Name: التنميط الجيني السريع من الأنسجة باستخدام الماوس سيغما استخراج - N - PCR الأمبير الأنسجة كيت (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-01-22T18:40:00.000+00:00
Duration: 12 min 39 s
Description: اكتشف طريقة التنميط الجيني السريع للفئران المعدلة وراثياً باستخدام عدة SYBR Green Extract-N-Amp Tissue PCR. يتيح هذا البروتوكول الحصول على نتائج دقيقة في ساعة ونصف فقط.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

الرجاء <a href="http://www.sigmaaldrich.com/life-science/molecular-biology/dna-and-rna-purification/sybr-green-extractnamp-tissue.html?cm_mmc=JoVE-_-video-_-extract-_-video">انقر هنا</a> لعرض البروتوكول.

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

<table><tbody><tr><td>&lt;أضف رابطًا إلى=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&amp;amp;N4=XNATG%7CSIGMA&amp;amp;N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&amp;amp;F=SPEC&amp;amp;cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12346&quot;&gt;طقم SYBR Green Extract-N-Amp لإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) للأنسجة&lt;/a&gt;</td><td>طقم الكواشف</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&lt;رابط تشعبي=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&amp;amp;N4=XNATG%7CSIGMA&amp;amp;N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&amp;amp;F=SPEC&amp;amp;cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12346&quot;&gt;XNATG&lt;/a&gt;</td><td>تتضمن: محلول الاستخلاص، ومحلول التعادل ب، ومحلول تحضير الأنسجة، ومزيج Extract-N-Amp SYBR Green الجاهز لتفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR ReadyMix)</td></tr></tbody></table>

التنميط الجيني السريع من الأنسجة باستخدام الماوس سيغما استخراج - n - pcr الأمبير الأنسجة كيت

Rapid Genotyping of Mouse Tissue Using Sigma's Extract-N-Amp Tissue PCR Kit

الكشف عن الجينوم من الحمض النووي عبر تضخيم PCR والكشف على الجل هو طريقة الكهربي القياسية التي يتم تحديد النمط الجيني لعينة الأنسجة. إعداد التقليدية الأنسجة للPCR جاهزة الحمض النووي وعادة ما تستغرق عدة ساعات إلى أيام ، اعتمادا على عينة الأنسجة. وهكذا يمكن النمط الجيني للعينة يتم تأجيلها لعدة أيام ، وهي ليست خيارا لأنواع مختلفة من التجارب. نحن هنا لشرح التنميط الجيني الكامل للماوس عينة الذيل ، بما في ذلك هضم الأنسجة وقراءات PCR ، في واحدة ونصف الساعة باستخدام سيغما SYBR الاخضر المقتطف - N - PCR الأمبير الأنسجة كيت. أولا ، علينا أن نظهر استخراج خمسة عشر دقيقة من الحمض النووي من عينات الأنسجة. ثم ، علينا أن نظهر في الوقت الحقيقي للقراءة للخروج من التضخيم PCR من العينة ، والذي يسمح لتحديد عينة ايجابية كما أنه يجري تضخيمها. معا ، واستخراج قراءات في الوقت الحقيقي والسريع من أجل السماح الفوري لتحديد النمط الجيني لأنواع مختلفة ومتنوعة من الأنسجة من خلال طريقة موثوقة لPCR.

ويتم ذلك على التنميط الجيني الكامل للماوس عينة الذيل ، بما في ذلك هضم الأنسجة وقراءات PCR ، في واحدة ونصف الساعة باستخدام سيغما SYBR الاخضر المقتطف - N - PCR الأمبير الأنسجة عدة.

التنميط الجيني السريع من الأنسجة باستخدام الماوس سيغما استخراج - N - PCR الأمبير الأنسجة كيت

يُعد الكشف الجينومي عن الحمض النووي (DNA) عبر التضخيم بتفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) والكشف عنه باستخدام هلام الرحلان الكهربائي طريقة قياسية لتحديد النمط الجيني لعينة نسيجية...

