Análisis del microambiente hepático durante la progresión temprana del carcinoma hepatocelular asociado a la enfermedad del hígado graso no alcohólico en pez cebra

Nuestros modelos y protocolos de cáncer de hígado de pez cebra brindan una oportunidad única para visualizar in vivo, de forma no invasiva, el microambiente hepático y el paisaje inmunológico utilizando microscopía intravital. La transparencia de las larvas de pez cebra es sin duda la principal ventaja de este sistema, que nos permite realizar microscopía intravital no invasiva y obtener información sobre el microambiente y la infiltración de células inmunes de un tejido y órgano profundo, como el hígado. Nuestro modelo nefrótico inducido por la dieta y las técnicas de imagen descritas en este protocolo se pueden aplicar fácilmente a las interacciones célula-célula enrevesadas en otras enfermedades hepáticas o campos de investigación, incluido el síndrome metabólico y las enfermedades cardiovasculares.

Demostrando el procedimiento estarán Cassia Michael, nuestra técnica de laboratorio, y el Dr. Francisco Juan Martínez-Navarro, becario postdoctoral en mi laboratorio. Para comenzar, pese cuatro gramos de dieta comercial de alimentos secos para larvas de pez cebra en dos vasos de vidrio de 25 mililitros, uno para la dieta normal y el otro para la dieta alta en colesterol al 10%, o HCD. Pese 0,4 gramos de colesterol en un vaso de precipitados de vidrio de 10 mililitros y cubra el vaso de precipitados con papel de aluminio.

En una campana extractora, mida cinco mililitros de éter dietílico con una jeringa de 10 mililitros con una aguja de calibre 20. Luego, agregue el éter dietílico al vaso de precipitados de dieta normal e inmediatamente mézclelo con el alimento seco con una espátula. Mida otros cinco mililitros de éter dietílico con la misma jeringa y aguja y agréguelo al vaso de precipitados que contiene HCD.

Mezclar inmediatamente aspirando hacia arriba y hacia abajo con la jeringa. Agregue rápidamente la solución de colesterol al vaso de precipitados HCD e inmediatamente mézclela con una espátula hasta que la solución esté uniforme. Deje los vasos de precipitados en la capucha durante un máximo de 24 horas para evaporar completamente el éter dietílico.

Al día siguiente, muele las dietas en partículas finas usando un mortero. Transfiera cada dieta a una pequeña bolsa de plástico etiquetada o a un tubo de centrífuga de 50 mililitros y guárdelos a menos 20 grados centígrados. Establezca líneas de peces transgénicos en el día menos uno.

En el día cero, recoja los huevos en un colador de malla después de que los peces hayan desovado. Usando una botella de lavado con E3, enjuague bien los huevos y transfiéralos cuidadosamente a placas de Petri de 10 centímetros con medio E3. Limpie las placas de todos los desechos que puedan haberse acumulado en las cajas de reproducción, incluidos los huevos muertos o no fertilizados para evitar el crecimiento incontrolado de microorganismos y los consiguientes defectos en el desarrollo de las larvas.

Luego divida los huevos a una densidad de 70 u 80 huevos por plato que contenga 25 mililitros de E3. El primer día, revise y limpie los embriones muertos o embriones con defectos de desarrollo bajo un alcance de disección equipado con una base de transiluminación. En el quinto día, combine las larvas de todos los platos en una placa de Petri de 15 centímetros y agregue E3 sin azul de metileno. Divida las larvas en las cajas de alimentación y aliméntelas como se describe en el texto manuscrito.

Mantenga las larvas en la sala de peces cebra o en una incubadora a 28 grados centígrados en un ciclo de luz oscura y aliméntelas dos veces al día desde el día 5 hasta el día 12. Elimine los restos de alimentos diariamente, así como del 90 al 95% del medio utilizando un sistema de vacío conectado a una punta de pipeta de un mililitro. Luego, vierta cuidadosamente el nuevo E3 sin azul de metileno en una esquina de la caja de alimentación para evitar dañar las larvas.

Alternativamente, las larvas se pueden dividir en tanques de tres litros con agua del sistema y colocarse como una unidad de sistema independiente con un bajo flujo de agua. Esta alternativa ahorra el tiempo requerido para el proceso de limpieza diario, y el sistema de filtración ayuda a mantener las larvas sanas hasta el punto final. El día 13, prepare los platos de recolección de acuerdo con la cantidad de condiciones experimentales que se establecieron.

