Name: Análisis del microambiente hepático durante la progresión temprana del carcinoma hepatocelular asociado a la enfermedad del hígado graso no alcohólico en pez cebra (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 27 s
Description: Explore el análisis del microambiente hepático en larvas de pez cebra con carcinoma hepatocelular asociado a NASH mediante microscopía confocal no invasiva. Este protocolo permite caracterizar la infiltración inmune y los cambios morfológicos tempranos en el hígado.

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El autor desea agradecer a los técnicos de la Instalación Central de Pez Cebra de la Facultad de Medicina Albert Einstein, Clinton DePaolo, y al Spartak Kalinin por la asistencia y el mantenimiento de nuestras líneas de pez cebra. FJMN cuenta con el apoyo del Instituto de Investigación del Cáncer y la Fundación del Cáncer Fibrolamelar.

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<li>Evason, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+chemical+inhibitors+of+beta-catenin-driven+liver+tumorigenesis+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Identification of chemical inhibitors of beta-catenin-driven liver tumorigenesis in zebrafish.</a> PLoS Genetics. 11 (7), 1005305(2015).</li>
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<li>Park, K. H., Ye, Z. W., Zhang, J., Kim, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palmitic+acid-enriched+diet+induces+hepatic+steatosis+and+injury+in+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Palmitic acid-enriched diet induces hepatic steatosis and injury in adult zebrafish.</a> Zebrafish. 16 (6), 497-504 (2019).</li>
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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Con una mayor incidencia de CHC, específicamente CHC inducido por NASH, es de gran importancia tener modelos más eficientes para estudiar los mecanismos celulares y moleculares involucrados en el HCC asociado a NASH. La deconvolución de las interacciones célula-célula en el hígado es crucial para comprender mejor la progresión de la enfermedad hepática y la hepatocarcinogénesis. El enfoque descrito en este protocolo ofrece una forma única de analizar la progresión de la enfermedad hepática in vivo y de forma no invasiva.
La preparación de la dieta es fundamental para el éxito de establecer un modelo de HCC asociado a NASH. Es importante dejar que el éter dietílico se evapore completamente dentro de la campana extractora para evitar efectos nocivos, mientras se preparan dietas para el pez cebra. Para usar estas dietas con larvas (5-12 días después de la fertilización), es extremadamente importante moler las dietas en partículas finas para asegurar la ingesta de alimentos por parte de las larvas. El uso de análogos de ácidos grasos marcados con fluorescencia se puede utilizar para evaluar la ingesta de alimentos en larvas.
Antes de colocar las larvas en las cajas de reproducción y comenzar el procedimiento de alimentación, es crucial asegurarse de que el muestreo experimental esté uniformizado mezclando larvas de diferentes placas. Este paso es importante ya que diferentes microambientes, a partir del día 0, se promueven en cada una de las placas y pueden afectar la respuesta inflamatoria.
Otro paso importante es contar las larvas, para saber cuánta comida se necesita para cada caja de alimentación. Si la cantidad de alimento no es adecuada para el número de larvas presentes en cada caja, ocurrirá uno de los dos escenarios: 1) las larvas estarán subalimentadas; 2) Las larvas serán sobrealimentadas. La alimentación inadecuada conducirá a condiciones poco saludables asociadas con la desnutrición o la sobrenutrición, como la inflamación, que afectará drásticamente el microambiente del hígado. Si se produce una alimentación inexacta, las larvas mostrarán problemas de movimiento. En esta etapa de desarrollo, las larvas deben nadar intensamente, por lo tanto, si se notan problemas de movimiento, las larvas se criaron en condiciones insalubres (desnutrición o exposición a dosis tóxicas de colesterol debido a la sobrealimentación). Por esta razón, los procedimientos de alimentación deben controlarse estrictamente para ambas dietas, normal y enriquecida con colesterol. Se pueden realizar algunos ensayos para abordar rápidamente la precisión de la alimentación y la salud de las larvas, incluida la presencia de hepatomegalia (tamaño del hígado) y la inflamación de tejidos y órganos, particularmente hígado e intestino (aumento visible de la infiltración de neutrófilos y macrófagos).
La limpieza diaria y el reemplazo del 95% de E3 es fundamental para reducir el crecimiento de microorganismos en las cajas de alimentación y mejorar la salud y la supervivencia de las larvas. Alternativamente, las larvas se pueden colocar en un sistema de rack independiente. Para obtener los mejores resultados, coloque 60-80 larvas en un tanque de 3 litros. Mantenga el flujo de agua en el nivel mínimo ajustando el flujo a un modo de goteo rápido y alimentando a las larvas 3-4 mg dos veces al día (AM y PM). El flujo de agua debe revisarse regularmente para asegurar el flujo correcto en cada tanque. En nuestro laboratorio, este método nos da una supervivencia del 95-100% con una alimentación a corto plazo de 10% de HCD. Además, este método redujo en gran medida la carga de trabajo inherente a la limpieza diaria y el intercambio de agua necesarios en el protocolo de alimentación estática descrito.
Si bien utilizamos una dieta enriquecida con colesterol al 10% para inducir NASH en una exposición a corto plazo (5 días son suficientes para inducir esteatohepatitis), las alteraciones de la dieta se pueden realizar y ampliar para usar fructosa 18, ácidos grasos (como el ácido palmítico)19 o protocolos de alimentación que pueden extenderse usando una dieta enriquecida con colesterol al 4%20. Actualmente, hay pocos objetivos terapéuticos exitosos para el CHC y ninguno para la EHNA. El uso de modelos de pez cebra ofrece una oportunidad única para ampliar nuestro conocimiento sobre la hepatocarcinogénesis, pero también un sistema de vertebrados sin paralelo para realizar exámenes de detección de drogas de gran rendimiento. Las técnicas descritas en este protocolo facilitarán futuros hallazgos y dianas terapéuticas para la enfermedad hepática y la hepatocarcinogénesis.