مرحباً، اسمي ليندا وأعمل في مختبر الدكتور إدوين نيكي بجامعة كاليفورنيا إيرفاين. سأوضح لكم اليوم كيفية استخدام مجموعة Sigma's Cyber Green لـ extracting a tissue PCR kit من أجل التنميط الجيني السريع للفئران المعدلة وراثياً. عادةً ما أستخدم هذه المجموعة لإجراء التنميط الجيني لفئراننا الجنينية عندما أقوم بعمل مزارع خلوية تفكيكية حادة وأحتاج إلى معرفة النمط الجيني للفأر بسرعة فائقة.ولكن لأغراض اليوم، لدينا ذيول فئران بالغة يمكننا من خلالها أن نوضح لكم كيفية استخدام هذه المجموعة. يتضمن هذا البروتوكول عملية هضم سريعة باستخدام الـ ale واستخلاصاً للحمض النووي DNA، ثم خطوة تعادل سريعة. ونستخدم الـ DNA المستخلص في تفاعل PCR في الوقت الحقيقي، حيث يمكننا مراقبة نواتج تضخيم الـ PCR.إذا كنتم مستعدين، فلنبدأ. قبل البدء، نريد التأكد من ضبط الكتلة الحرارية على 95 درجة Celsius، وأن صبغة cyber green قد ذابت وتُحفظ على الثلج حتى وقت استخدامها، وأن الكواشف الأخرى تذوب لتصل إلى درجة حرارة الغرفة. يوجد في دلو الثلج الخاص بي البادئان اللذان سنستخدمهما للتنميط الجيني، وقد تم تصميمهما خصيصاً للجين المستهدف والتحقق من كفاءتهما في QPCR.لدي أيضاً الضابط الموجب للجين المستهدف والضابط السالب وعينة نسيجية قمت بجمعها مسبقاً من فأر بالغ. والآن، عند جمع عينة النسيج، من المهم جداً توخي الدقة الشديدة؛ فعندما نجمع الذيول الجنينية للفئران، نقوم دائماً بشطف الملاقط بـ 70% ethanol قبل وأثناء كل عملية جمع للأنسجة.نقوم دائماً بشطف عينات الذيل في محلول TBS أولاً، ثم يجب تحضير مزيج رئيسي (master mix) لتحضير الأنسجة واستخلاص DNA لكل ذيل، حيث ستحتاج إلى 100 µL من محلول الاستخلاص و25 µL من محلول تحضير الأنسجة. سأستخدم الماصة P 200 ورؤوس ماصة مزودة بمرشح لقياس 100 µL من محلول الاستخلاص و25 µL من محلول تحضير الأنسجة في أنبوب eppendorf جديد. بعد ذلك، قم بخلط محلول المزيج الرئيسي عن طريق السحب والدفع بالماصة.وبناءً على ذلك، ستحتاج إلى إضافة 125 µL من المزيج الرئيسي (master mix) إلى العينة المراد دراستها، مع التأكد من أن الطرف المقطوع مغمور تماماً في محلول المزيج الرئيسي إذا كانت العينة عبارة عن ذيل فأر بالغ، ويمكنك بعدها رج العينة برفق باستخدام الأصابع (finger vortex) ثم تحضينها في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. وأثناء فترة التحضين التي تستغرق 10 دقائق، سأقوم بتحضير المزيج الرئيسي الأخضر المفضل لدي، والذي يتكون من المزيج الرئيسي cider green المرفق في المجموعة، ومياه Milli Q أو مياه مخصصة لـ PCR، والبادئات الخاصة بنا، حيث يتم خلط مياه PCR مع البادئات الأمامية والعكسية. وهذا كل شيء.