Biosensores ópticos
Biosensores ópticos utilizan luz para detectar la Unión de una molécula objetivo. Estos sensores pueden utilizar una molécula de la etiqueta, que prod…
Biosensores ópticos son sensores que detectan un destino biológico u objetivos de interés usando la luz. Estos dispositivos han encontrado aplicaciones en salud, productos farmacéuticos, monitoreo ambiental, seguridad nacional y el campo de batalla. Biosensores ópticos se dividen ampliamente en sensores basados en la etiqueta y sin etiqueta. Un ejemplo de detección de etiqueta es reacción en cadena de polimerasa, o PCR, que utiliza etiquetas fluorescentes o fluoróforos, para cuantificar el ADN diana amplificado. Un ejemplo de un método libre de etiqueta es resonancia de plasmones de superficie o SPR. Aquí, la interacción de biomoléculas inalterado con la superficie del sensor se cuantifica mediante la medición de una característica fundamental del sensor, como el ángulo de reflexión. Este vídeo repasa los conceptos básicos de estos tipos de Técnicas Biosensibles óptica y sus componentes críticos, los principios de funcionamiento y aplicaciones comunes de biosensores ópticos.
En primer lugar, echemos un vistazo a los principios generales de biodetección óptica basada en etiquetas. Normalmente, una sonda o biorreconocimiento elemento, como un anticuerpo complementario, se une en la superficie del sensor mediante química tradicional inmovilización. La solución de la muestra es entonces fluyó sobre la superficie de los sensores. La molécula objetivo, que es gratuita para el elemento de biorreconocimiento inmovilizados, selectivamente se captura de la solución de la muestra compleja. Entonces la solución de muestra exceso es lavada con agua o buffer. A continuación, para ayudar a visualizar y cuantificar la cantidad de destino consolidado, una molécula secundaria que ofrece el destino y Unidos a un fluoróforo es fluyó a través del sistema. Después de algún tiempo, cuando ha ocurrido el atascamiento de la molécula de secundaria en el destino, el fluoróforo exceso se lava lejos. Intensidad del fluoróforo encuadernado entonces puede cuantificarse usando un microscopio de fluorescencia. Esta intensidad se traza primero para que diferentes concentraciones de destino conocido crear una curva de calibración, que luego permite la medida directa de una cantidad desconocida de objetivo capturada. Así, técnicas basadas en la etiqueta usan la intensidad de fluorescencia de fluoróforos extremadamente sensibles para cuantificar la concentración de las biomoléculas de interés.
Ahora que hemos repasado los principios de biosensores ópticos basados en etiquetas, echemos un vistazo a un ejemplo comúnmente usado, el estándar actual para la amplificación de DNA, PCR cuantitativa o qPCR. La mezcla de reacción de qPCR incluye una sonda marcada para la cuantificación de la reacción en tiempo real. La secuencia de la sonda conectada a reportero fluorescente y las moléculas del extintor y se une a una secuencia específica de ADN. La molécula de extintor apaga emisión del fluoróforo mientras ambos están conectados a la sonda. Durante la reacción de PCR, la enzima polimerasa degrada la sonda de ADN y separa físicamente el reportero fluoróforo, evitando así el enfriamiento y resultando en un incremento en fluorescencia. Para realizar la qPCR, primero agregar todos los componentes de la reacción, incluyendo las sondas marcadas, en un tubo PCR o bien. A continuación, coloque los pozos de la PCR en un termociclador especializado y especifique los parámetros para cada ciclo y el número de ciclos. El termociclador utilizado para qPCR incluye una fuente de luz con los componentes ópticos necesarios para seleccionar una longitud de onda y un detector para medir la intensidad de fluorescencia en tiempo real durante la reacción de PCR. Al final de cada ciclo térmico, la intensidad fluorescente debido a los fluoróforos liberado es grabada y trazada. La intensidad fluorescente es directamente proporcional al logaritmo de la concentración de destino en el pozo de reacción, y por lo tanto, para una conocido de la fluorescencia, puede calcularse la concentración objetivo desconocido.