El carcinoma hepatocelular (CHC) es un cáncer agresivo con opciones terapéuticas limitadas. Se ha encontrado que más del 30% de todos los pacientes con CHC son obesos y tienen NASH, una forma agresiva de NAFLD 1,2,3,4. El consumo de dietas ricas en calorías aumenta drásticamente la disponibilidad de ácidos grasos que causan cambios metabólicos locales y sistémicos y desencadenan esteatosis, lesión de hepatocitos, inflamación y fibrosis, todas características clave de NASH. La progresión de NASH a HCC implica la acumulación de lípidos en el hígado, lo que desencadena inflamación y alteración de la composición de las células inmunes 5,6,7. Es de particular interés e importancia comprender cómo el microambiente hepático y el paisaje de células inmunes se alteran durante la progresión de la enfermedad hepática, y cómo cambia debido a ciertos factores etiológicos. Para identificar mejor el impacto que el excedente de colesterol tiene en el microambiente hepático y el paisaje de las células inmunes, hemos desarrollado un modelo único de pez cebra de HCC asociado a NASH. El uso de este modelo nos ha dado una mejor comprensión del impacto de la dieta y la sobrenutrición en el microambiente hepático y la progresión de la enfermedad hepática.
Los modelos de mamíferos, como ratones y muestras de tejido humano, han sido esenciales para comprender la patogénesis de la esteatohepatitis y la esteatosis8. Los ratones son el modelo preferido para la enfermedad hepática y el cáncer, pero carecen de claridad óptica a nivel celular, mientras que las muestras de tejido humano a menudo carecen del entorno 3D que los modelos animales pueden imitar. Estos obstáculos han hecho del pez cebra un modelo poderoso en la comunidad de investigación. El pez cebra tiene similitudes notables con los humanos, con al menos un 70% de conservación de genes. Mantienen el microambiente hepático, la composición celular hepática, la función, la señalización y la respuesta a las lesiones 9,10. Usando una dieta alta en colesterol (HCD) en combinación con un modelo establecido de HCC de pez cebra transgénico, hemos desarrollado un modelo de pez cebra de HCC asociado a NASH.
Aquí presentamos un protocolo que explica cómo generar un modelo de pez cebra HCC asociado a NASH y cómo estudiar el microambiente hepático y abordar las características de malignidad temprana in vivo. Utilizando microscopía confocal no invasiva en combinación con líneas transgénicas de pez cebra con membrana y núcleo de hepatocitos marcados con fluorescencia, podemos abordar las características de malignidad temprana mediante el análisis de la morfología hepática (área, volumen y área de superficie), morfología celular y nuclear (área de hepatocitos, área nuclear, relación N: C, circularidad nuclear, puntuación de micronúcleos / hernia nuclear) y angiogénesis (densidad de vasos). El microambiente de las células inmunes también es una característica importante de la hepatocarcinogénesis11,12,13,14, por lo tanto, también mostramos cómo analizar la composición de las células inmunes hepáticas en larvas de HCC asociadas a NASH, utilizando líneas transgénicas de pez cebra con células inmunes marcadas (neutrófilos, macrófagos y células T). Las técnicas descritas son exclusivas del modelo y extremadamente útiles para evaluar el microambiente hepático y la composición de las células inmunes en la progresión de la enfermedad hepática.