بعد انتهاء فترة الحضانة التي استغرقت 10 دقائق، سنقوم بتسخين وتنشيط التفاعل عند 95 درجة لمدة ثلاث دقائق. لقد انتهت فترة التعطيل التي استغرقت ثلاث دقائق، والآن سنضيف محلول التعادل المرفق في الطقم، حيث سنضيف 100 µL لكل تفاعل، ثم نقوم بخلط هذا المزيج باستخدام جهاز Vortex. بعد إضافة منظم التعادل، يمكن تخزين عينات DNA عند 4 درجة Celsius حتى يحين وقت استخدامها.نحن نرغب في الحصول على النمط الجيني على الفور، لذا سننتقل مباشرة إلى عملية الـ QPCR، حيث تم تحييد العينات الموجودة في الأنابيب وأصبحت جاهزة. كما أن خليط الـ Cyber Green PCR master mix جاهز، وقد قمت بتجهيز أنابيب الـ PCR على كتلة تبريد.كل ما سأفعله الآن هو إضافة 16 µL من المزيج الرئيسي (master mix) إلى كل بئر، ثم إضافة 4 µL من المستخلص المعاد تعاديله أو 4 µL من الضابط الموجب أو السالب إلى كل منها. سأقوم بإضافة 16 µL من المزيج الرئيسي إلى كل بئر. بعد ذلك، سأضيف 4 µL من المستخلص المعاد تعاديله إلى 16 µL من المزيج الرئيسي في البئر، ليكون إجمالي حجم التفاعل 20 µL.وسأقوم بنفس الإجراء بالنسبة للضوابط الموجبة والسالبة، وذلك بإضافة 4 µL إلى 16 µL من المزيج الرئيسي PPR master mix. وبمجرد إضافة جميع المكونات، يمكنك إغلاقها باستخدام شريط أغطية ثماني شفاف بصرياً.يجب الحرص على عدم لمس الجزء الشفاف بصرياً من الأغطية الموجودة فوق العينات. لذا، أنا أستخدم مناديل Kim wipe للضغط على الأغطية للتأكد من إحكام إغلاقها. لقد قمت برجّ خليط الـ PCR والـ DNA بلطف باستخدام جهاز vortex ثم قمت بطردهم بالتنظيم المركزي (spun them down)، ونحن الآن مستعدون لوضعهم في جهاز QPCR.سنقوم أولاً بتحميل العينات في جهاز Opticon PCR، وسأقوم بإعداد لوحة جديدة، حيث ستكون البئر الأولى للعينات، والبئر الثانية للضابط الموجب، والبئر الثالثة للضابط السالب، مع تحديد أن الحجم الإجمالي للتفاعل هو 20 µL. بعد ذلك، سأقوم بتحميل بروتوكول مصمم لعملية التنميط الجيني السريع.