Name: 기본 백혈병 세포의 신진 대사 프로필의 평가 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 21 s
Description: 학습하세요 백혈병 환자 골수에서 백혈병 세포를 분리하고 실시간으로 신진대사를 분석하는 방법을. 밀도 구배 원심분리를 통해 단핵 세포를 분리하고 세포 외 유량 분석기로 대사 상태를 측정합니다. 이 프로토콜은 맞춤형 의학을 위한 백혈병 세포 대사 연구에 활용됩니다.

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우리는 체코 소아 혈액학 센터 감사 하 고 싶습니다. 이 작품은 내가 nr 부여의 사역의 건강 (NV15-28848A), 보건 및 교육, 청소년 및 스포츠 NPU 대학 병원 Motol, 체코 공화국, 프라하, 체코 공화국 00064203에 의해에서 지원. LO1604입니다.

모든 샘플 어린이 부모 또는 보호자의 informed consent와 찰스 대학에서 프라하, 체코 공화국, 연구 윤리 위원회의 승인을 얻어 졌다 아니. NV15-28848A입니다.
1입니다. 시 약의 준비
<ol><li>137 mM NaCl, 2.7 m m KCl, 4.3 m m 나2HPO4, 1.47 m m KH2포4, ddH2HCl Sterilize와 O. 조절 pH 7.4에 압력가 마로 소독 하 여 용 해 하 여 PBS의 500 mL를 준비 합니다.</li>
	<li>100ml RPMI 매체의 준비: L-Alanyl-글루타민 보충 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 페니실린 (100 U/mL)와 스 (100 μ g/mL)와 RPMI-1640 매체.</li>
	<li>0.1 m M NaHCO3 증류수 50 mL를 준비 합니다. 8.1에 pH를 조정, 필터 (0.22 μ m) 소독 및 4 ° c.에 저장 참고: 두 개의 8-잘 세포 외 유출 분석기 접시, 0.1 m M NaHCO3 pH 8.1의 250 μ 준비.</li>
	<li>1 mL의 증류수에 2 M D-포도 준비 합니다. 필터 (0.22 μ m)을 소독 하 고-20 ° c.에 저장</li>
	<li>1mm Oligomycin A 에탄올에서의 100 μ를 준비 합니다. 필터 (0.22 μ m)을 소독 하 고-20 ° c.에 저장</li>
	<li>1 M 2-의하여-D-포도 당 (2-DG) 최소 DMEM (Dulbecco의 수정이 글의 중간)에서 250 μ를 준비 합니다. 37 ° C로 온난 하 고 pH 7.4 (37 ° C에서 pH 측정 수행)를 조정 합니다. 필터 (0.22 μ m)을 소독 하 고-20 ° c.에 저장</li>
	<li>1mm DMSO에 FCCP (carbonyl 시안-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone)의 100 μ를 준비 합니다. 필터 (0.22 μ m)을 소독 하 고-20 ° c.에 저장</li>
	<li>100 μ에서 에탄올 1 m m로 테 논의를 준비 합니다. 필터 (0.22 μ m)을 소독 하 고-20 ° c.에 저장</li>
	<li>1 mg/mL 에탄올에 Antimycin A의 100 μ를 준비 합니다. 필터 (0.22 μ m)을 소독 하 고-20 ° c.에 저장</li>
	<li>바로 사용 전에 분해 스트레스 테스트 매체의 10 mL를 준비 합니다. 물 욕조에 37 ° C 최소한 DMEM 따뜻한 고 pH 7.4 (37 ° C에서 pH 측정 수행)를 조정 합니다.</li>
	<li>이전에 사용 하 여, BSA와 셀 미토 스트레스 테스트 매체의 10 mL를 준비 합니다. 2 m L-글루타민, 10 m m D-포도 당, 1mm HEPES (pH 7.4), 1 mM pyruvate와 0.1 %BSA (소 혈 청 알 부 민) 최소 DMEM을 보충. 따뜻한 물 욕조에 37 ° C를 pH 7.4 (37 ° C에서 pH 측정 수행)를 조정 합니다.</li>
	<li>이전에 사용 하 여, BSA 없이 셀 미토 스트레스 테스트 매체의 10 mL를 준비 합니다. 2 m L-글루타민, 10 m m D-포도 당, 1mm HEPES (pH 7.4) 최소 DMEM 보충 및 1 mM pyruvate. 따뜻한 물 욕조에 37 ° C에 BSA 없이 셀 미토 스트레스 테스트 매체 고 pH 7.4 (37 ° C에서 pH 측정 수행)를 조정 합니다. 참고: BSA 매체 BSA와 보충 때 셀 FCCP에 더 나은 응답 때문에 셀 미토 스트레스 테스트 중간에 추가 됩니다 (다른 조건 테스트를 했다). BSA 없이 세포 미토 스트레스 테스트 매체 제조자는 매체에서 BSA를 사용 하 여 권장 하지 않습니다 포트 로드 사용 됩니다.</li>
</ol>2. 단 세포 골 수에서 격리
