Name: Label-Retention Expansion Microscopy (LR-ExM) maakt beeldvorming met superresolutie en zeer efficiënte etikettering mogelijk (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: Leer label-retentie-expansiemicroscopie (LR-ExM) voor superresolutiebeeldvorming van celstructuren met trifunctionele ankers. Deze methode levert zes keer hogere fluorescentie dan traditionele technieken.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de Amerikaanse National Institutes of Health (R00 GM126136 tot X.S.), de Amerikaanse National Science Foundation (DMS1763272 tot S.P.) en de Simons Foundation (594598 tot S.P.).

1. Celkweek
<ol><li>Gebruik U2OS-cellen gekweekt in McCoy's 5A-medium aangevuld met 10% FBS bij 37 °C in 5% CO2.</li>
	<li>Kweekcellen op een 16 goed verwijderbare kamer coverglas (kweekoppervlak 0,4 cm2) voor gebruiksgemak.</li>
</ol>2. Fixatie en permeabilisatie
OPMERKING: Fixatie- en permeabilisatiecondities zijn afhankelijk van de geoptimaliseerde immunostainingprotocollen. Het volgende is een fixatie- en permeabilisatieprotocol om microtubuli en clathrine gecoate putten (CCP's) te co-immunostainen.
<ol><li>Zodra het aantal cellen ~0,04 x 106 bereikt, fixeert u cellen met 100 μL 3,2% paraformaldehyde (PFA) in PEM-buffer (100 mM PIPES, 1 mM EGTA en 1 mM MgCl2, pH 6,9) gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur (tabel 1). OPMERKING: Fixatie met PFA wordt uitgevoerd in een gecertificeerde veiligheidskap.</li>
	<li>Was cellen driemaal gedurende 5 minuten elk met 200 μL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).</li>
	<li>Permeabiliseer cellen met de 100 μL permeabilisatiebuffer bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten (tabel 1). OPMERKING: Ga zo snel mogelijk door met labelen om doeleiwit-, RNA- of DNA-afbraak te voorkomen en een optimaal resultaat te verkrijgen. Indien nodig kunnen vaste monsters echter gedurende een lange tijd (tot een maand) worden opgeslagen in een PBS-buffer bij 4 °C. Vervang eventuele verdampte PBS en bescherm het monster tegen fotobleaching.</li>
</ol>3. Endogene streptavidin en biotine blokkering
<ol><li>Incubeer cellen met de streptavidinoplossing verdund in een celblokkerende buffer (100 μL) gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur (tabel 1).</li>
	<li>Spoel kort af met 200 μL celblokkerende buffer.</li>
	<li>Incubeer cellen met 100 μL biotineoplossing verdund in een celblokkerende buffer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. OPMERKING: Wanneer u een zelflabelende taggingbenadering gebruikt, zoals het gebruik van SNAP- of CLIP-tags, slaat u stap 4 over en gaat u verder met stap 5.1: zelflabeling tagging aanpak.</li>
</ol>4. Primaire antilichaamkleuring
<ol><li>Incubeer cellen met rattenanti-α-tubuline antilichaam (1:500 verdunning) en konijn anti-clathrin zware keten antilichaam (1:100 verdunning) in 100 μL celblokkingsbuffer gedurende 16 uur bij 4 °C of 1 uur bij kamertemperatuur. Verdubbel de incubatietijd voor de weefselmonsters.</li>
	<li>Was monsters vier keer met 200 μL PBS gedurende 5 minuten elk.</li>
</ol>5. LR-ExM specifieke secundaire antilichaamkleuring
<ol><li>Conjugaat IgG-antilichamen met de trifunctionele linkers zoals N-hydroxysuccinimide (NHS) - methacrylamide (MA) -Biotine of NHS-MA-Digoxigenin (Dig) (Figuur 1B). Synthese van trifunctionele ankers en conjugatie van de secundaire antilichamen zijn eerder geïntroduceerd in Shi et al.1. Zelfetiketteringsbenadering: Conjugaat IgG-antilichamen met de trifunctionele linkers, zoals MA- benzylguanine (BG)-Biotine of MA- benzylcytosine (BC)-Dig (Figuur 1B). Synthese van trifunctionele ankers en een conjugatie van de secundaire antilichamen zijn eerder geïntroduceerd in Shi et al.1.</li>
	<li>Incubeer cellen met de ezel anti-konijn-Dig-MA (1:100 verdunning) en ezel anti-rat-biotine-MA (1:100 verdunning) secundaire antilichamen in 100 μL celblokkerende buffer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Verdubbel deze incubatietijd voor de weefselmonsters.</li>
	<li>Was monsters vier keer in 200 μL PBS gedurende elk 5 minuten.</li>
</ol>6. Extra verankering