Ahora veamos cómo detección se logra sin cualquier reporteros como fluoróforos, uso libre de etiqueta óptica técnicas de detección. Técnicas de etiqueta-libre, la inmovilización de los elementos de bioreconocimiento es igual a la técnica basada en etiquetas. Cualquier accesorio de biomoléculas a la superficie de estos sensores modifica el índice de refracción en las inmediaciones del dispositivo óptico. Las moléculas de la blanco se unen a la superficie del dispositivo óptico funcionalizado formando una capa delgada y además modificar el índice de refracción. Estos cambios en el índice de refracción pueden ser monitoreados por el cambio en la frecuencia natural de vibración, o la frecuencia de resonancia del sistema de seguimiento. La diferencia en las frecuencias resonantes antes y después del enlace de blanco, llamado el cambio de f, es directamente proporcional a la concentración del objetivo capturado.
Ahora echemos un vistazo a los principios básicos de un uso común libre de etiqueta ópticos de detección técnica, resonancia de plasmones de superficie o SPR. Un instrumento típico de la SPR combina una fuente de láser movible, un detector óptico para medición de intensidad de cambio y un chip sensor con un prisma de vidrio recubierto por una cara con oro. El prisma cubierto de oro está integrado con un sistema neumático que permite una operación de flujo. En un experimento, la molécula de sonda o elementos de bioreconocimiento, se une a la superficie de oro. El elemento de destino entonces fluye sobre la superficie y se une a la sonda inmovilizada. De detección utiliza el fenómeno de la SPR. Esto ocurre cuando la luz polarizada se muestra en la superficie del metal, como el oro, en un ángulo específico, theta SPR. Esto resulta en la generación de plasmones de superficie que son oscilaciones coherentes de electrones que existen en la interfase de dos materiales que tienen permittivities de signos opuestos. Cuando la masa sujeta a cambios de la superficie del sensor, se altera la condición de resonancia de plasmones de superficie. En consecuencia, cuando sólo el elemento de biorreconocimiento es dependiente en la superficie, el rayo se refleja en un ángulo, theta uno. Entonces, cuando más masa se une a la superficie, como el objetivo capturado, una reducción de la intensidad de luz reflejada en ángulo específico, theta SPR se observa, como el ángulo de reflexión cambia a theta dos. El cambio en la intensidad de la luz reflejada en el ángulo de resonancia, theta SPR, es entonces una función del ángulo de la luz reflejada y puede medirse como la diferencia en los ángulos, theta uno y theta dos.
Ahora que hemos cubierto los principios y procedimiento detrás de biosensores ópticos, vamos a ver cómo los investigadores están aplicando estas técnicas hoy en día. El citómetro de flujo de la célula es un sistema de biodetección óptica que se utiliza habitualmente para recuento de células y medir una variedad de otros componentes y propiedades celulares. Se prepara una muestra formada por múltiples tipos celulares, cada una etiquetada con un fluoróforo único, en una suspensión. Luego, la muestra se desarrolla a través del citómetro de flujo tal que las células ejecutan más allá de un rayo láser de uno al mismo tiempo. Como cada célula atraviesa el rayo láser, dispersos y emitido fluorescente luz por los diferentes fluoróforos son por separado cuantificados, que da una cuenta directa de los distintos tipos de células en la muestra. Otra aplicación de biosensores ópticos es la detección de bacterias en las muestras. Una manera de hacer esto es utilizando sensores de resonador óptico anillo. Están compuestas por un circuito cerrado juntado a la entrada de luz y guías de onda de salida. Cuando luz de longitud de onda resonante se aplica la guía de onda de entrada, se pasa a través del lazo y acumula una intensidad durante varios viajes de ida debido a la interferencia constructiva y la salida de la guía de onda de salida. Anticuerpos específicos para proteínas de superficie bacterianas son inmovilizados en la superficie del resonador de anillo y se obtiene un espectro de absorción de la línea de base. Entonces la muestra bacteriana es fluida en la superficie del resonador para permitir la Unión bacteriana al cuerpo inmovilizado, tras lo cual se obtiene un segundo espectro de absorción. Si se observa la bacteria de interés se une, un cambio visible en los picos de resonancias, que es directamente proporcional a la concentración de las bacterias de la blanco.