참고: 이상적으로, 기본 백혈병 세포의 대사 상태의 측정은 골 수 수집 및 셀 격리 후 즉시 시작 한다. 그럼에도 불구 하 고, 관련 데이터 셀 분리 후 체코 공화국에 있는 다른 혈액학에서 교통 센터에서 또한 얻을 수 수 있습니다. 메 마른 조직 문화 후드에 모든 하위 단계를 수행 합니다.
<ol><li>PBS와 실내 온도에 밀도 그라데이션 중간에 워밍업.</li>
	<li>1: 1의 비율에 PBS 가진 백혈병 환자의 골 수 샘플을 희석. 샘플 leukemic 돌풍의 80% 이상 포함 되어 있는지 확인 합니다.</li>
	<li>Cytometry 특정 CD 마커를 사용 하 여 셀의 immunophenotype 특성에 의해 폭발의 백분율을 결정 합니다. 밀도 그라데이션 분리 후 전반적인 세포 수를 설치 하기 위하여 핵 산 핵 염료와 긍정적인 이벤트를 감지 합니다.</li>
	<li>그런 다음, 백혈병의 각 유형에 대 한 특정 CD 마커를 사용 하 여 백혈병 세포를 결정: B-모든 (CD19, CD45), T-모든 (CD3, CD4, CD8, CD5, CD7, CD99) 및 AML (CD45, CD33, 그리고 특정 골수성 마커)24. 모든 핵 세포 백혈병 폭발 세포의 백분율을 확인 하 여 특정 CD 표식에 대 한 긍정적인 백혈병 세포의 수를 나눕니다. 참고: 골 수 anticoagulants 튜브에 수집 수 있다.</li>
	<li>신중 하 게 6 mL 희석된 골 수 샘플 15 mL 원뿔 튜브에 밀도 그라데이션 매체의 이상 6 mL의 레이어. 브레이크 없이 진동 물통 회전자에 4 ° C에서 35 분에 대 한 400 x g에서 원심. 참고: 샘플의 더 큰 볼륨은 더 aliquots로 분할 될 수 또는 50 mL 원뿔 튜브 밀도 그라데이션 매체의 더 큰 금액으로 사용 될 수 있습니다.</li>
	<li>5 mL PBS의 새로운 50 mL 원뿔 튜브 interphase 레이어 단 세포 (그림 1)으로 구성 된 전송 신중 하 게 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여. 진동 물통 회전자에 4 ° C에서 10 분 동안 400 × g에서 원심. 참고: 단일 50 mL 원뿔 튜브 PBS의 5 mL에 모든 단 세포 층을 전송.</li>
	<li>상쾌한 발음 하 고 메 마른 PBS의 2 mL에 셀 펠 릿 resuspend. hemocytometer를 사용 하 여 셀을 계산 합니다. 참고: aspirated 골의 1 mL에 백혈병 세포의 수는 환자25마다 크게 다릅니다.</li>
</ol>3. 하룻밤 재배 단 세포의
참고: 모든 하위 단계를 수행 하는 살 균 조직 문화 후드.
<ol><li>RPMI의 20 mL으로 두 T75 플라스 크를 준비 합니다. 각 플라스 크에 고립 된 30 x 106 단 셀을 추가 합니다. 16-24 h 5% CO2 와 37 ° C에 서 플라스 크로 셀을 품 어</li>
</ol>4. 셀 접착제 코팅 접시의 준비
<ol><li>코트 두 8 잘 세포 외 유출 분석기 접시. 참고: 메 마른 조직 문화 후드에 코팅을 수행 합니다.</li>
	<li>2.2 μ의 세포 접착제 추가 (밀도: 2.54 mg/ml)을 0.1 m M NaHCO3, pH 8.1, 고 각 잘으로 피 펫 즉시 12.5 μ의 250 μ. 참고: 셀 접착제 재고 솔루션 그들의 밀도에 차이가, NaHCO3 에 따라 추가 볼륨을 조정할 수 있습니다.</li>
	<li>약 20 분, 후드에 앉아 셀 접착제 발음 그리고 잘 두 번 살 균 물 200 μ를 사용 하 여 각 세척 접시를 보자. 웰 스는 건조 때까지 뚜껑 열기와 후드에 앉아 보자.</li>
	<li>지금 당장 접시를 사용 하 여 또는 응축을 피하기 위해 파라핀 영화에 싸여 테두리와 4 ° C에서 최대 1 주를 저장 합니다. 그 접시는 예 열 (약 20 분) 동안 실내 온도에 후드에 셀을 뿌리기 전에 확인 하십시오.</li>
</ol>5입니다. 수 분이 센서 카트리지
참고: 수화물 2 8 잘 세포 외 유출 분석기 카트리지.
<ol><li>유틸리티 플레이트와 센서 카트리지를 분리 합니다. 거꾸로 실험실 벤치에 센서 카트리지를 놓습니다.</li>
	<li>각 채우기 200 μ calibrant와 유틸리티 플레이트의 잘. Calibrant의 400 μ로 각 굴 우물의 외부 주위를 채우십시오.</li>
	<li>이제는 calibrant를 포함 하는 유틸리티 접시에 센서 카트리지를 반환 합니다.</li>
	<li>습도, 비 CO2, 37 ° C 배양 기 하룻밤 카트리지 어셈블리를 놓습니다.</li>
	<li>세포 외 유출 분석기를 켜고 하자 37 ° C에 따뜻한 하룻밤.</li>
</ol>6. 시드 셀 셀 접착제 코팅 판에
