1: Lote y biorreactores continuos

Los biorreactores, también conocidos como fermentadores, son sistemas de cultivo celular que proporcionan entornos de crecimiento adecuados. Dos tipos de biorreactores se utilizan comúnmente en el cultivo celular, biorreactores de tanque agitado continuo y por lotes. Un reactor discontinuo es un sistema de recipiente cerrado que contiene todos los componentes necesarios para el cultivo celular, mientras que un reactor de tanque agitado continuo es un sistema abierto donde los componentes fluyen activamente hacia adentro y hacia afuera, lo que permite la eliminación de desechos y la reposición de nutrientes. Para maximizar el crecimiento y la densidad celular, se pueden controlar múltiples parámetros del reactor para ambos sistemas, incluida la temperatura, la presión, el oxígeno disuelto y el pH. Este video presentará los principios fundamentales detrás de los reactores continuos y por lotes y demostrará un procedimiento que detalla su uso en el laboratorio.

El tipo más simple de biorreactor es el reactor por lotes, que es un sistema cerrado que contiene medios de cultivo celular y una población de células. A medida que las células crecen, consumen los nutrientes y excretan los desechos, que se acumulan en el recipiente. También se utilizan reactores de tanque agitado continuo, que son sistemas abiertos donde los nutrientes fluyen continuamente hacia adentro y las celdas y los desechos celulares fluyen hacia afuera. Esto permite el control de la densidad celular mediante la eliminación de residuos y la reposición de nutrientes. Antes del uso de cualquiera de los sistemas, los componentes se esterilizan, generalmente usando vapor, para mitigar la contaminación. Cuando el reactor está completamente ensamblado, se agregan medios de cultivo estériles al recipiente principal y luego se inocula con un cultivo iniciador. Durante el uso, la mezcla y la oxigenación se controlan con el uso de impulsores para mantener una solución homogénea en la que las células reciben cantidades suficientes de nutrientes y oxígeno necesarios para el crecimiento. Además, los sistemas de tanques fermentadores a menudo están equipados con sondas para medir condiciones como la temperatura, el oxígeno disuelto y el pH para garantizar condiciones óptimas para el crecimiento. Durante el crecimiento por lotes, la población celular pasa por fases clásicas de crecimiento. En primer lugar, las células entran en la fase de retraso, en la que las células crecen lentamente a medida que se adaptan a su entorno. A continuación, las células entran en la fase logarítmica y se dividen a un ritmo exponencial hasta que los nutrientes se agotan o los subproductos tóxicos alcanzan un nivel crítico. Eventualmente, el crecimiento se ralentiza y las células alcanzan la fase estacionaria, lo que brinda la oportunidad de cosechar el producto de interés del cultivo. El producto es secretado por las células y recogido directamente del caldo de cultivo, o el producto permanece en la célula y debe eliminarse mediante lisis celular. Después de la cosecha, el reactor se prepara para un nuevo lote de cultivo celular mediante limpieza y esterilización.

Los reactores de tanque agitado continuo exhiben patrones de crecimiento similares inicialmente y alcanzan una densidad de celda constante en operación de estado estacionario. Sin embargo, esta densidad de celda depende de la tasa de dilución, que es la tasa de alimentación y efluente dividida por el volumen del reactor. Por lo tanto, a medida que la tasa de dilución se acerca a uno, la densidad celular disminuye. Al considerar las configuraciones de biorreactores, es útil tener en cuenta que los reactores discontinuos se utilizan a menudo debido a su simplicidad y bajo costo, aunque la densidad celular es limitada. Los reactores continuos son capaces de aumentar la densidad de las células. Sin embargo, a altas densidades celulares puede producirse una agregación, lo que impide un crecimiento óptimo. Además, los períodos más largos de fermentación pueden aumentar el riesgo de contaminación del cultivo.

