA 커넥터가 있는 1m 길이의 케이블. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=11405&pn=M87L01#11454</td></tr><tr><td>광섬유 캐뉼라</td><td>Doric 렌즈&nbsp;</td><td>MFC_480/500-0.5_5mm_ZF1.25_C45</td><td>5mm 길이의 캐뉼라, 외경 500 &마이크로; m 및 480 &m의 내경. NA 값은 0.5입니다. 페룰은 지르코니아, 1.25mm OD입니다. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=6036</td></tr><tr><td>전원 공급 장치</td><td>THORLABS</td><td>KPS101</td>은 <td>2.4 A의 전류로 15 V를 공급 https://www.thorlabs.com/search/thorsearch.cfm?search=KPS101</td></tr><tr><td>LG3 레이저 안전 고글&nbsp;</td><td>THORLABS</td><td>LG3</td><td>오렌지 렌즈는 47%의 가시광 투과율 https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=762&pn=LG3#2523</td></tr><tr><td>레드 라이트를 제공합니다.</td><td>전자 현미경 과학</td><td>74327-10</td><td>15 W 램프 https://us.vwr.com/store/product/12360027/paterson-safelight-electron-microscopy-sciences</td></tr><tr><td>Intestinal cell isolation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Patterson Veterinary</td><td>07-893-1389</td><td>주의: 이 마취제를 흡입하면 현기증, 졸음 또는 심지어 의식을 잃을 수 있습니다. 이 마취제는 클래스 II 후드에 사용해야 합니다.&nbsp; https://www.pattersonvet.com/Supplies/ProductFamilyDetails/PIF_762328?carouselPageNumber=3</td></tr><tr><td>1X HBSS</td><td>Gibco</td><td>14025076</td><td>Ca/Mg 프리</td></tr><tr><td>https://www.fishersci.com/shop/products/gibco-hbss-calcium-magnesium-no-phenol-red-4/14025076?searchHijack=true&searchTerm=14025076&searchType=RAPID&matchedCatNo=14025076 송아지 세럼</td><td>하이클론 AZM</td><td>197696</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15575020</td><td>0.5M 농도</td></tr><tr><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15575020?SID=srch-srp-15575020 DTT</td><td>Sigma</td><td>10197777001</td><td>주의: 삼키면 유해하며 피부 자극을 유발합니다. 1M 농도</td></tr><tr><td>https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/dttro?lang=en&region=US HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td>1 M 농도 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15630080?SID=srch-hj-15630080</td></tr><tr><td>페트리 접시</td><td>Corning</td><td>353004</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-easy-grip-tissue-culture-dishes-2/08772f?searchHijack=true&searchTerm=08772F&searchType=RAPID&matchedCatNo=08772F</td></tr><tr><td>70 미크론 셀 스트레이너</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/087712</td></tr><tr><td>마이크로 마그네틱 스티어 바</td><td>Fisherbrand</td><td>1451364</td><td>사용 후 70% 에탄올로 헹굽니다. 매번 사용하기 전에 증류수로 여러 번 헹굽니다. 막대는 길이가 8mm이고 팔각형 모양입니다. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-octagonal-magnetic-stir-bars-12/1451364#?keyword=1451364</td></tr><tr><td>자석 교반 판</td><td>코닝 실험실 교반기</td><td>440826</td><td>https://www.coleparmer.com/i/corning-440826-nine-position-stirrer-120-vac-60-hz/8430420?PubID=UX&persist=true&ip=no&gclid=CjwKCAiAqbvTBRAPEiwANEkyCLPLrWABXmOUI0QE53NLV0Owxlcs2V1K6rWbRPOwlcVVDq000FBiQxoCqQAQAvD_BwE</td></tr><tr><td>콜라겐 분해 효소</td><td>Roche</td><td>5401020001</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/05401020001?lang=en&region=US&gclid=CjwKCAiAjuPRBRBxEiwAeQ2QPhE44qlvxjmo1PYu3zCas3w-_d6P9gKjXW82-c1EOm6NjPHCc5WuixoC_0IQAvD_BwE</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma</td><td>10104159001</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/10104159001?lang=en&region=US</td></tr><tr><td>1X PBS</td><td>Gibco</td><td>20012-027</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/20012027?SID=srch-hj-20012-027</td></tr><tr><td>피펫 보조제</td><td>Thermo Scientific</td><td>14387165</td><td></td></tr><tr><td>https://www.fishersci.com/shop/products/s1-pipette-fillers/14387165#?keyword=14387165 10 mL 혈청학적 피펫</td><td>Falcon</td><td>357530</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-serological-pipets-bulk-pack-5/p-163659</td></tr><tr><td>25 mL 혈청학적 피펫</td><td>Falcon</td><td>357515</td><td></td></tr><tr><td>https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-serological-pipets-bulk-pack-5/p-163659 15 mL 코니컬 원심분리기 튜브</td><td>Thermo Scientific</td><td>339651</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/339650</td></tr><tr><td>50 mL 코니컬 원심분리기 튜브</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>339653 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/339650</td></tr><tr><td>Single cell suspension</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf tubes</td><td>Seal-Rite</td><td>1615-5500</td><td>1.5 mL를 담을 수 있습니다. https://www.usascientific.com/Seal-Rite-1.5-ml-tube.aspx</td></tr><tr><td>조직 균질화기&nbsp;</td><td>Kimble</td><td>K7495400000</td>는 <td>2개의 AA 배터리가 필요합니다. https://www.fishersci.com/shop/products/kontes-pellet-pestle-cordless-motor-cordless-motor/k7495400000</td></tr><tr><td>호모게나이저 팁&nbsp;</td><td>Kimble</td><td>7495210590</td><td>플라스틱, 0.5 mL 팁 https://www.fishersci.com/shop/products/kimble-chase-kontes-pellet-pestle-14/k7495210590#?keyword=7495210590</td></tr><tr><td>ACK 용해 버퍼</td><td>Gibco</td><td>A10492-01</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A1049201?SID=srch-hj-A10492-01</td></tr><tr><td>40 미크론 셀 스트레이너</td><td>Falcon</td><td>08-771-1</td><td></td></tr><tr><td>https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/087711Antibodies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BV786 안티-마우스 CD45&nbsp;</td><td>BD</td><td>564225</td><td>클론 3O-F11</td></tr><tr><td>https://www.bdbiosciences.com/us/reagents/research/antibodies-buffers/immunology-reagents/anti-mouse-antibodies/cell-surface-antigens/bv786-rat-anti-mouse-cd45-30-f11/p/564225 라이브/데드</td><td>Invitrogen</td><td>L34962</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/L34962</td></tr><tr><td>기타</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>면도기 블레이드</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td>참수에 사용합니다. https://us.vwr.com/store/product/4548306/vwr-razor-blades</td></tr></tbody></table>