Vierta suficiente E3 sin azul de metileno para cubrir el fondo de cada plato. Luego, con cuidado, usando el sistema de vacío, aspire el agua de las cajas de alimentación. Cuando el nivel del agua comience a bajar, levante lentamente la caja de alimentación para hacer que las larvas naden hacia una de las esquinas, luego aspire en la dirección opuesta.

Una vez que solo quedan unos 20 a 30 mililitros del líquido, decanta cuidadosamente las larvas en la placa de Petri de colección preparada y coloca la cinta etiquetada de la caja de alimentación en la tapa del plato. En un microscopio estereoscópico de fluorescencia, examine las larvas anestesiadas en busca de marcadores fluorescentes deseados. Luego agregue tricaine E3 en las cámaras del dispositivo de herida y atrapamiento.

Retire las burbujas de aire de las cámaras y del canal de sujeción con una micropipeta P-200. Retire todo el exceso de tricaína E3, dejando solo el volumen suficiente para llenar las cámaras. A continuación, transfiera una larva anestesiada a la cámara de carga del dispositivo de herida y atrapamiento y colóquela para obtener imágenes del lóbulo izquierdo con una herramienta de pestañas.

Imagen de la morfología de todas las células requeridas en el hígado bajo un microscopio confocal como se describe en el texto manuscrito. Abra el software Fiji. Luego abra el archivo de imagen y marque la opción Dividir canales en la pestaña Opciones de importación de bioformato.

Después de crear proyecciones de intensidad máxima para cada canal, cree un ROI que rodee el hígado larvario y mida el área del hígado. Luego, agregue una barra de escala como referencia y cree un segundo ROI que incluya el área del hígado y 75 micrómetros del área circundante. En el menú Plugins, seleccione la opción Analizar seguida de Cell Counter y cuente las células inmunes dentro del área de reclutamiento.

Registre el número de células inmunitarias reclutadas en una hoja de cálculo. Calcule las densidades de neutrófilos, macrófagos y células T normalizando el número de células inmunitarias por área hepática. Las larvas de pez cebra HCC alimentadas con una dieta normal no muestran esteatosis hepática, medida por tinción Oil Red O.

Sin embargo, las larvas de HCC alimentadas con HCD muestran un aumento significativo en la esteatosis hepática. Después de ocho días de exposición a un excedente de colesterol, se observó agrandamiento del hígado en larvas de HCC. Para evaluar la hepatomegalia, se evaluaron el área hepática, el área de superficie hepática y el volumen hepático.

En el CHC asociado a esteatohepatitis no alcohólica, el área de hepatocitos, junto con el área nuclear, y la relación nuclear-citoplasmática aumentaron. También se observó una disminución significativa en la circularidad nuclear en el grupo de HCC alimentado con dieta alta en grasas. Utilizando el marcador H2B-mCherry, se detectó una mayor incidencia de micronúcleos en las larvas de HCC alimentadas con HCD.

La evaluación de la vasculatura hepática mostró un aumento significativo en la densidad de vasos en larvas de HCC alimentadas con HCD. La infiltración de macrófagos y neutrófilos ocurrió tanto en HCC como en HCC alimentados con larvas de HCD. La cuantificación de neutrófilos en macrófagos en el hígado y sus proximidades mostró un aumento significativo en el número y la densidad de las células en larvas de HCC alimentadas con HCD.

En contraste, se observó una disminución significativa en la densidad de células T en el número total en larvas de HCC alimentadas con HCD. La limpieza de los tanques y la alimentación son los pasos más importantes para asegurar la viabilidad de las larvas y evitar el desarrollo de esteatosis o inflamación crónica hepática y sistémica en los controles debido a la mala calidad del agua o la alimentación inadecuada. Se pueden realizar otros métodos como la microscopía de lapso de tiempo y el análisis de la interacción entre las diferentes células que pueblan el hígado.

Además, se puede realizar una búsqueda de ARN unicelular de hígados disecados en diferentes etapas del cáncer de hígado para comprender en su totalidad cómo evoluciona el panorama inmune del hígado con la progresión de la enfermedad.