<table><tbody><tr><td>Colesterol</td><td>Sigma</td><td>C8667-25G</td><td>Se degrada fácilmente. Tienda -20&deg;C.</td></tr><tr><td>Kit de soporte Corning Netwells 15 mm</td><td>Fisher</td><td>07-200-223</td><td></td></tr><tr><td>Insertos Corning Netwells</td><td>Fisher</td><td>07-200-212</td><td></td></tr><tr><td>Éter dietílico</td><td>Fisher</td><td>60-046-380</td><td>Altamente volátil.</td></tr><tr><td>Pinzas Dumont #55 dumostar</td><td>Fisher NC9504088</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Pasteur Pipets 5.75in</td><td>Fisher</td><td>22-183624</td><td></td></tr><tr><td>4% paraformaldehído (PFA)</td><td>Microscopía electrónica Science</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Golden Pearl Diet 5&ndash; 50 nm Active Spheres</td><td>Salamarón en salmuera directo</td><td>:</td> <td>se puede utilizar cualquier alimento comercial en polvo seco para larvas.</td></tr><tr><td>Pipetas de transferencia graduadas</td><td>Fisher</td><td>22-170-404</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher</td><td>BP26181</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH7.4, 10X, 10 Pack</td><td>Crystalgen</td><td>221-1422-10</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri 100X20MM</td><td>Fisher</td><td>08-747D</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine</td><td>Sigma</td><td>A-5040</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>Aceite Red O solución 0.5% isopropanol</td><td></td><td>Sigma O1391-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine</td><td>Sigma</td><td>A-5040</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>Vactrap</td><td>VWR</td><td>76207-630</td><td>Sistema de vacío para recolección</td></tr> <tr><td>de larvas<microscopios fuertes> < / fuertes></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>fluorescentes</td><td>Microscopio</td> confocal de disco giratorio grande de organismo modelo Leica <td>M205 FCA THUNDER</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico</td><td>Nikon</td><td>Nikon CSU-W1</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Leica</td><td>S9i con base</td><td></td> transiluminada</tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fiji</td><td>Programa de procesamiento de imágenes Java de código abierto.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaris 9.6</td><td>Bitplane; Instrumentos Oxford.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

análisis del microambiente hepático durante la progresión temprana del carcinoma hepatocelular asociado a la enfermedad del hígado graso no alcohólico en pez cebra

Analysis of Liver Microenvironment During Early Progression of Non-Alcoholic Fatty Liver Disease-Associated Hepatocellular Carcinoma in Zebrafish

El cáncer de hígado es actualmente la tercera causa principal de muerte relacionada con el cáncer en todo el mundo, y el carcinoma hepatocelular (CHC) representa el 75-90% de todos los casos de cáncer de hígado. Con la introducción de tratamientos efectivos para prevenir y tratar la hepatitis B / C, la enfermedad del hígado graso no alcohólico (NAFLD) y la forma más agresiva conocida como esteatohepatitis no alcohólica (NASH), se están convirtiendo rápidamente en los factores de riesgo número uno para desarrollar CHC en las sociedades modernas. Para comprender mejor el papel que tiene NASH en el desarrollo de HCC, diseñamos un pez cebra HCC asociado a NASH. La claridad óptica y la trazabilidad genética de las larvas de pez cebra las convierten en un modelo atractivo y poderoso para estudiar el microambiente hepático y la composición de las células inmunes utilizando imágenes fluorescentes no invasivas en vivo. Este protocolo describe cómo utilizar un modelo de pez cebra HCC asociado a NASH para investigar el efecto del excedente de colesterol en el microambiente hepático y su impacto en la composición de las células inmunes en las primeras etapas de la enfermedad. Primero, alimentamos larvas de HCC (s704Tg), que expresan beta-catenina activada específica para hepatocitos, con una dieta alta en colesterol al 10% durante 8 días para desarrollar un modelo de HCC asociado a NASH. Aquí describimos cómo hacer uso de diferentes líneas transgénicas para evaluar varias características de malignidad temprana en el hígado mediante microscopía confocal no invasiva, como el área hepática, la célula y la morfología nuclear (área de hepatocitos, área nuclear, relación nuclear: citoplasma (relación N: C), circularidad nuclear, puntuación de micronúcleos / hernia nuclear) y angiogénesis. Luego, utilizando líneas transgénicas con células inmunes marcadas (neutrófilos, macrófagos y células T) mostramos cómo analizar la composición de las células inmunes hepáticas en larvas de HCC asociadas a NASH. Las técnicas descritas son útiles para evaluar el microambiente hepático y la composición de las células inmunes en etapas tempranas de hepatocarcinogénesis, pero también pueden modificarse para estudiar tales características en otros modelos de enfermedad hepática.