يتضمن هذا البروتوكول خطوة مسخ لمدة ثلاث دقائق، ودورة تتكون من 15 ثانية من المسخ، و15 ثانية من الارتباط الأولي، ثم 20 ثانية من التمديد الأولي. ويمكن في الواقع خفض زمن التمديد الأولي إلى حوالي 10 ثوانٍ، وبذلك يصبح المجموع 40 ثانية فقط. وفي كل دورة، تتكرر هذه الخطوات الثلاث حوالي 40 مرة كما هو الحال في تفاعل PCR العادي، وفي نهاية ذلك نقوم بإجراء منحنى الانصهار.لقد انتهينا من تجهيز الطبق وتحميل البروتوكول. كل ما علينا فعله الآن هو تشغيل جهاز QPCR، والذي سيبدأ بمرحلة المسخ لمدة ثلاث دقائق. ومن خلال خبرتي، وبالاعتماد على البادئات التي أستخدمها وعينات الذيل والبحث عن الجينات المستهدفة، أعلم أن العينات الإيجابية ستبدأ في الظهور عند حوالي 25 دورة، متجاوزة عتبة الدورة ذات الدلالة الإحصائية.الآن، يعتمد توقيت هذا التقاطع بشكل كبير على عينة النسيج لديك، وما تبحث عنه، وكمية DNA الموجودة في البداية. لذا يمكننا أن نرى بالفعل أن الضابط الموجب قد ظهر بالفعل، ويبدو أن عينتنا موجبة أيضاً. كما تلاحظون، بدأت تظهر قليلاً بعد الضابط الموجب.سيتعين علينا الانتظار لفترة أطول لأننا لا نزال عند الدورة 27، ولكن من المؤمل في غضون دورتين إضافيتين أن نتأكد من أن عينتنا إيجابية، وعندها يمكنني المضي قدماً في تجربتي. في هذه المرحلة، يمكنك رؤية الضابط السلبي يبدأ في الظهور، وذلك لأنني استخدمت كمية زائدة من الذيل. يساعدك ذلك على التأكد من أن أي شيء يظهر قبل هذا الذيل السلبي الزائد سيكون إيجابياً.لذلك، في هذه المرحلة، سأعتبر أي نتيجة تظهر قبل العينة السالبة نتيجة موجبة، وسأواصل تجربتي. وبعد انتهاء دورات PCR، يقوم الجهاز بإجراء تحليل منحنى الانصهار، وهو ما سيساعدك في تحديد تركيب ونقاء المنتج الخاص بك.بهذه الطريقة، يمكنك معرفة ما إذا كنت قد اخترت العينات الموجبة والسالبة بشكل صحيح. على سبيل المثال، ستظهر العينة الموجبة قمة حادة ومحددة لدرجة حرارة الانصهار، والتي تقابل تضاعف منتج PCR محدد. أما أي عينات سالبة فستظهر قمة عريضة وغير محددة لدرجة حرارة الانصهار، وهو ما يشير إلى تضاعف DNA غير محدد خلال عملية PCR.لقد أوضحتُ لكم للتو كيف نستخدم مجموعة استخلاص Cyber Green من شركة Sigma لإجراء التنميط الجيني السريع لذيول الفئران البالغة. ولكن يمكن استخدام هذه المجموعة مع أنسجة حيوانية متنوعة، والشعر، واللعاب، كما أنني أستخدمها لإجراء التنميط الجيني لذيول الأجنة في الفئران. نحن نفضل استخدام هذه المجموعة نظراً لسرعتها.يمكنني الحصول على نمطي الجيني في غضون ساعة واحدة، وهو أمر مريح وبسيط للغاية. لذا، شكراً للمشاهدة وبالتوفيق.