Sólo has visto video de Zeus en biodetección óptica. Hemos hablado de los principios básicos de la detección basada en etiquetas y libre de etiqueta óptica junto con dos ejemplos destacados de estos métodos y algunas aplicaciones de las técnicas. Gracias por ver.
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Los biosensores ópticos son sensores que detectan un objetivo biológico o objetivos de interés utilizando la luz. Estos dispositivos han encontrado aplicaciones en la atención médica, los productos farmacéuticos, el monitoreo ambiental, la seguridad nacional e incluso en el campo de batalla. Los biosensores ópticos se dividen en sensores basados en etiquetas y sensores sin etiquetas. Un ejemplo de detección basada en etiquetas es la reacción en cadena de la polimerasa, o PCR, que utiliza etiquetas fluorescentes, o fluoróforos, para cuantificar el ADN objetivo amplificado. Un ejemplo de un método sin etiquetas es la resonancia de plasmón de superficie, o SPR. Aquí, la interacción inalterada de las biomoléculas con la superficie del sensor se cuantifica midiendo una característica fundamental del sensor, como el ángulo de reflexión. Este video revisa los conceptos básicos de estos tipos de técnicas de biodetección óptica y sus componentes críticos, los principios de funcionamiento y las aplicaciones comunes de los biosensores ópticos.
En primer lugar, echemos un vistazo a los principios generales de la biodetección óptica basada en etiquetas. Por lo general, una sonda o un elemento de biorreconocimiento, como un anticuerpo complementario, se adhiere a la superficie del sensor mediante la química de inmovilización tradicional. A continuación, la solución de muestra fluye sobre la superficie de los sensores. La molécula objetivo, que es complementaria al elemento de biorreconocimiento inmovilizado, se captura selectivamente de la solución de muestra compleja. A continuación, el exceso de solución de muestra se lava con tampón o agua. A continuación, para ayudar a visualizar y cuantificar la cantidad de objetivo unido, una molécula secundaria que es complementaria al objetivo y unida a un fluoróforo, fluye a través del sistema. Después de un tiempo, cuando se ha producido la unión de la molécula secundaria al objetivo, el exceso de fluoróforo no unido se elimina. La intensidad del fluoróforo unido se puede cuantificar utilizando un microscopio fluorescente. Esta intensidad se traza primero para varias concentraciones de objetivos conocidos para crear una curva de calibración, que luego permite la medición directa de una cantidad desconocida de objetivo capturado. Por lo tanto, las técnicas basadas en marcadores utilizan la intensidad de fluorescencia de fluoróforos extremadamente sensibles para cuantificar la concentración de la biomolécula de interés.
Ahora que hemos revisado los principios de los biosensores ópticos basados en etiquetas, echemos un vistazo a un ejemplo comúnmente utilizado, el estándar actual para la amplificación de ADN, PCR cuantitativa o qPCR. La mezcla de reacción qPCR incluye una sonda etiquetada para la cuantificación de la reacción en tiempo real. La secuencia de la sonda se une tanto a las moléculas indicadoras fluorescentes como a las extintoras, y se une a una secuencia de ADN específica. La molécula extintora apaga la emisión del fluoróforo mientras ambos están unidos a la sonda. Durante la reacción de PCR, la enzima polimerasa degrada el ADN de la sonda y separa físicamente el reportero de fluoróforo, evitando así el enfriamiento y dando lugar a un aumento de la fluorescencia. Para realizar qPCR, primero agregue todos los componentes de la reacción, incluidas las sondas marcadas, en un tubo o pocillo de PCR. A continuación, coloque los pocillos de PCR en un termociclador especializado e introduzca los parámetros de cada ciclo y el número de ciclos. El termociclador utilizado para qPCR incluye una fuente de luz con los componentes ópticos necesarios para seleccionar una longitud de onda y un detector para medir la intensidad de fluorescencia en tiempo real durante la reacción de PCR. Al final de cada ciclo térmico, se registra y traza la intensidad fluorescente debida a los fluoróforos liberados. La intensidad fluorescente es directamente proporcional al logaritmo de la concentración objetivo en el pozo de reacción y, por lo tanto, para una fluorescencia conocida, se puede calcular la concentración objetivo desconocida.