Al introducir una dieta alta en colesterol a corto plazo en un modelo de pez cebra de carcinoma hepatocelular (HCC), que sobreexpresa una forma constitutivamente activa específica de hepatocitos de beta-catenina (s704Tg; Tg(fabp10a:pt-B-cat, cryaa:Venus)17, somos capaces de crear un modelo de vertebrados no mamíferos de HCC asociado a NASH. La progresión de la enfermedad hepática se puede controlar temprano midiendo la esteatosis hepática, el tamaño del hígado, el hepatocitos, la morfología nuclear, la angiogénesis y la infiltración de células inmunitarias (Figura 1).
Las larvas de HCC alimentadas con una dieta normal no muestran ninguna esteatosis hepática leve, medida por tinción de O rojo aceite. Sin embargo, las larvas de HCC alimentadas con una dieta alta en colesterol muestran un aumento significativo en la esteatosis hepática (Figura 2).
Un marcador bien conocido de enfermedad hepática es la hepatomegalia17. Para evaluar el tamaño del hígado, las larvas de HCC pueden cruzarse con una línea transgénica que expresa específicamente un marcador fluorescente en los hepatocitos, como el Tg(fabp10a: H2BmCherry). Para evaluar la hepatomegalia, se realiza una evaluación del área hepática (2D), el área de superficie hepática y el volumen hepático (3D). Después de 8 días de exposición a un excedente de colesterol, se observó agrandamiento del hígado en larvas de CHC (Figura 3).
Utilizando imágenes vivas no invasivas, las líneas de peces transgénicos que expresan proteínas fluorescentes en las membranas de los hepatocitos (como Tg(fabp10a:Life-actin-EGFPP) y en núcleos de hepatocitos (como Tg(Fabp10a:H2B-mCherry) se pueden utilizar para evaluar las alteraciones de la morfología celular y nuclear asociadas con la malignidad en los hepatocitos. El área de hepatocitos aumentó en el HCC asociado a NASH (Figura 4A, B, D), así como en el área nuclear (Figura 4C, E) y la relación nuclear: citoplasma (Figura 4F). También se observó una disminución significativa de la circularidad nuclear en el grupo HCD+HCC (Figura 4G). La lipotoxicidad desencadena daños en el ADN, una característica de la carcinogénesis en presencia de micronúcleos. Utilizando el marcador H2B-mCherry observamos una mayor incidencia de micronúcleos en las larvas de HCC alimentadas con una dieta alta en colesterol (Figura 4H).
La vasculatura hepática se puede evaluar fácilmente en modelos de pez cebra utilizando una línea marcada transgénica, como Tg (kdrl: mCherry o Tg (fli: EGFP), que etiquetan la vasculatura. Se observó un aumento significativo de la densidad de vasos en larvas de HCC+HCD (Figura 5).
Para observar la respuesta inflamatoria desencadenada temprano en el CHC asociado a NASH, una línea de peces transgénicos que expresa proteínas fluorescentes en macrófagos y neutrófilos, como Tg(mfap4: tdTomato-CAAX; lyz: BFP), se cruzó con la línea transgénica HCC. La infiltración de neutrófilos y macrófagos ocurre tanto en HCC como en HCC alimentados con HCD, que se evaluó mediante la cuantificación del número y la densidad de neutrófilos/macrófagos en el hígado y sus alrededores (área circundante de hasta 75 μm) (Figura 6A-H). Sin embargo, el HCC+HCD mostró un aumento significativo en el número y densidad de neutrófilos (Figuras 6F-H). A los 13 días después de la fertilización, el sistema inmune adaptativo ya está funcionando. Usando una línea de peces transgénicos que exprese proteína fluorescente en células T, como la Tg(lck: EGFP), y en combinación con la línea transgénica HCC; Se evaluó el impacto del exceso de colesterol en el reclutamiento de células T para el hígado. Se observó una disminución significativa en la densidad de células T y el número total en larvas de HCC alimentadas con HCD (Figura 6I-K).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Líneas transgénicas de pez cebra</td>
			<td>Referencia ZFIN</td>
			<td>Ensayo</td>
		</tr><tr><td>Casper</td>
			<td>RoyA9; MITFAW2</td>
			<td>Estetina hepáticaosis</td>
		</tr><tr><td>Tg(fabp10a:pt-β-catenin_cryaa:Venus / fabp10a:H2B-mCherry )</td>
			<td>s704Tg / uwm41Tg</td>
			<td>Morfología hepática</td>
		</tr><tr><td>Tg(fabp10a:pt-β-catenin_cryaa:Venus; fabp10a:H2B-mCherry; fabp10a:LIFEACT-EGFP)</td>
			<td>s704Tg / uwm41Tg / uwm42Tg</td>
			<td>Hepatocitos y morfología nuclear</td>
		</tr><tr><td>Tg(fabp10a:pt-β-catenin_ cryaa:Venus; fli:EGFP)</td>
			<td>s704Tg / y1Tg</td>
			<td>Angiogénesis</td>
		</tr><tr><td>Tg(fabp10a:pt-β-catenin_cryaa:Venus;  mfap4:Tomate-CAAX; lyzC:BFP)</td>
			<td>s704Tg / xt6Tg / zf2171Tg</td>
			<td>Reclutamiento de macrófagos y neutrófilos</td>
		</tr><tr><td>Tg(fabp10a:pt-β-catenin_cryaa:Venus; lck:EGFP)</td>
			<td>s704Tg / cz1Tg</td>
			<td>Reclutamiento de células T</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 1: Líneas de pez cebra transgénico para usar en diferentes ensayos.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Número de larvas</td>
			<td>Tamaño de la caja de alimentación</td>
			<td>Cantidad de alimentos por día (mg)</td>
			<td>E3 Volumen (ml)</td>
		</tr><tr><td>30-40</td>
			<td>Pequeña caja de cría</td>
			<td>3-4</td>
			<td>200</td>
		</tr><tr><td>60-80</td>
			<td>Caja de cría pequeña/grande</td>
			<td>6-8</td>
			<td>400</td>
		</tr><tr><td>100-150</td>
			<td>Gran caja de cría</td>
			<td>10-15</td>
			<td>500</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 2: Configurar las condiciones de las cajas de alimentación.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Fenotipo</td>