<ol><li>Incubeer cellen met 0,25% glutaaraldehyde (GA) in PBS (100 μL) gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur om de eiwitten op de hydrogel te verankeren. U kunt ook 25 mM methacrylzuur N-hydroxysuccinimide ester (MA-NHS) gebruiken voor verankering. Een uur incubatie bij kamertemperatuur wordt aangemoedigd.</li>
	<li>Was monsters drie keer in PBS gedurende 5 minuten elk.</li>
</ol>7. Gelation
OPMERKING: De expansiesnelheid wordt bepaald door de diffusietijd van zout en water uit of in de gel; het gieten van dunne gels versnelt dus de expansietijd.
<ol><li>Verwijder de bovenste structuur van de 16-well gelplaat. Voeg 40 μL monomeeroplossing toe aan elk putje om cellen op ijs te conditioneren. Incubeer op ijs gedurende 5 minuten.<ol><li>Zie tabel 2 om een monomeeroplossing te bereiden.</li>
	</ol></li>
	<li>Bereid de gelation-oplossing op ijs. Voeg dubbel gedestilleerd water en 10% N,N,N′,N′ Tetramethyleendiamine (TEMED) versneller toe aan de monomeeroplossing (10% TEMED: monomeeroplossing = 1:47); voeg de initiator nog niet toe (tabel 3).</li>
	<li>Gebruik voor een celkweekkamer met een oppervlakte van 0,4 cm2 een volume van de gelation-oplossing van ongeveer 40 μL. Bereid 45 μL gelation-oplossing voor elke put.</li>
	<li>Voeg 10% ammoniumpersulfaat (APS) toe aan de gelatatieoplossing, incubeer op ijs en pipetteer onmiddellijk 40 μL gelation-oplossing in elke siliconenpakking op ijs. Incubeer op ijs gedurende 3 minuten (10% APS: 10% TEMED: monomeeroplossing = 1:1:47).</li>
	<li>Bescherm het monster tegen licht en verplaats het afdekglas in de petrischaal van 10 cm gedurende 1,5 uur naar een incubator van 37 °C voor gelation. Om de vochtigheid van de gel tijdens de incubatie van 37 °C te behouden, dek u de petrischaal af met het deksel en doet u een paar druppels water in de petrischaal.</li>
</ol>8. Spijsvertering
<ol><li>Verwijder na het leren het glas om de gel te scheiden en breng de gel over op een 6-putplaat. Verwerk ingebedde cellen met 2 ml digestiebuffer (tabel 1) 's nachts bij kamertemperatuur of 4 uur bij 37 °C. Gebruik ten minste 10 keer het overtollige volume van de digestiebuffer.</li>
	<li>Was gels met ten minste een 10-voudig overtollig volume water dan het uiteindelijke gelvolume. Herhaal de wasstap vier keer gedurende 20 tot 30 minuten. De gel breidt zich in elke dimensie ongeveer twee keer uit. OPMERKING: Gelmonsters kunnen maximaal 1 maand worden bewaard in een PBS-buffer bij 4 °C. Vervang verdampt water om uitdroging te voorkomen en bescherm het monster tegen licht tijdens opslag. Om degradatie van trifunctionele ankers te voorkomen, moeten monsters zo snel mogelijk na de spijsvertering en was worden gekleurd.</li>
</ol>9. Fluorescentiekleuring na de spijsvertering
<ol><li>Incubeer gels in 2 ml volume streptavidin (STV) / digoxigenine (DIG) kleuringsbuffer met 2 tot 5 μM STV-kleurstof en / of anti-DIG-kleurstof gedurende 24 uur bij kamertemperatuur. Bewaar de monsters in het donker.</li>
</ol>10. Uitbreiding
<ol><li>Was en zet de gel vier keer uit met overmatig water (2-3 ml) gedurende 30 minuten tot 1 uur per keer.</li>
	<li>Voor eenvoudigere visualisatie van cellen onder fluorescente microscopie, kleur cellen met DAPI tijdens de derde van de vijf wasbeurten. Verdunde DAPI-voorraadconcentratie (5 mg/ml, bewaard bij 4 °C) in 1:5.000 verdunningen in waswater. Incubeer de gel met een DAPI-wateroplossing (2 ml) gedurende 30 minuten tot 1 uur.</li>
	<li>Was twee keer extra met 3 ml water.</li>
	<li>Breid gels uit in elke platte schaal die groot genoeg is om de monsters te bevatten. De geëxpandeerde gels die op 0,4 cm2 gebiedsdekglas worden bereid, passen mooi in een 6-wellsplaat met glazen bodem. OPMERKING: Post-expansie-gekleurde monsters kunnen maximaal 4 maanden worden bewaard in een PBS-buffer bij 4 ° C. Voeg voldoende water toe om uitdroging te voorkomen en het monster te beschermen tegen fotobleaching. Herhaal de uitbreidings- en DAPI-kleuringsstap voordat u de afbeelding in beeld brengt. Om elk risico op afbraak van fluoroforen te voorkomen, moeten monsters zo snel mogelijk in beeld worden gebracht.</li>
</ol>11. Beeldvorming
<ol><li>Bedek de 6-well glazen bodembeeldvormingskamer met 0,01% poly-L-lysine (elk 3 ml) om de gelmonsters te immobiliseren.</li>