참고: 분해 스트레스 테스트를 사용 하 여 분해 스트레스 테스트 매체. 셀 미토 스트레스 테스트를 위해 BSA와 셀 미토 스트레스 테스트 매체를 사용 합니다.
<ol><li>씨 셀 분해 스트레스 테스트와 별도 접시에 셀 미토 스트레스 테스트에 대 한. 각 테스트에 대 한 숙박 문화 한 플라스 크에서 셀을 사용 합니다.</li>
	<li>실 온에서 5 분 동안 200 x g에서 셀 원심 Resuspend 적절 한 매체의 1 mL에 셀과 그들.</li>
	<li>4 x 106 라이브 셀 400 μ (사용 적절 한 매체)의 최종 볼륨을 추가 합니다.</li>
	<li>B-G. 웰 스에 세포 현 탁 액의 50 μ 접시 500000 셀 한 잘에 시드는 확인 합니다. 참고: 다른 정규화 수행 잘 당 정확 하 게 500, 000 셀을 시드하 결정적 이다. 그런 식으로 다른 환자에서 결과 비교할 수 있습니다. 여기 설명 대로 복제의 최적의 수 6,입니다. 적은 복제를 사용 하 여 이후 1 차 셀 잘못 행동 때로는 수 권장 하지 않습니다.</li>
	<li>웰 스 A와 H (이 웰 스 배경 수정 될 것입니다)에 적절 한 매체의 180 μ를 추가 합니다.</li>
	<li>1로 설정 하는 브레이크와 함께 실 온에서 5 분에 대 한 400 x g에서 격판덮개 원심.</li>
	<li>천천히, 그리고 신중 하 게 두 개의 8-잘 세포 외 유출 분석기 플레이트에 웰 스 B G에 적절 한 매체의 130 μ를 추가 합니다. 시각적으로 확인 하는 세포는 현미경에서 여 우물의 바닥에 안정적으로 준수는.</li>
	<li>30 분 동안 37 ° C 배양 기, 습도, 비 CO2로 접시를 놓습니다.</li>
</ol>7. 로드 센서 카트리지
<ol><li>분해 스트레스 테스트에 대 한 각 포도 당 100 m m, 20 μ M Oligomycin A와 1 M 2-DG, 분해 스트레스 테스트 중간에 모두 250 μ를 준비 합니다.</li>
	<li>셀 미토 스트레스 테스트 준비 250 μ 각각 20 μ M Oligomycin A의 15 μ FCCP, 30 μ FCCP, 10 μ M의 혼합물으로 테 논 및 10 μ g/ml Antimycin A, BSA 없이 셀 미토 스트레스 테스트 중간에 모두. 참고: FCCP 적정에 대 한 충분 한 환자의 자료 없기 때문에 좋습니다 FCCP의 한 분석 결과에 두 개의 농도 주입. 그럼에도 불구 하 고, 농도 연구원에 의해 결정 되어야 합니다.</li>
	<li>화합물의 카트리지 (표 1)을 다음과 같이 적절 한 인젝터 포트 로드:</li>
</ol>8. 프로그램 설정
<ol><li>표 2에 설명 된 대로 해당 분해 스트레스 테스트에 대 한 프로그램을 설정 합니다.</li>
	<li>표 3에 설명 된 대로 셀 미토 스트레스 테스트에 대 한 프로그램을 설정 합니다.</li>
	<li>프로그램을 시작 합니다. 분석 결과 플레이트 (나타나면) calibrant 플레이트를 교체 합니다.</li>
</ol>9. 평가 및 결과의 해석
<ol><li>분해 스트레스 테스트 결과에 다른 모든 ECAR 값에서 2-DG 주입 후 최저 ECAR 값을 뺍니다. 참고:이 값이 낮은 비 glycolytic 산성화를 나타냅니다. 일반적으로, 가장 낮은 값은 4회 측정에서.</li>
	<li>기저 산성화, 분해, 최대한 분해 및 glycolytic 함수 (그림 2A)에서 Glycolytic 예약 매개 변수를 계산 합니다. 첫 번째 3 개의 측정 지점에서 ECAR의 의미로 기저 산성화 ECAR 최소값을 뺀 후 계산 (생략 첫 번째 ECAR 값 크게 다른 2에서와 다른 경우), 3 측정에서 ECAR의 뜻으로 분해를 계산 포도 당 주입 후 포인트와 최대한 분해 ECAR의 3 측정에서 평균 포인트 Oligomycin 후 주사를 계산. 계산 Glycolytic 분해 마이너스 최대한 분해로 예비. 참고: 또는, 최대한 분해 계산에 대 한 3 점 측정에서 가장 높은 ECAR 값을 사용 합니다.</li>
	<li>셀 미토 스트레스 테스트 결과에 다른 모든 OCR 값에서로 테 논/Antimycin A 주입 후 최저 OCR 값을 뺍니다.</li>
	<li>기초 호흡, ATP 생산, 최대한 호흡 및 미토 콘 드리 아 기능 (그림 2B)에서 예비 용량 매개 변수를 계산 합니다. 뺀 후 OCR 최소값, 첫번째 3 개의 측정 지점에서 OCR의 뜻으로 기저 호흡을 계산 합니다. 참고: 최대한 호흡 FCCP 주입 후 가장 높은 OCR 값입니다.</li>
	<li>ATP 생산 계산, 기초 호흡에서 Oligomycin A 주입 후 3 OCR 측정 포인트의 평균을 뺍니다. 기초 호흡 마이너스 최대한 호흡으로 예비 용량을 계산 합니다. 참고: 항상 사용 FCCP 농도 상관 없이 높은 OCR 값에서 최대한 호흡을 계산 합니다.</li>
</ol>