			<td>Método de puntuación</td>
		</tr><tr><td>Ninguno</td>
			<td>Núcleos normales, sin micronúcleos ni hernia</td>
		</tr><tr><td>Leve</td>
			<td>Bajo número de micronúcleos (menos de 5 por campo de visión) y/o hernia</td>
		</tr><tr><td>Moderado/Severo</td>
			<td>Número moderado a alto de micronúcleos (más de 5 por campo de visión) y/o hernia</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 3: Puntuación de micronúcleos y hernia nuclear.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62457/62457fig01.jpg"> Figura 1: Diagrama de protocolo que resume los principales pasos experimentales y el enfoque de análisis. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62457/62457fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62457/62457fig02.jpg"> Figura 2: Ensayo de control para esteatosis hepática - tinción ORO. Las larvas de HCC se alimentaron con una dieta de colesterol normal o alta y se realizó tinción Oil Red O (ORO) para evaluar la esteatosis hepática. (A) Diagrama de la placa de 12 pocillos para realizar tinción secuencial ORO utilizando los insertos de pocillos de malla. (B) Imagen de la herramienta de pestañas utilizada para manipular larvas. (C) Imágenes representativas de hígados teñidos con rojo aceite; Larvas de HCC y HCC+HCD. (D) Gráfico de Chi-cuadrado que muestra el porcentaje de larvas con diferente puntuación de esteatosis hepática. Barra de escala = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62457/62457fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62457/62457fig03.jpg"> Figura 3: Imágenes representativas del tamaño del hígado. Las larvas transgénicas de HCC que expresan un marcador hepático (Tg(fabp10a: H2B-mCherry)) se obtuvieron imágenes vivas y no invasivas, en un microscopio confocal de disco giratorio invertido utilizando un zWEDGI. (A) Reconstrucciones 3D representativas de hígados en larvas de HCC y HCC+HCD. (B-D) Gráfico que muestra alteraciones morfológicas hepáticas incluyendo área hepática (B), área de superficie hepática (C) y volumen hepático (D) en larvas de HCC y HCC+HCD. Barra de escala = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62457/62457fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62457/62457fig04.jpg"> Figura 4: Imágenes representativas de hepatocitos y morfología de núcleos. Se obtuvieron imágenes de líneas de HCC transgénicos que expresan proteínas fluorescentes en membranas de hepatocitos (Tg(fabp10a:Life-actin-EGFP) y en núcleos de hepatocitos (Tg(fabp10a:H2B-mCherry). (A-C) Reconstrucciones 3D representativas de núcleos de actina F y hepatocitos de larvas de HCC y HCC+HCD. Las puntas de flecha abiertas muestran núcleos agrandados; las puntas de flecha blancas muestran un núcleo con forma alterada; y las flechas rojas muestran micronúcleos y hernia nuclear. (D-G) Gráficos que muestran promedios de parámetros celulares y nucleares en larvas de 13 días de HCC y HCC + HCD. (D) Área de hepatocitos. e) Zona nuclear. (F) Relación nuclear:citoplasma. G) Circularidad nuclear. Cada punto representa promedios por larva. Los diagramas de puntos muestran gráficos de Chi-cuadrado medios ±SEM (H) que muestran el porcentaje de larvas con diferente puntuación de micronúcleos y hernia nuclear. Barra de escala = 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62457/62457fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62457/62457fig05.jpg"> Figura 5: Imágenes representativas de la vasculatura hepática. Líneas de HCC transgénicas que expresan proteínas fluorescentes en núcleos de hepatocitos (Tg(Fabp10a:H2B-mCherry) y en células endoteliales (Tg)fli:EGFP)). (A) Reconstrucciones 3D representativas de la vasculatura hepática en larvas de HCC y HCC+HCD. (B-C) Gráfico que muestra el índice de densidad de vasos por área de superficie hepática (B) volumen (C) en larvas de HCC y HCC + HFCD. Los diagramas de puntos muestran la media ±SEM. Barra de escala = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62457/62457fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62457/62457fig06.jpg"> Figura 6: Imágenes representativas del paisaje de células inmunes hepáticas. Línea de HCC transgénica que expresa proteínas fluorescentes en macrófagos y neutrófilos (Tg(mfap4:tdTomato-CAAX; lyz:BFP) o en células T (Tg(lck-EGFP). (A,C,F) Reconstrucciones 3D representativas de hígados y reclutamiento de leucocitos en el área hepática en larvas de HCC y HCC+HCD de 13 días de edad. (B) Diagrama del área del hígado fotografiada. (D-E) Gráfico que muestra la densidad de macrófagos (D) y el número (E) en el área hepática en larvas de HCC y HCC + HCD. (G-H) Gráfico que muestra la densidad (G) y el número (H) de neutrófilos en el área hepática en larvas de HCC y HCC + HCD. (G) Reconstrucciones 3D representativas del reclutamiento de células T en el área hepática en larvas de HCC y HCC + HCD. (H-I) Gráfico que muestra la densidad de células T (H) y el número (I) en el área hepática en larvas de HCC y HCC + HCD. Los diagramas de puntos muestran la media ±SEM. Barra de escala = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62457/62457fig06large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Tabla suplementaria 1: Tabla de tampones y soluciones <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62457/JoVE_Table_of_buffersandsolutions.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta tabla.</a>