rapid-genotyping-mouse-tissue-using-sigma-s-extract-n-amp-tissue-pcr

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

نحن يبرهن على وجود مناعي لونين (CHIP) طريقة لتحديد التفاعلات عامل في جينات محددة الأنسجة أثناء أو بعد ظهور الأنسجة محددة التعبير الجيني في الأنسجة الجنينية الماوس. هذا ينبغي أن تكون قابلة للتطبيق على نطاق واسع بروتوكول لدراسة تفعيل الجين الأنسجة محددة كما يحدث أثناء التطور الجنيني الطبيعي.

مناعي لونين الفحص الجينات الأنسجة الخاصة باستخدام أجنة فئران في مرحلة مبكرة

وحيد الخلية التنميط التعبير يسمح التعبير الجيني التحليل التفصيلي الخلايا الفردية. نحن تصف طرق لعزل الخلايا العضلية ، وإعداد lysates الناتجة إما كليا أو ميكروأري transcriptome qPCR أهداف محددة.

التنميط واحدة من الخلايا العضلية الترانسكربتي ماوس الكبار

النهج PCR المباشرة المقدمة هنا يسهل PCR التضخيم مباشرة من المصنع كميات صغيرة من أنسجة الحيوانات وغير منقى.

التنميط الجيني للعينات النباتية والحيوانية دون تنقية DNA قبل

وصفنا إجراءات لوضع العلامات والتنميط الجيني الفئران حديثي الولادة وتوليد الثقافات العصبية الأولية منها. والتنميط الجيني هو سريع وفعال وموثوق بها، ويسمح لاستخراج-نوكليك حمض الآلي. وهذا مفيد خصوصا بالنسبة للفئران المميتة neonatally وثقافاتهم التي تتطلب استكمال مسبق من التنميط الجيني.

رابيد التنميط الجيني للحيوانات تلاه إنشاء الثقافات الأولية من الخلايا العصبية في الدماغ

ويصف هذا البروتوكول الخطوات الحاسمة والاحتياطات المطلوبة لأداء متعدد النسخ العكسي خلية مفردة البلمرة المتسلسل بعد التصحيح-المشبك. هذا الأسلوب أسلوب بسيط وفعال لتحليل الشخصية التعبير لمجموعة محددة سلفا من المورثات من خلية واحدة تتميز بتسجيلات المشبك التصحيح.

خلية مفردة متعدد النسخ العكسي البلمرة المتسلسل بعد التصحيح-المشبك

هنا ، نقدم بروتوكول eCLIP لتحديد أهداف الجيش الملكي النيبالي الرئيسية للمرشحين الملكي في الخصية.

طريقه الربط المحسنة لايمونوبريسيبيتيشن (eCLIP) للتعرف الفعال علي الحمض الريبي المرتبط بالبروتين في خصيه الماوس

هنا قدمنا مضاعفه خليه واحده mRNA أسلوب التسلسل إلى التعبير الجيني الشخصي في الانسجه الجنينية الماوس. الخلية المفردة القائمة علي القطرات mRNA التسلسل (scRNA-Seq) الأسلوب في تركيبه مع استراتيجيات تعدد الإرسال يمكن الملفات الشخصية خلايا واحده من عينات متعددة في وقت واحد ، مما يقلل بشكل كبير من تكاليف الكاشف ويقلل من اثار الدفعة التجريبية.

مولتيميد خليه واحده mRNA تحليل التسلسل من الخلايا الجنينية الماوس

هنا، نقدم طريقة معدلة للحفظ بالتبريد للأجنة ذات الخلية الواحدة، فضلا عن بروتوكول يُشبه استخدام الأجنة المذابة بالتجميد والكهربية من أجل الجيل الفعال من الفئران المعدلة وراثيا.

استخدام الأجنة المذابة بالتجميد لإنتاج الفئران المعدلة وراثياً بكفاءة عالية

يصف البروتوكول الحالي طفرة M213L واحدة في Gja1 تحتفظ بجيل Connexin43 كامل الطول ولكنها تمنع ترجمة الشكل الأصغر GJA1-20k المترجم داخليا.

إزالة موقع بدء انتقالي داخلي من mRNA مع الاحتفاظ بالتعبير عن البروتين كامل الطول

كفاءة تحرير الجينوم المحسن عبر طريقة توصيل الأحماض النووية لقناة البيض (I-GONAD) يمكن مقارنتها بالحقن المجهري التقليدي ، والذي يتطلب جمع البيضت البيضي من الإناث المتبرعات ونقله إلى الإناث الحوامل الزائفات. يوضح هذا البروتوكول فعاليته من خلال إدخال الطفرات التي يسببها CRISPR / Cas9 في موضع ROSA26 على الكروموسوم 6.

تحسين تحرير الجينوم عبر تقنية التثقيب الكهربائي في الجسم الحي القائمة على توصيل الأحماض النووية في الجسم الحي لتوليد الفئران بالضربة القاضية

اكتشف طريقة التنميط الجيني السريع للفئران المعدلة وراثياً باستخدام عدة SYBR Green Extract-N-Amp Tissue PCR. يتيح هذا البروتوكول الحصول على نتائج دقيقة في ساعة ونصف فقط.

التنميط الجيني السريع من الأنسجة باستخدام الماوس سيغما استخراج - N - PCR الأمبير الأنسجة كيت

استكشف المزيد من الفيديوهات