Ahora que hemos introducido los reactores discontinuos y continuos, examinemos un procedimiento para ambos, comenzando con el reactor discontinuo. Antes del uso del reactor por lotes, los medios celulares se agregan a un recipiente de reacción limpio. Una vez llenos, los componentes del recipiente se enjuagan con agua desionizada y se ensamblan. Los componentes incluyen la placa principal, la tubería de recolección para el muestreo de cultivos, un impulsor para mantener la uniformidad del cultivo y la oxigenación de los medios, y un rociador de gas para proporcionar infusión de gas al cultivo. El montaje continúa con la instalación de una sonda de oxigenación para medir el contenido de oxígeno disuelto en el recipiente, líneas de alimentación para agregar ácido o base para controlar el pH y una sonda de pH calibrada. Cuando todos los componentes están instalados, el reactor ensamblado se esteriliza mediante un autoclave. A continuación, el recipiente se instala en la base del fermentador, donde tanto la sonda de pH como la sonda de oxígeno se conectan al ordenador. Además, el rociador de gas está conectado a un rotámetro de gas, que mide el caudal de gas. En este momento, se enciende el impulsor y se ajustan el flujo de gas, la temperatura y la agitación del recipiente hasta que se alcanzan los parámetros deseados. A continuación, el puerto de inoculación se esteriliza con alcohol y el cultivo iniciador se dispensa en la vasija del reactor. Durante el funcionamiento, se extraen muestras de cultivo celular en puntos de tiempo seleccionados para construir una curva de crecimiento basada en mediciones de densidad celular. Cuando la densidad celular alcanza el nivel deseado, el cultivo se detiene y las células se recolectan del recipiente a través de una serie de pasos de filtración. El resto del contenido de los recipientes se elimina con lejía u otros contenidos antimicrobianos.

Al igual que los reactores discontinuos, los reactores de tanque agitado continuo, a veces llamados quimiostatos, requieren que sus componentes individuales se enjuaguen a fondo con agua desionizada antes del ensamblaje. Una vez limpio, el conjunto del agitador y los componentes del eje de transmisión se encajan, y la vasija del reactor se llena con agua desionizada para mejorar la esterilización durante el autoclave. Las sondas de oxígeno disuelto, pH y temperatura se calibran y luego se instalan. Con la vasija completamente ensamblada, el reactor se esteriliza mediante un autoclave. Después de la esterilización, el recipiente se coloca en una camisa térmica para controlar su temperatura y se conectan las sondas calibradas. A continuación, se conectan la garrafa de medios y el suministro de aire con un filtro estéril antes de abrir el flujo de aire. El recipiente se ceba con medios estériles soltando el tubo de garrafón y luego ejecutando el programa básico del fermentador. A medida que los medios fluyen hacia el reactor activo, el puerto de inoculación se esteriliza con alcohol antes de agregar un mililitro de cultivo iniciador al recipiente. Durante el funcionamiento, se toman muestras de cultivo en puntos de tiempo seleccionados para medir la densidad celular. Estos datos se utilizan para construir una curva de crecimiento. El crecimiento óptimo se logra cuando el cultivo alcanza un estado estacionario, lo que significa que la densidad celular permanece constante.

Ahora que ha aprendido sobre los reactores de tanque agitado continuo y por lotes, veamos algunas aplicaciones prácticas de esta tecnología. La elaboración de cerveza se realiza normalmente cultivando levadura en un sistema de reactor por lotes. A un reactor se le añade un conjunto de ingredientes básicos que consisten en agua purificada, cebada malteada, lúpulo y levadura. La cebada malteada estimula el proceso de fermentación al actuar como una fuente de alimento rica en azúcar para la levadura, que, cuando se consume, da como resultado la producción de alcohol como producto de desecho. Una vez que la mezcla ha alcanzado su contenido de alcohol objetivo, o se ha fermentado durante el tiempo prescrito, se puede filtrar, empaquetar y dejar envejecer para inducir la carbonatación antes de que se distribuya el producto final. Los reactores estándar también se pueden personalizar para fines especializados. Por ejemplo, los reactores especializados se pueden utilizar para aumentar la viabilidad celular de los andamios de tejidos a través de una mejor distribución de células y nutrientes mediante una mezcla constante. Al mismo tiempo, se puede aplicar estimulación mecánica al andamio para estimular la producción de matriz extracelular y dirigir activamente el crecimiento y la diferenciación celular. Los andamios resultantes tienen propiedades fisiológicas y mecánicas mejoradas, lo que los hace atractivos para la implantación.

Acabas de ver el vídeo de Jove sobre los reactores de agitación discontinua y continua. Ahora debería comprender cómo funcionan los biorreactores de tanque agitado continuo y por lotes, y cómo se pueden aplicar estos sistemas en el campo de la bioingeniería. Gracias por mirar.