Aquí, presentamos cómo generar un modelo de pez cebra de carcinoma hepatocelular (HCC) asociado a la enfermedad del hígado graso no alcohólico (NAFLD) para estudiar el impacto del excedente de colesterol en el microambiente hepático y el paisaje de las células inmunes.

Análisis del microambiente hepático durante la progresión temprana del carcinoma hepatocelular asociado a la enfermedad del hígado graso no alcohólico en pez cebra

Liver cancer is currently the third&#160;leading cause of cancer related death worldwide, and Hepatocellular Carcinoma (HCC) accounts for 75-90% of all ...

Nuestros modelos y protocolos de cáncer de hígado de pez cebra brindan una oportunidad única para visualizar in vivo, de forma no invasiva, el microambiente hepático y el paisaje inmunológico utilizando microscopía intravital. La transparencia de las larvas de pez cebra es sin duda la principal ventaja de este sistema, que nos permite realizar microscopía intravital no invasiva y obtener información sobre el microambiente y la infiltración de células inmunes de un tejido y órgano profundo, como el hígado. Nuestro modelo nefrótico inducido por la dieta y las técnicas de imagen descritas en este protocolo se pueden aplicar fácilmente a las interacciones célula-célula enrevesadas en otras enfermedades hepáticas o campos de investigación, incluido el síndrome metabólico y las enfermedades cardiovasculares.Demostrando el procedimiento estarán Cassia Michael, nuestra técnica de laboratorio, y el Dr. Francisco Juan Martínez-Navarro, becario postdoctoral en mi laboratorio. Para comenzar, pese cuatro gramos de dieta comercial de alimentos secos para larvas de pez cebra en dos vasos de vidrio de 25 mililitros, uno para la dieta normal y el otro para la dieta alta en colesterol al 10%, o HCD. Pese 0,4 gramos de colesterol en un vaso de precipitados de vidrio de 10 mililitros y cubra el vaso de precipitados con papel de aluminio.En una campana extractora, mida cinco mililitros de éter dietílico con una jeringa de 10 mililitros con una aguja de calibre 20. Luego, agregue el éter dietílico al vaso de precipitados de dieta normal e inmediatamente mézclelo con el alimento seco con una espátula. Mida otros cinco mililitros de éter dietílico con la misma jeringa y aguja y agréguelo al vaso de precipitados que contiene HCD.Mezclar inmediatamente aspirando hacia arriba y hacia abajo con la jeringa. Agregue rápidamente la solución de colesterol al vaso de precipitados HCD e inmediatamente mézclela con una espátula hasta que la solución esté uniforme. Deje los vasos de precipitados en la capucha durante un máximo de 24 horas para evaporar completamente el éter dietílico.Al día siguiente, muele las dietas en partículas finas usando un mortero. Transfiera cada dieta a una pequeña bolsa de plástico etiquetada o a un tubo de centrífuga de 50 mililitros y guárdelos a menos 20 grados centígrados. Establezca líneas de peces transgénicos en el día menos uno.En el día cero, recoja los huevos en un colador de malla después de que los peces hayan desovado. Usando una botella de lavado con E3, enjuague bien los huevos y transfiéralos cuidadosamente a placas de Petri de 10 centímetros con medio E3. Limpie las placas de todos los desechos que puedan haberse acumulado en las cajas de reproducción, incluidos los huevos muertos o no fertilizados para evitar el crecimiento incontrolado de microorganismos y los consiguientes defectos en el desarrollo de las larvas.Luego divida los huevos a una densidad de 70 u 80 huevos por plato que contenga 25 mililitros de E3. El primer día, revise y limpie los embriones muertos o embriones con defectos de desarrollo bajo un alcance de disección equipado con una base de transiluminación. En el quinto día, combine las larvas de todos los platos en una placa de Petri de 15 centímetros y agregue E3 sin azul de metileno. Divida las larvas en las cajas de alimentación y aliméntelas como se describe en el texto manuscrito.Mantenga las larvas en la sala de peces cebra o en una incubadora a 28 grados centígrados en un ciclo de luz oscura y aliméntelas dos veces al día desde el día 5 hasta el día 12. Elimine los restos de alimentos diariamente, así como del 90 al 95% del medio utilizando un sistema de vacío conectado a una punta de pipeta de un mililitro. Luego, vierta cuidadosamente el nuevo E3 sin azul de metileno en una esquina de la caja de alimentación para evitar dañar las larvas.Alternativamente, las larvas se pueden dividir en tanques de tres litros con agua del sistema y colocarse