	<li>Breng gelmonsters over naar de gecoate beeldkamer.</li>
	<li>Breng de monsters in beeld met de gewenste fluorescentiescopen.</li>
</ol>

<ol><li>Shi, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-retention+expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Label-retention expansion microscopy.</a> The Journal of Cell Biology. 220 (9), 202105067(2021).</li>
<li>Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Expansion microscopy.</a> Science. 347 (6221), 543-548 (2015).</li>
<li>Tillberg, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-retention+expansion+microscopy+of+cells+and+tissues+labeled+using+standard+fluorescent+proteins+and+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies.</a> Nature Biotechnology. 34 (9), 987-992 (2016).</li>
<li>Truckenbrodt, S., Sommer, C., Rizzoli, S. O., Danzl, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+optimization+in+X10+expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">A practical guide to optimization in X10 expansion microscopy.</a> Nature Protocols. 14 (3), 832-863 (2019).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+expansion+microscopy+with+structured+illumination+microscopy+for+analyzing+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Combined expansion microscopy with structured illumination microscopy for analyzing protein complexes.</a> Nature Protocols. 13 (8), 1869-1895 (2018).</li>
<li>Chozinski, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+microscopy+with+conventional+antibodies+and+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Expansion microscopy with conventional antibodies and fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 13 (6), 485-488 (2016).</li>
<li>Ku, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+and+scalable+super+resolution+imaging+of+three-dimensional+protein+localization+in+size+adjustable+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Multiplexed and scalable super resolution imaging of three-dimensional protein localization in size adjustable tissues.</a> Nature Biotechnology. 34 (9), 973-981 (2016).</li>
<li>Gautier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+engineered+protein+tag+for+multiprotein+labeling+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+%26+Biology%22%5BJournal%5D)">An engineered protein tag for multiprotein labeling in living cells.</a> Chemistry & Biology. 15 (2), 128-136 (2008).</li>
<li>Keppler, A., Pick, H., Arrivoli, C., Vogel, H., Johnsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labeling+of+fusion+proteins+with+synthetic+fluorophores+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Labeling of fusion proteins with synthetic fluorophores in live cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (27), 9955-9959 (2004).</li>
<li>Thevathasan, J. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+pores+as+versatile+reference+standards+for+quantitative+super+resolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Nuclear pores as versatile reference standards for quantitative super resolution microscopy.</a> Nature Methods. 16 (10), 1045-1053 (2019).</li>
<li>Truckenbrodt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X10+expansion+microscopy+enables+25-nm+resolution+on+conventional+microscopes%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">X10 expansion microscopy enables 25-nm resolution on conventional microscopes.</a> EMBO Reports. 19 (19), 45836(2018).</li>
<li>Damstra, H. G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+cellular+and+tissue+ultrastructure+using+Ten-fold+Robust+Expansion+Microscopy+%28TREx%29%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Visualizing cellular and tissue ultrastructure using Ten-fold Robust Expansion Microscopy (TREx).</a> eLife. 11, 73775(2021).</li>
<li>M'Saad, O., Bewersdorf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+microscopy+of+proteins+in+their+ultrastructural+context%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Light microscopy of proteins in their ultrastructural context.</a> Nature Communications. 11 (1), 3850(2020).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen belangenconflicten.