Veamos ahora cómo se puede lograr la detección sin ningún indicador, como los fluoróforos, utilizando técnicas de detección óptica sin etiquetas. En el caso de las técnicas sin etiquetas, la inmovilización del elemento de biorreconocimiento es la misma que la técnica basada en etiquetas. Cualquier unión de una biomolécula a la superficie de estos sensores modifica el índice de refracción en las inmediaciones del dispositivo óptico. Las moléculas objetivo se unen a la superficie del dispositivo óptico funcionalizado formando una capa delgada y modificando aún más el índice de refracción. Estos cambios en el índice de refracción se pueden monitorear mediante el seguimiento del cambio en la frecuencia natural de la vibración o la frecuencia de resonancia del sistema. La diferencia en las frecuencias de resonancia antes y después de la unión del objetivo, llamada desplazamiento f, es directamente proporcional a la concentración del objetivo capturado.
Ahora echemos un vistazo a los principios básicos de una técnica de detección óptica sin etiquetas de uso común, la resonancia de plasmón de superficie o SPR. Un instrumento SPR típico combina una fuente láser móvil, un detector óptico para medir el cambio de intensidad y un chip sensor con un prisma de vidrio recubierto de oro por un lado. El prisma recubierto de oro está integrado con un sistema fluídico que permite una operación de flujo continuo. En un experimento, la molécula de la sonda, o elemento de biorreconocimiento, se adhiere a la superficie de oro. A continuación, el elemento objetivo fluye sobre la superficie y se une a la sonda inmovilizada. La detección utiliza el fenómeno SPR. Esto ocurre cuando la luz polarizada se muestra en la superficie del metal, como el oro, en un ángulo específico, theta SPR. Esto da como resultado la generación de plasmones de superficie, que son oscilaciones electrónicas coherentes que existen en la interfaz de dos materiales que tienen permitividades de signos opuestos. Cuando cambia la masa unida a la superficie del sensor, se altera la condición de resonancia de los plasmones de superficie. En consecuencia, cuando solo el elemento de biorreconocimiento está unido a la superficie, el haz se refleja en un ángulo, theta uno. Luego, cuando se adhiere más masa a la superficie, como el objetivo capturado, se observa una reducción de la intensidad de la luz reflejada en el ángulo específico, theta SPR, ya que el ángulo de reflexión cambia a theta dos. El cambio en la intensidad de la luz reflejada en el ángulo de resonancia, theta SPR, es entonces una función del ángulo de la luz reflejada, y se puede medir como la diferencia de ángulos, theta uno y theta dos.