como una unidad de sistema independiente con un bajo flujo de agua. Esta alternativa ahorra el tiempo requerido para el proceso de limpieza diario, y el sistema de filtración ayuda a mantener las larvas sanas hasta el punto final. El día 13, prepare los platos de recolección de acuerdo con la cantidad de condiciones experimentales que se establecieron.Vierta suficiente E3 sin azul de metileno para cubrir el fondo de cada plato. Luego, con cuidado, usando el sistema de vacío, aspire el agua de las cajas de alimentación. Cuando el nivel del agua comience a bajar, levante lentamente la caja de alimentación para hacer que las larvas naden hacia una de las esquinas, luego aspire en la dirección opuesta.Una vez que solo quedan unos 20 a 30 mililitros del líquido, decanta cuidadosamente las larvas en la placa de Petri de colección preparada y coloca la cinta etiquetada de la caja de alimentación en la tapa del plato. En un microscopio estereoscópico de fluorescencia, examine las larvas anestesiadas en busca de marcadores fluorescentes deseados. Luego agregue tricaine E3 en las cámaras del dispositivo de herida y atrapamiento.Retire las burbujas de aire de las cámaras y del canal de sujeción con una micropipeta P-200. Retire todo el exceso de tricaína E3, dejando solo el volumen suficiente para llenar las cámaras. A continuación, transfiera una larva anestesiada a la cámara de carga del dispositivo de herida y atrapamiento y colóquela para obtener imágenes del lóbulo izquierdo con una herramienta de pestañas.Imagen de la morfología de todas las células requeridas en el hígado bajo un microscopio confocal como se describe en el texto manuscrito. Abra el software Fiji. Luego abra el archivo de imagen y marque la opción Dividir canales en la pestaña Opciones de importación de bioformato.Después de crear proyecciones de intensidad máxima para cada canal, cree un ROI que rodee el hígado larvario y mida el área del hígado. Luego, agregue una barra de escala como referencia y cree un segundo ROI que incluya el área del hígado y 75 micrómetros del área circundante. En el menú Plugins, seleccione la opción Analizar seguida de Cell Counter y cuente las células inmunes dentro del área de reclutamiento.Registre el número de células inmunitarias reclutadas en una hoja de cálculo. Calcule las densidades de neutrófilos, macrófagos y células T normalizando el número de células inmunitarias por área hepática. Las larvas de pez cebra HCC alimentadas con una dieta normal no muestran esteatosis hepática, medida por tinción Oil Red O.Sin embargo, las larvas de HCC alimentadas con HCD muestran un aumento significativo en la esteatosis hepática. Después de ocho días de exposición a un excedente de colesterol, se observó agrandamiento del hígado en larvas de HCC. Para evaluar la hepatomegalia, se evaluaron el área hepática, el área de superficie hepática y el volumen hepático.En el CHC asociado a esteatohepatitis no alcohólica, el área de hepatocitos, junto con el área nuclear, y la relación nuclear-citoplasmática aumentaron. También se observó una disminución significativa en la circularidad nuclear en el grupo de HCC alimentado con dieta alta en grasas. Utilizando el marcador H2B-mCherry, se detectó una mayor incidencia de micronúcleos en las larvas de HCC alimentadas con HCD.La evaluación de la vasculatura hepática mostró un aumento significativo en la densidad de vasos en larvas de HCC alimentadas con HCD. La infiltración de macrófagos y neutrófilos ocurrió tanto en HCC como en HCC alimentados con larvas de HCD. La cuantificación de neutrófilos en macrófagos en el hígado y sus proximidades mostró un aumento significativo en el número y la densidad de las células en larvas de HCC alimentadas con HCD.En contraste, se observó una disminución significativa en la densidad de células T en el número total en larvas de HCC alimentadas con HCD. La limpieza de los tanques y la alimentación son los pasos más importantes para asegurar la viabilidad de las larvas y evitar el desarrollo de esteatosis o inflamación crónica hepática y sistémica en los controles debido a la mala calidad del agua o la alimentación inadecuada. Se pueden realizar otros métodos como la microscopía de lapso de tiempo y el análisis de la interacción entre las diferentes células que pueblan el hígado.Además, se puede realizar una búsqueda de ARN unicelular de hígados disecados en diferentes etapas del cáncer de hígado para comprender en su totalidad cómo evoluciona el panorama inmune del hígado con la progresión de la enfermedad.