<ol><li>DeBerardinis, R. J., Lum, J. J., Hatzivassiliou, G., Thompson, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Biology+of+Cancer%3A+Metabolic+Reprogramming+Fuels+Cell+Growth+and+Proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">The Biology of Cancer: Metabolic Reprogramming Fuels Cell Growth and Proliferation.</a> Cell Metabolism. 7, 11-20 (2008).</li>
<li>Ward, P. S., Thompson, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+Reprogramming%3A+A+Cancer+Hallmark+Even+Warburg+Did+Not+Anticipate%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Metabolic Reprogramming: A Cancer Hallmark Even Warburg Did Not Anticipate.</a> Cancer Cell. 21, 297-308 (2012).</li>
<li>Pavlova, N. N., Thompson, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Emerging+Hallmarks+of+Cancer+Metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">The Emerging Hallmarks of Cancer Metabolism.</a> Cell Metabolism. 23, 27-47 (2016).</li>
<li>Wise, D. R., Thompson, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamine+addiction%3A+a+new+therapeutic+target+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Glutamine addiction: a new therapeutic target in cancer.</a> Trends in Biochemical Sciences. 35, 427-433 (2010).</li>
<li>Kroemer, G., Pouyssegur, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+Cell+Metabolism%3A+Cancer%27s+Achilles%27+Heel%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Tumor Cell Metabolism: Cancer's Achilles' Heel.</a> Cancer Cell. 13, 472-482 (2008).</li>
<li>Liberti, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Predictive+Model+for+Selective+Targeting+of+the+Warburg+Effect+through+GAPDH+Inhibition+with+a+Natural+Product%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">A Predictive Model for Selective Targeting of the Warburg Effect through GAPDH Inhibition with a Natural Product.</a> Cell Metabolism. 26, 648-659 (2017).</li>
<li>Lundgaard, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+neuronal+glucose+uptake+heralds+activity-dependent+increases+in+cerebral+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Direct neuronal glucose uptake heralds activity-dependent increases in cerebral metabolism.</a> Nature Communications. 6, 6807(2015).</li>
<li>Hermanova, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+inhibition+of+fatty-acid+oxidation+synergistically+enhances+the+effect+of+l-asparaginase+in+childhood+ALL+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Pharmacological inhibition of fatty-acid oxidation synergistically enhances the effect of l-asparaginase in childhood ALL cells.</a> Leukemia. 30, 209-218 (2016).</li>
<li>Malandrino, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+fatty+acid+oxidation+in+adipocytes+and+macrophages+reduces+lipid-induced+triglyceride+accumulation+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Enhanced fatty acid oxidation in adipocytes and macrophages reduces lipid-induced triglyceride accumulation and inflammation.</a> American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 308, E756-E769 (2015).</li>
<li>Patella, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics-based+metabolic+modeling+reveals+that+fatty+acid+oxidation+%28FAO%29+controls+endothelial+cell+%28EC%29+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%3A+MCP%22%5BJournal%5D)">Proteomics-based metabolic modeling reveals that fatty acid oxidation (FAO) controls endothelial cell (EC) permeability.</a> Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 14, 621-634 (2015).</li>
<li>Chowdhury, S. R., Djordjevic, J., Albensi, B. C., Fernyhough, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+evaluation+of+substrate-dependent+oxygen+consumption+rates+and+mitochondrial+membrane+potential+by+TMRM+and+safranin+in+cortical+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Bioscience+Reports%22%5BJournal%5D)">Simultaneous evaluation of substrate-dependent oxygen consumption rates and mitochondrial membrane potential by TMRM and safranin in cortical mitochondria.</a> Bioscience Reports. 36, e00286(2015).</li>
<li>Simonnet, H., Vigneron, A., Pouysségur, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conventional+Techniques+to+Monitor+Mitochondrial+Oxygen+Consumption%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Conventional Techniques to Monitor Mitochondrial Oxygen Consumption.</a> Methods in Enzymology. 542, 151-161 (2014).</li>
<li>Martínez-Reyes, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TCA+Cycle+and+Mitochondrial+Membrane+Potential+Are+Necessary+for+Diverse+Biological+Functions%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">TCA Cycle and Mitochondrial Membrane Potential Are Necessary for Diverse Biological Functions.</a> Molecular Cell. 61, 199-209 (2016).</li>
<li>Sukumar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+Membrane+Potential+Identifies+Cells+with+Enhanced+Stemness+for+Cellular+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial Membrane Potential Identifies Cells with Enhanced Stemness for Cellular Therapy.</a> Cell Metabolism. 23, 63-76 (2016).</li>
<li>Wundenberg, T., Grabinski, N., Lin, H., Mayr, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+InsP6-kinases+as+InsP6-dephosphorylating+enzymes+provides+a+new+mechanism+of+cytosolic+InsP6+degradation+driven+by+the+cellular+ATP%2FADP+ratio%5BTitle%5D)+AND+%22The+Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Discovery of InsP6-kinases as InsP6-dephosphorylating enzymes provides a new mechanism of cytosolic InsP6 degradation driven by the cellular ATP/ADP ratio.</a> The Biochemical Journal. 462, 173-184 (2014).</li>
<li>Morciano, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+luciferase+probes+to+measure+ATP+in+living+cells+and+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Use of luciferase probes to measure ATP in living cells and animals.</a> Nature Protocols. 12, 1542-1562 (2017).</li>
<li>Chau, M. D. L., Gao, J., Yang, Q., Wu, Z., Gromada, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+growth+factor+21+regulates+energy+metabolism+by+activating+the+AMPK-SIRT1-PGC-1alpha+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Fibroblast growth factor 21 regulates energy metabolism by activating the AMPK-SIRT1-PGC-1alpha pathway.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 12553-12558 (2010).</li>
<li>Lee, K. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+energy+metabolic+and+oncogenic+signaling+pathways+in+triple-negative+breast+cancer+by+a+novel+adenosine+monophosphate-activated+protein+kinase+%28AMPK%29+activator%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Targeting energy metabolic and oncogenic signaling pathways in triple-negative breast cancer by a novel adenosine monophosphate-activated protein kinase (AMPK) activator.</a> The Journal of Biological Chemistry. 286, 39247-39258 (2011).</li>
<li>Godlewski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-451+Regulates+LKB1%2FAMPK+Signaling+and+Allows+Adaptation+to+Metabolic+Stress+in+Glioma+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-451 Regulates LKB1/AMPK Signaling and Allows Adaptation to Metabolic Stress in Glioma Cells.</a> Molecular Cell. 37, 620-632 (2010).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+energy+metabolism+in+cultured+cells%2C+including+human+pluripotent+stem+cells+and+differentiated+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Measuring energy metabolism in cultured cells, including human pluripotent stem cells and differentiated cells.</a> Nature Protocols. 7, 1068-1085 (2012).</li>
<li>Kaplon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+key+role+for+mitochondrial+gatekeeper+pyruvate+dehydrogenase+in+oncogene-induced+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A key role for mitochondrial gatekeeper pyruvate dehydrogenase in oncogene-induced senescence.</a> Nature. 498, 109-112 (2013).</li>
<li>Pardee, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+phase+I+study+of+the+first-in-class+antimitochondrial+metabolism+agent%2C+CPI-613%2C+in+patients+with+advanced+hematologic+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%3A+An+Official+Journal+of+the+American+Association+for+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">A phase I study of the first-in-class antimitochondrial metabolism agent, CPI-613, in patients with advanced hematologic malignancies.</a> Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research. 20, 5255-5264 (2014).</li>
<li>Stein, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+defined+metabolic+state+in+pre+B+cells+governs+B-cell+development+and+is+counterbalanced+by+Swiprosin-2%2FEFhd1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">A defined metabolic state in pre B cells governs B-cell development and is counterbalanced by Swiprosin-2/EFhd1.</a> Cell Death and Differentiation. 24, 1239-1252 (2017).</li>
<li>Hrušák, O., Porwit-MacDonald, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+expression+patterns+reflecting+genotype+of+acute+leukemias%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Antigen expression patterns reflecting genotype of acute leukemias.</a> Leukemia. 16, 1233-1258 (2002).</li>
<li>Amin, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Having+a+higher+blast+percentage+in+circulation+than+bone+marrow%3A+clinical+implications+in+myelodysplastic+syndrome+and+acute+lymphoid+and+myeloid+leukemias%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Having a higher blast percentage in circulation than bone marrow: clinical implications in myelodysplastic syndrome and acute lymphoid and myeloid leukemias.</a> Leukemia. 19, 1567-1572 (2005).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