vivo에서 photolabeling 신생아 쥐에 있는 조 혈 모 세포의 이동성 잠재력을 평가 하는 콜론에 셀의

In Vivo Photolabeling of Cells in the Colon to Assess Migratory Potential of Hematopoietic Cells in Neonatal Mice

장의 세균 지역 사회는 인생에서 일찍 고 면역 전지 개발 및 기능에 영향을 미칠. 신생아 microbiota 항생제 사용과 다이어트, 면역 및 염증 성 질병에 자화 율에 미치는 영향을 포함 하 여 수많은 외부 영향을 받기 쉽습니다. 장애 선 동적인 장 질병 (IBD) 등 내장에 면역 세포의 대규모 유입에 의해 특징. 그러나, 면역 세포는 microbiota에 의해 조절 또한 여분 장 사이트에 면역 반응에 영향을 창 자에서 이주 수 있습니다. 따라서, 식별 하 고 원심 사이트에 창 자에서 미생물 메시지를 전달 수 있습니다 셀을 특성화 하는 필요가 있다. 여기, 우리 신생아 쥐에 vivo에서 마이그레이션 후 장 외 사이트에 그들의 식별을 가능 하 게의 콜론에 레이블 셀 하는 방법을 설명 합니다.

광섬유 케이블은 2 일 오래 된 팜과excised 쥐의 콜론에 405 nm 빛을 전달 하기 위해 사용 되었다. 이전 실험에서 30 s 노출 최소 세포 (그림 1A) 독성 결 장 세포의 최대 photoconversion에 게 결정 했다. 따라서, 콜론의 다른 세그먼트의 순차 30 s 노출 프로토콜에 설명 된 대로 실시 했다. 레이저 노출에 따라 쥐 즉시 안락사 했다, 그리고 셀의 photoconversion 결정 했다. 총 결 장 조직의 단일 셀 준비 했다 형광 활용 된 안티 CD45 항 체로 얼룩진 고 흐름 cytometric 분석 photoconversion를 검출 하기 위하여 수행 되었다. 비전향 Dendra2-그린 (Dendra-g) 각각 490 553 nm에서 여기 및 방출 맥시 마는 단백질과 photoconverted Dendra2-레드 (Dendra-r) 단...