Ahora que hemos cubierto los principios y el procedimiento detrás de los biosensores ópticos, veamos cómo los investigadores están aplicando estas técnicas en la actualidad. El citómetro de celda de flujo es un sistema óptico de biodetección que se usa comúnmente para contar células y medir una variedad de otras propiedades y componentes celulares. Una muestra que consta de varios tipos de células, cada una marcada con un fluoróforo único, se prepara en una suspensión. Luego, la muestra se pasa a través del citómetro de flujo de modo que las células pasan por un rayo láser una a la vez. A medida que cada célula pasa a través del rayo láser, la luz fluorescente dispersada y emitida por los diferentes fluoróforos se cuantifica por separado, lo que da un recuento directo de los distintos tipos de células en la muestra. Otra aplicación de los biosensores ópticos es la detección de bacterias en muestras. Una forma de hacerlo es mediante el uso de sensores ópticos de resonador de anillo. Están compuestos por un bucle cerrado acoplado a guías de onda de entrada y salida de luz. Cuando se aplica luz de longitud de onda resonante a la guía de onda de entrada, pasa a través del bucle y acumula una intensidad durante múltiples viajes de ida y vuelta debido a la interferencia constructiva y se emite a la guía de onda de salida. Los anticuerpos específicos para las proteínas de la superficie bacteriana se inmovilizan en la superficie del resonador del anillo y se obtiene un espectro de absorción basal. A continuación, la muestra bacteriana fluye sobre la superficie del resonador para permitir la unión bacteriana al cuerpo inmovilizado, tras lo cual se obtiene un segundo espectro de absorción. Si la bacteria de interés se une, se observa un cambio visible en los picos de resonancia, que es directamente proporcional a la concentración de las bacterias objetivo.
Acabas de ver el vídeo de JoVE sobre la biodetección óptica. Discutimos los principios básicos de la detección óptica basada en etiquetas y sin etiquetas, junto con dos ejemplos destacados de estos métodos y algunas aplicaciones de las técnicas. Gracias por mirar.
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Q1: What is the difference between label-based and label-free optical biosensors?
Label-based biosensors use fluorescent molecules called fluorophores attached to secondary probes to generate measurable signals, such as in quantitative PCR. Label-free biosensors detect binding by monitoring changes in optical properties like refractive index without adding reporter molecules. Both approaches immobilize biorecognition elements on sensor surfaces but differ in how they quantify target binding. Optical and electrochemical biosensors represent complementary detection strategies in modern bioanalysis.
Q2: How does quantitative PCR use fluorescence to measure DNA concentration?
In qPCR, a labeled probe contains both a fluorescent reporter and a quencher molecule that suppresses fluorescence when attached. During PCR amplification, the polymerase degrades the probe, separating the fluorophore from the quencher and releasing fluorescence. The thermocycler measures fluorescent intensity in real time at each cycle, which is directly proportional to the logarithm of target DNA concentration.
Q3: What role does the biorecognition element play in optical biosensing?
The biorecognition element, such as a complementary antibody, is immobilized on the sensor surface using chemical attachment methods. It selectively captures target molecules from complex sample solutions based on molecular specificity. This immobilized probe forms the foundation for both label-based and label-free detection methods by enabling selective binding of targets.
Q4: How does Surface Plasmon Resonance detect target binding without labels?
SPR uses polarized light directed at a gold-coated prism at a specific angle to generate surface plasmons, which are coherent electron oscillations at the metal interface. When target molecules bind to immobilized probes on the gold surface, the mass changes alter the resonance condition. This shifts the angle of reflected light, and the change in reflection intensity at the resonance angle is measured and quantified.
Q5: What is a calibration curve and why is it important in label-based biosensing?
A calibration curve is created by plotting fluorescent intensity measurements against known target concentrations. This curve establishes the relationship between fluorescence signal and target concentration. Once established, the calibration curve allows researchers to determine unknown target concentrations by measuring the fluorescent intensity of unknown samples and referencing the curve.
Q6: How does flow cytometry use optical biosensing to identify cell types?
Flow cytometry prepares cell samples with each cell type tagged with a unique fluorophore. Cells flow past a laser beam one at a time, and scattered and emitted fluorescent light from different fluorophores are separately quantified. This direct measurement provides accurate counts of various cell types in the sample based on their distinct fluorescent signatures.
Q7: How do optical ring resonators detect bacteria in samples?
Optical ring resonators consist of a closed loop coupled to input and output waveguides. Antibodies specific to bacterial surface proteins are immobilized on the resonator surface. When bacterial samples flow over the surface and bind to antibodies, the resonant peaks shift visibly. This shift is directly proportional to bacterial concentration, enabling sensitive detection and quantification.