(모두) 급성 림프 구성 백혈병 환자에서 파생 하는 기본 leukemic 돌풍에 OCR 및 ECAR 값으로 평가 하는 신진 대사 활동의 측정에 대 한 상기 설명 된 프로토콜 허용 또는 급성 골수성 백혈병 (AML). 세포 외 유출 분석기를 사용 하 여 측정의 장점은 실시간으로 살아있는 세포에서 대사 프로 파일의 검색 수 있습니다. 기본적으로 제공 된 프로토콜에서 모든 단계 하나 공부 계획 셀 유형에 따라 조정 될 수 있습니다. 여기, 우리는 결과 영향을 미칠 수 있는 최적의 값 보다 적게 제공할 수 있는 가장 중요 한 매개 변수를 설명 합니다.
최적화 향한 첫 번째 단계는 재료를 냉동 신선한 소재 대에서 가져온 데이터의 비교 했다. 액체 질소 은행에 저장 된 환자의 샘플의 회고전 연구에 대 한 냉동된 재료에서 신진 대사 활동을 측정 하는 능력 수 있습니다. 모든 샘플의 경우 AML 셀 드 최적의 결과와 동결 후 또한 측정 하는 반면 신선한 소재로 일관 된 신진 대사 활동을 감지할...

신진 대사 프로필 셀의 주요 특징 중 하나 이며 변경 된 생체는 지금 암1,2,3의 특징 중 하나를 간주 됩니다. 또한, 신진 대사 설치에 변경 신호 변환 통로 또는 암 세포4,,56의 효소 기계 장치를 대상으로 암 치료에 사용 될 수 있습니다. 암 세포의 변화 경향을 알고 따라서 이점을 이며 현재 치료를 향상 시킬 수 있습니다.
문화에 있는 세포의 대사 활동을 평가할 수 있는 이미 설정 된 방법의 많음이 있다. 분해에 대하여 포도 당 통풍 관 측정 될 수 있다 방사성 라벨 2-NBDG를 사용 하 여 (2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)Amino)-2-Deoxyglucose) 또는 extracellular 젖 산 수준 측정 효소7,8. 지방산 산화 속도 isotopically 레이블된 물9,10에 의해 측정 하는 또 다른 대사 매개 변수입니다. 산소 소비 속도 셀11,12, 미토 콘 드리 아 막 잠재적인 평가13,14, ATP/ADP (아데노신 함께 미토 콘 드리 아 활동을 결정 하는 데 널리 사용 되는 방법 5 '-3 인산 염/아데노신 5 '-diphosphate) 비율 측정15 또는 총 세포내 ATP 측정16. 알려진 대사 과정을 조절 하는 통로 신호 단백질 quantifications에 의해 결정 될 수 있었다 고 대사 측정17,,1819의 이해를 향상 시킬 수 있습니다.
그러나, 이러한 모든 방법을 하나만 측정 또는, 최고의 시나리오 하나에 몇 가지 변화 매개 변수는 동시에 샘플. 중요 한 것은, 산소 소비 속도 (OCR) 및 세포 외 산성화 속도 (ECAR)의 동시 측정, 예를 들어 해 마 XFp 분석기에 의해 세포 외 유출 분석에 의해 얻을 수 있습니다. OCR은 미토 콘 드리 아 호흡 ECAR 이며 주로 분해 (우리는 CO2 생산 가능성이 높은 산화 인 산화 활동 ECAR 셀의 높이 무시할 수 없는)의 결과20. 지금까지, 다양 한 세포 유형 사용이 분석기21,,2223공부 되었습니다.
여기 우리는 백혈병 환자에서 주요 폭발 (미 숙 조 혈 단계에서 파생 된 백혈병 세포)의 세포 외 유출 분석에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 우리의 지식 최선을 주 폭발에 대 한 특정 프로토콜 사용할 아직 아니에요.