여기에 설명 된 프로토콜 여분 장 사이트에 결에서 이주 하는 면역 세포를 특별히 식별 하 신생아 쥐에 photolabeling 접근을 사용 합니다. 이 전략은 초기 생활에 호스트-미생물 상호작용 연구에 유용할 것 이다.

Vivo에서 Photolabeling 신생아 쥐에 있는 조 혈 모 세포의 이동성 잠재력을 평가 하는 콜론에 셀의

Enteric bacterial communities are established early in life and influence immune cell development and function. The neonatal microbiota is susceptible to ...

이 방법은 세포가 미생물 메시지를 전달하는지, 그렇다면 어떤 세포인지와 같은 신생아 숙주 면역 마이크로바이옴 상호 작용에 관한 점막 면역학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 유아 마우스의 결장 상주 세포를 비가역적으로 표시하여 장 외 부위로의 이동 패턴을 결정할 수 있다는 것입니다. 레이저를 조립하려면 LED의 4핀 M8 커넥터 케이블을 통해 발광 다이오드 또는 LED를 LED 드라이버에 연결하고 나사를 조심스럽게 조여 연결을 고정합니다.LED의 커넥터 입구를 조명까지 잡고 눈에 보이는 장애물이 없는지 확인합니다. 광유전학 패치 케이블을 개구부에 삽입합니다. 캐뉼러를 커넥터 슬리브의 양쪽 끝에 삽입합니다.그런 다음 커넥터 슬리브의 다른 쪽 끝을 패치 케이블 끝에 연결하여 광섬유 캐뉼러를 광섬유 패치 케이블에 연결합니다. 연속 조정 노브를 사용하여 LED 드라이버를 0에서 연속 웨이브 모드로 설정하고 전류 제한을 1.2로 설정합니다. 레이저가 준비되면 LED 드라이버를 어두운 장소의 전원에 꽂습니다.한 손을 사용하여 마취된 10-12일차 산후 쥐의 등을 검지와 엄지로 부드럽게 긁습니다. 동물을 뒤집어 복부를 드러내고 약지와 새끼 손가락 사이에 꼬리를 고정합니다. 다른 손을 사용하여 캐뉼라에서 보호 캡을 제거하고 항문을 통해 광섬유 캐뉼라를 결장에 부드럽게 삽입하여 광섬유의 5mm가 모두 마우스 내부에 있도록 하고 캐뉼라의 장축을 마우스의 정중선과 평행하게 유지합니다.유연성, 직경 및 길이를 포함한 캐뉼라의 설계는 이 절차의 성공에 매우 중요합니다. 신생아 새끼는 매우 연약하므로 결장에 천공이 생기지 않도록 세심한 주의를 기울여야 합니다. 보안경을 착용하고 레이저 전류를 최대치로 높이고 동물의 반투명한 복부를 보고 자외선의 존재를 확인합니다.빛에 노출되는 발광 면적을 최대화하기 위해 30초마다 약 1mm씩 캐뉼라를 빼냅니다. 총 2분 동안 자외선에 노출된 후 마우스에서 캐뉼라를 천천히 제거하고 레이저를 끕니다. 마취에서 회복 된 후 마우스를 가정용 케이지로 되돌립니다.장 림프구를 채취하려면 깨끗한 집게와 가위를 사용하여 복부를 열고 장을 한쪽으로 반사시켜 결장을 노출시킵니다. 결장 전체를 제거하려면 먼저 맹장 원위 조직을 절제하고 집게로 결장을 단단히 잡고 가위를 사용하여 요도를 통해 직장까지 자릅니다. 그런 다음 결장을 항문에 최대한 가깝게 자르고 복강에서 결장 전체를

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

이 문서는 배아 피부와 thymus 혈관을 라벨에 대한 방법을 설명합니다.

배아 마우스에 Vasculature을 라벨링하는 방법

신생아 인간의 사이토 메갈로 바이러스 (HCMV) 감염은 정신 지체의 중요한 원인을 나타내는, 아직 바이러스에 의한 발병으로 이어지는 분자 이벤트가 여전히 제대로 이해하고 있습니다. 뇌 감염의 역학을 조사하기 위해, 우리는 전체 - 동물의...

사용<em&gt; 생체 내</em&gt; 이미징 신생아의 실험 쥐 거대 세포 바이러스 감염의 진행 상황을 모니터링 할 수

우리는 생체 표지 세포와 마우스 모델에서 MRI를 사용하여 생체 내 세포 추적을위한 일반적인 프로토콜을 설명합니다. 셀 라벨, 이미지 수집 처리 및 정량화를위한​​ 일반적인 프로토콜이 포함되어 있습니다.