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Investigación

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Investigación del cáncer

Para ayudar a evaluar los mecanismos moleculares que subyacen a la regeneración hepática biliar del pez cebra, establecimos un modelo de lesión hepática en el que los hepatocitos que expresan nitroreductasa se ablacionan genéticamente tras el tratamiento con metronidazol.  En este protocolo, describimos cómo manipular, monitorizar y analizar hábilmente la ablación de hepatocitos y la regeneración hepática impulsada por la biliar.

Ablación específico de hepatocitos en pez cebra para estudiar biliar impulsada regeneración hepática

La fibrosis sostenida con depósito excesivo de proteínas de la matriz extracelular conduce a la cirrosis. El abuso del alcohol es una de las principales causas de enfermedad hepática grave. Establecimos un modelo de hígado fibrótico de pez cebra inducido por etanol para estudiar los mecanismos y estrategias de promoción de la regeneración de hepatocitos tras la lesión inducida por el alcohol.

Desarrollo de un Modelo de hígado fibrótico inducida por etanol en el pez cebra para el Estudio de células progenitoras mediada por la regeneración de hepatocitos

El pez cebra está emergiendo como un modelo valioso de procesamiento de lípidos en la dieta y enfermedades metabólicas. Se describen los protocolos de alimentación para larvas ricas en lípidos, imágenes en vivo de análogos lipídicos fluorescentes en la dieta y cuantificación de la ingesta de alimentos. Estas técnicas se pueden aplicar a una variedad de técnicas de detección, imágenes e indagación basada en hipótesis.

La alimentación de las larvas de pez cebra paradigma para la alta en grasas: Alimentación, imágenes en vivo, y Cuantificación de la ingesta de alimentos

Este protocolo describe el análisis histológico de los hígados de larvas de pez cebra que se han tratado con etanol al 2% durante 24 h. Este tratamiento agudo con etanol da lugar a esteatosis hepática ya hinchamiento de la vasculatura hepática.

Análisis histológicos de lesiones hepáticas alcohólicas agudas en peces cebra

Aquí demostramos un método para cuantificar el tamaño del hígado en el pez cebra larval, proporcionando una manera de evaluar los efectos de las manipulaciones genéticas y farmacológicas en el crecimiento y desarrollo del hígado.

Cuantificación del tamaño del hígado en el pez cebra larvario mediante la microscopía Brightfield

Aquí, proporcionamos un protocolo paso a paso, con consejos para generar xenoinjertos y directrices para el análisis del comportamiento tumoral, la inmunofluorescencia de montaje completo y la cuantificación de imágenes confocales.

Generación de Xenoinjertos Larvales de Pez Cebra y Análisis de Comportamiento Tumoral

La matriz extracelular recelularizada de un hígado de rata descelularizado se puede utilizar como un modelo humanizado y tridimensional ex vivo para estudiar la distribución y la expresión transgénica de un virus o vector viral.

Estudio de vectores virales en un tridimensional del hígado Modelo repoblado con la línea celular humana HepG2 carcinoma hepatocelular

La capacidad de los clones metastásicos para colonizar sitios distantes depende de su capacidad de proliferación y/o de su capacidad para sobrevivir en el microambiente del huésped sin una proliferación significativa. En este trabajo se presenta un modelo animal que permite la visualización cuantitativa de ambos tipos de colonización hepática por clones metastásicos.

Avanzada modelo animal de colorrectal metástasis en hígado: Técnicas de imagen y propiedades metastásicas de los clones

Describimos en detalle un modelo de tumor de metástasis hepáticas de cáncer colorrectal clínicamente relevante (CRLM) y la influencia de la reperfusión de isquemia hepática (I/R) en el crecimiento tumoral y la metástasis. Este modelo puede ayudar a entender mejor los mecanismos subyacentes promoción inducida por cirugía del crecimiento metastásico hepático.

Modelo murino de tumores hepáticos metastásicos en el escenario de la lesión por reperfusión de isquemia

Los modelos de ratón de xenoinjerto de melanoma uveal de hígado humano ortotópico se crearon utilizando técnicas quirúrgicas de implantación ortotópica con técnicas de inyección de agujas y trozos tumorales derivados del paciente con líneas celulares de melanoma uveal humano cultivadas.

Generación de una plataforma de xenoinjerto de melanoma uveal humano ortotópico hepático en ratones inmunodeficientes

Explore el análisis del microambiente hepático en larvas de pez cebra con carcinoma hepatocelular asociado a NASH mediante microscopía confocal no invasiva. Este protocolo permite caracterizar la infiltración inmune y los cambios morfológicos tempranos en el hígado.

Análisis del microambiente hepático durante la progresión temprana del carcinoma hepatocelular asociado a la enfermedad del hígado graso no alcohólico en pez cebra (Video) | JoVE Journal

Análisis del microambiente hepático durante la progresión temprana del carcinoma hepatocelular asociado a la enfermedad del hígado graso no alcohólico en pez cebra

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