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640 매체, GlutaMAX 보충제</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific</td><td>61870-010</td><td></td></tr><tr><td>태아 소 혈청</td><td>Biosera</td><td>FB-1001/100</td><td></td></tr><tr><td>항생제-항진균제(100x)</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>중탄산나트륨</td><td>시그마-알드리치</td><td>S5761-500G</td><td></td></tr><tr><td>D-(+) 포도</td>당 <td>시그마-알드리치</td><td>G7021-100G</td><td></td></tr><tr><td>올리고마이신 A</td><td>시그마-알드리치</td><td>75351-5MG</td><td></td></tr><tr><td>2-데옥시-D-글루코스</td><td>시그마-알드리치</td><td>D8375-1G</td><td></td></tr><tr><td>FCCP</td><td>시그마-알드리치</td><td>C2920-10MG</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>시그마-알드리치</td><td>D8418-100ML</td><td></td></tr><tr><td>로테논</td><td>시그마-알드리치</td><td>R8875-1G</td><td></td></tr><tr><td>안티마이신 A 스트렙토마이세스 sp.</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8674-25MG</td><td></td></tr><tr><td>Seahorse XF 기본 매체, 100mL</td><td>Agilent Technologies</td><td>103193-100</td><td></td></tr><tr><td>L-글루타민 용액, 200mM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513-100ML</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 용액, 1M, pH 7.0-7.6</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0887-100ML</td><td></td></tr><tr><td>피루브산 나트륨</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5280-25G</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153-10G</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque Plus</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GE17-1440-02</td><td>밀도 그라디언트 매체</td></tr><tr><td>Seahorse XFp FluxPak</td><td>Agilent Technologies</td><td>103022-100</td><td></td></tr><tr><td>Corning&trade; Cell-Tak 세포 및 조직 접착제</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>CB40240</td><td></td></tr><tr><td>Seahorse 분석기 XFp</td><td>Agilent Technologies</td><td>S7802A</td><td></td></tr><tr><td>Seahorse XFp 세포 배양 미니플레이트</td><td>Agilent Technologies</td><td>103025-100</td><td></td></tr></tbody></table>

기본 백혈병 세포의 신진 대사 프로필의 평가

Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells

암 세포의 대사 요구 부정적인 생존 및 치료 효능에 영향을 미칠 수 있습니다. 요즘, 변화 통로의 제약을 대상으로 다양 한 종양에서에서 테스트 됩니다. 따라서, 암 세포 대사 설치의 대상 환자의 전반적인 결과 개선 하기 위해 올바른 경로 위해 불가피 하다. 불행 하 게도, 암의 대다수에서 악성 세포가 더 높은 숫자를 매우 어려운 및 조직 생 검 필요 합니다. 백혈병은 예외, 어디 leukemic 세포의 충분 한 수 골에서 격리 될 수 있습니다. 여기, 우리는 leukemic 세포 백혈병 환자 골 수에서 분리 및 세포 외 유출 분석기를 사용 하 여 그들의 대사 상태의 이후 분석에 대 한 상세한 프로토콜을 제공 합니다. Leukemic 세포는 그들의 생존에는 영향을 미치지 않습니다 밀도 그라데이션에 의해 격리 됩니다. 다음 재배 단계 재생성 하 그들을 도와, 따라서 대사 상태 측정은 최적의 조건에서 셀의 상태. 이 프로토콜은 개인된 치료에 사용 될 수 있는 일관 된, 잘 표준화 된 결과 달성 수 있습니다.