세포 추적을위한 생체 19 F MRI에서

조혈 줄기 및 전구 세포의 표시 조합 5 형광 단백질은 재생 중에 골수 조혈 아키텍처에 대한 통찰력을 제공하는 공 초점과 두 광자 현미경을 통해 생체 클론 추적에 있습니다. 이 방법은 이식 다음 시간의 광범위한 기간에 대한 손상 조직의 스펙트럼으로 구분 HSPCs 유래 세포의 비 침습적 운명 매핑 할 수 있습니다.

공 초점 및 다중 광자 현미경을 사용하여 다섯 형광 단백질에 의해 표시됨 조혈 줄기 및 전구 세포의 생체 내 클론 추적에서

조혈 줄기 및 전구 세포 (HSPCs) 및 골수 틈새 시장 사이의 상호 작용의 본질은 제대로 이해된다. 맞춤형 하드웨어 변형 및 다단계 획득 프로토콜은 생체 화상 골수 영역 내에 홈 표지 HSPCs 추적 상호 작용과 움직임 이광자 및 공 초점 현미경의 사용을 허용한다.

성인 마우스 두개골 골수에서 조혈 줄기 및 전구 세포의 생체 내 4 차원 추적에서

단핵구는 선천성 면역의 핵심 조절자이며 말초 단핵 식세포 시스템의 재생과 염증의 경우에 중요한 역할을 합니다. 이 원고는 단핵구 동원 메커니즘을 연구하기 위해 마우스 칼바리아 골수를 실시간으로 이미징하는 절차를 설명합니다.

마우스 골수 단핵구를 추적<em&gt; 생체</em

마취된 마우스에서 생체 내 컨포칼 현미경을 사용하여 정상 상태 및 염증 상태에서 장간막 정맥의 호중구 및 단핵구의 거동을 모니터링하는 프로토콜에 대해 자세히 설명합니다.

실시간으로 마취 마우스에 생체 내에 현미경으로 장간막 혈관에서 호중구와 단핵구 이미징

염증 부위에서 이펙터 CD4 T 세포의 삽입 운동을 제어하는​​ 메카니즘은 상대적으로 알려져 있지 않다. 우리는 시각화 현장에서 이러한 세포의 동적 거동의 연구를 허용 염증 귀 진피의 시험 관내 -primed CD4 T 세포에서 조작하는 비 침습적 방법을 제시한다.

염증이 진피의 이미징 CD4 T 세포 간질 마이그레이션

림프 구 chemotaxis 및 마이그레이션에 대 한 양적 평가 대 한 프로토콜은 면역학 연구를 위한 중요 한 도구입니다. 여기, 생체 외에서 프로토콜 허용 실시간, 다중화 세포 이동의 평가 뿐만 아니라 상호 보완적인 vivo에서 기술 활성화 추적 기본 셀의 비장에 설명 되어 있습니다.

인간 Monocyte Chemotaxis에서 생체 외에서 그리고 Vivo에서 인신 매매 Murine 림프 구 측정

우리는 거꾸로 회전 디스크 공초점 현미경 검사법에 의해 뮤린 소장의 내장 영상을 사용하여 GFP 표지된 γδ IELs를 구상하는 방법을 기술합니다. 이 기술은 최대 4 시간 동안 점막 내의 살아있는 세포의 추적을 가능하게하고 장 내 면역 상피 상호 작용의 다양한 조사하는 데 사용할 수 있습니다.

뮤린 소장에서 상피 내 림프구의 활력 영상

호중구 이동은 화학 유인 물질 및 세포 외 미세 환경과의 상호 작용에 대한 반응으로 원형질막의 빠르고 지속적인 리모델링에 의존합니다. 본원에서는 마취된 마우스의 귀에 주입된 호중구에서 막 리모델링의 역학을 조사하기 위한 Intravital Subcellular Microscopy에 기초한 절차가 설명됩니다.

생리학적 조건에서 세포하막 리모델링을 조사하기 위해 마우스 피부의 호중구 이동을 이미징합니다.

배우세요 신생아 쥐에서 포토라벨링을 이용한 결장 면역세포 이동성 분석 방법을. 이 기술은 장내 미생물 상호작용 및 면역세포 추적 연구에 활용됩니다.

Vivo에서 Photolabeling 신생아 쥐에 있는 조 혈 모 세포의 이동성 잠재력을 평가 하는 콜론에 셀의

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