그림 3 BCP-모든 (B 세포 선구자 급성 림프 구성 백혈병)과 급성 골수성 백혈병 (급성 골수성 백혈병) 환자에서 분해 스트레스 테스트 및 leukemic 돌풍의 셀 미토 스트레스 테스트 측정 후 곡선을 보여준다. 이 측정에서 대사 매개 변수 계산도 표시 됩니다. 잘 당 500000 셀 시드 했다 그리고 모든 측정 hexaplicates에서 수행 했다.
분해 스트레스 테스트 셀 양분의 박탈 하는 유일한 기저 매체 사용 됩니다. 얻은 첫 번째 매개 변수는 셀에 저장 된 포도 당의 양을 반영 한다 기저 산성화. 첫 번째 주사 후 ECAR 이후 세포 포도 당을 활용 하 고 젖이 나올 그것을 발효 수 있습니다 증가 합니다. 두 번째 주입에서 Oligomycin A ATP synthase를 억제 하 고 따라서 주로 ...

여기 선물이 leukemic 세포 백혈병 환자 골 수에서 격리 및 그들의 대사 상태 분석을 위한 프로토콜. 기본 백혈병 세포의 신진 대사 프로필의 평가 1 차 셀의 수요 특성을 더 나은 하는 데 도움이 수 그리고 더 맞춤된 의학까지 이어질 수 있습니다.

The metabolic requirement of cancer cells can negatively influence survival and treatment efficacy. Nowadays, pharmaceutical targeting of metabolic ...

이 방법은 백혈병 세포에 있는 신진 대사 통로 설치에 관하여 중요한 질문에 대답하는 것을 도울 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 살아있는 세포에서 실시간으로 1 차 백혈병 세포의 물질 대사를 측정할 수 있다는 것입니다. PBS에 있는 백혈병 환자에게서 얻은 골수 견본을 1 대 1 비율로 희석하는 것으로 시작합니다.신중하게, 15 밀리리터 원추형 튜브에서 갓 준비된 밀도 그라데이션 배지의 6밀리리터 위에 희석된 골수 샘플의 6밀리리터를 층으로 적층하고 밀도 그라데이션 원심분리에 의해 세포를 분리한다. 파스퇴르 파이펫을 사용하여 단일 핵 세포의 인터페이스 층을 원심 분리 세척을 위해 PBS 5 밀리리터를 포함하는 새로운 50 밀리리터 원전 튜브로 조심스럽게 전송합니다. 이어서, 단일핵 세포 펠릿을 계산용 멸균 PBS의 2밀리리터로 재중단한다.밀리리터 농도당 7개의 세포에 세포를 3배 10으로 희석시. 그리고 37섭씨 37도및 5%CO2에서 16~24시간 배양에 대해 RPMI 배지 20밀리리터를 함유한 2개의 T75 플라스크 각각에 1밀리리터의 세포를 추가합니다. 한편 세포 외 플럭스 분석을 위해 플레이트를 준비하기 위해 세포 접착제 용액 12.5 마이크로리터를 각각 2개, 8개의 잘 세포외 플럭스 분석기 플레이트에 추가합니다.20 분 후, 세포 접착제를 흡착하고 세척 당 멸균 물 200 마이크로 리터로 각각 두 번 잘 씻습니다. 두 번째 세척 후, 우물이 건조 할 때까지 후드에 접시를 둡니다. 그리고 센서 카트리지를 실험실 벤치에 거꾸로 놓습니다.플럭스 분석기의 유틸리티 플레이트와 센서 카트리지를 분리합니다. 그리고 200 마이크로리터의 교정제와 각 해자 400 마이크로리터의 교정판으로 유틸리티 플레이트의 각 우물을 채웁니다. 센서 카트리지를 교정판이 들어 있는 유틸리티 플레이트로 되돌리고 밤새 CO2 없이 가습된 섭씨 37도 인큐베이터에 카트리지 어셈블리를 배치합니다.그런 다음 세포 외 플럭스 분석기를 켜고 밤새 섭씨 37도까지 따뜻하게 하십시오. 다음 날 아침, 원심 분리를 위해 플라스크에서 50 밀리리터 원추형 튜브로 세포를 옮긴다. 그리고 계산에 적합한 실험 매체의 1 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단한다.실험적인 중간 농도의 400 마이크로리터에서 6개의 세포에 4회 10에서 세포를 재중단합니다. 그리고 플럭스 분석기 플레이트의 G를 통해 50 마이크로리터의 셀 B에 첨가한다. 그리고 180 마이크로리터의

assessment-of-the-metabolic-profile-of-primary-leukemia-cells

Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

이 프로토콜은 세포외 플럭스 분석을 통해 1차 백혈병 세포의 세포외 산성화율(ECAR) 및 산소 소비율(OCR)을 측정하기 위한 생화학적 접근 방식을 제공합니다. 이러한 세포의 대사 프로파일에 대한 평가는 세포의 요구를 특성화하는 데 도움이 되어 맞춤형 치료로 이어집니다.

Extracellular Flux Assay: 세포의 대사 프로파일을 측정하는 방법

수용체 티로신 키나아제는 ectopically 많은 암에서 발현되는 급성 백혈병의 치료 표적으로 확인되었습니다. 이 원고는 급성 백혈병의 치료를위한 티로신 키나제 억제제의 전 임상 평가를위한 효율적인 전략을 설명한다.

급성 백혈병의 치료에 대한 티로신 키나제 억제제의 전임상 평가

현재 보고서는 가장 화학저항성이 높은 하위 모집단의 농축에 중점을 두고 백혈병 세포에 대한 골수 미세환경 틈새의 영향을 모델링하는 데 사용할 수 있는 프로토콜을 요약합니다.

모델링 화학 요법 내성 백혈병<em&gt; 체외</em

호중구는 백혈구 중 가장 풍부한 유형입니다. 밀도 구배 분리 방법에 의한 인간 혈액에서 호중구의 분리 및 과립구 경로를 따른 인간 전골수구(HL60) 세포의 분화가 여기에 설명되어 있습니다. 항림프종제에 대한 림프종 세포의 민감도에 대한 역할을 테스트합니다.

호중구의 분리 및 분석 치료제에 림프종 세포 감도에서 자신의 역할을 확인하는 방법

여기에 설명된 프로토콜은 다양한 조건에서 배양된 만성 림프구성 백혈병(CLL) 세포의 퓨린 대사를 측정하기 위해 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC)를 사용하는 쉽고 재현 가능한 방법을 나타냅니다.

HPLC 기반 분석은 인간의 만성 림프 구성 백혈병 세포에 세포 외 뉴클레오티드 / 뉴 클레오 시드 신진 대사를 모니터링하기

또는 측정 최소 잔여 질병 (MRD)의 위험 평가 정제 하 고 급성 골수성 백혈병 (AML)에서 재발 예측에 대 한 중요 한 예 후 바이오 마커 이다. 이러한 포괄적인 지침과 일관 되 고 정확한 식별 및 MRD의 검출을 위한 모범 사례 권장 사항을 효과적인 AML 치료 결정에 도움이 수 있습니다.

샘플을 측정 하는 측정 가능한 잔여 질환과 급성 골수성 백혈병에 Leukemic 줄기 세포에 대 한 프로세스 골 포괄적인 프로토콜

우리는 cytometry에 의해 동시 표현의 기본 급성 골수성 백혈병 세포에 백혈병 줄기 세포 마커를 감지 하는 프로토콜 개요. 우리 3 조상 인구와 성숙의 정도 증가 함께 상 상속 LSC 인구를 측정 하는 방법을 보여 줍니다. 우리는 이러한 인구에 해당 환자-파생-xenografts의 존재를 확인 했다.

Flow Cytometry 최대 백혈병 줄기 세포 주 급성 골수성 백혈병 및 환자-파생-xenografts, 진단에 따라 추정 하

우리는 급성 골수성 백혈병 (AML)의 마우스 모델에서 뮤린 건강한 조혈 줄기 및 전구 세포 (HSPC) 및 백혈병 세포에서 미토콘드리아 반응성 산소 종 (ROS)을 검출하기 위해 다매개 변수 흐름 세포측정법을 사용하는 방법을 설명합니다. MLL-AF9.

뮤린 조혈 줄기 및 선조 세포 및 MLL-AF9 구동 백혈병에서 미토콘드리아 반응성 산소 종의 유동 세포 분석

여기에서는 골수이형성 증후군 및 급성 골수성 백혈병의 쥐 모델에서 골수 미세환경 집단을 분리하고 특성화하기 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다. 이 기술은 질병 진행에 따라 내피 및 중간엽 기질 세포를 포함한 비조혈 골수 틈새의 변화를 식별합니다.

골수이형성 증후군 및 급성 골수성 백혈병의 골수 미세환경 집단 식별

이 프로토콜은 환자의 골수 및 말초혈 단핵세포에서 유래한 인간 조혈 줄기세포 및 전구세포의 분화를 유도하는 절차를 설명합니다. 이 검사법은 적혈구 및 골수계통 확립을 지원하는 반고체 배양지를 사용하며, 전임상 약물 특성화를 위한 재현 가능한 집락 분류를 위한 표준화된 지표를 통합합니다.

환자 유래 골수 및 말초혈 단핵세포에 적용된 군집형성 단위 분석법

학습하세요 백혈병 환자 골수에서 백혈병 세포를 분리하고 실시간으로 신진대사를 분석하는 방법을. 밀도 구배 원심분리를 통해 단핵 세포를 분리하고 세포 외 유량 분석기로 대사 상태를 측정합니다. 이 프로토콜은 맞춤형 의학을 위한 백혈병 세포 대사 연구에 활용됩니다.

기본 백혈병 세포의 신진 대사 프로필의 평가

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