De belangrijkste innovatie van LR-ExM is het gebruik van trifunctionele ankers om de doeleiwitten effectief te labelen en de beeldkwaliteit te verbeteren. Deze methode wordt beperkt door trifunctionele ankers, die niet zo gemakkelijk beschikbaar zijn voor onderzoekers. Trifunctionele ankers kunnen echter op verzoek worden gedeeld met andere onderzoekers en vergelijkbare producten zoals ExM-sondes van Chrometa zijn nu ook in de handel verkrijgbaar.
In dit protocol is 1 uur incubatie bij kamerte...

Expansiemicroscopie (ExM) wordt door onderzoekers gebruikt sinds het voor het eerst werd geïntroduceerd als een handige benadering om superresolutiebeeldvorming te bereiken met conventionele microscopen, zoals epifluorescentie en confocale microscopen 1,2,3,4,5,6,7 . Met behulp van ExM is het mogelijk om ~ 70 nm laterale resolutie te bereiken, zelfs met gewone confocale microscopen. Wanneer ExM wordt gecombineerd met beeldvorming met superresolutie, wordt de resolutie verder verbeterd. Men kan bijvoorbeeld ongeveer 30 nm resolutie bereiken met gestructureerde verlichtingsmicroscopie (SIM) en ongeveer 4 nm resolutie met stochastische optische reconstructiemicroscopie (STORM)1,5.
Een lage etiketteringsefficiëntie is echter een kritiek probleem bij standaard ExM-methoden. Fluorescentieverlies kan variëren op basis van het type fluorescerende groepen en de verteringstijd. Gemiddeld is echter gemeld dat meer dan 50% van de fluoroforen verloren gaat na de polymerisatie en de eiwitverteringsstappen van ExM, wat schadelijk is voor de beeldvormingskwaliteit 3,4.
Zo is labelretentie-expansiemicroscopie (LR-ExM) ontwikkeld, die efficiënt labels kan behouden en signaalverlies kan verminderen1. De belangrijkste innovatie van LR-ExM is het gebruik van een set trifunctionele ankers in plaats van alleen fluorescerende kleurstoffen te gebruiken - zoals in de standaard ExM-procedure - voor het kleuren van eiwitten van belang. Deze trifunctionele linkers bestaan uit drie delen: (1) de connector (bijv. N-hydroxysuccinimide (NHS)) om verbinding te maken met het antilichaam, (2) het anker (bijv. Methacrylamide (MA)) om eiwitten aan het polymeer te verankeren, en (3) de verslaggever (bijv. Biotine of digoxigenine (DIG)) om te conjugeren aan een organische kleurstof. De trifunctionele ankers overleven de polymerisatie- en eiwitverteringsstappen en voorkomen daarom fluorofoorverlies.
Bovendien heeft deze methode een groot potentieel omdat het compatibel is met zelfetiketterende enzymatische tags zoals SNAP of CLIP. Enzymatische tagbenaderingen hebben enkele voordelen ten opzichte van de immunostaining-benadering met betrekking tot hoge specificiteit en etiketteringsefficiëntie 8,9,10.
In dit manuscript wordt een gedetailleerde procedure van LR-ExM gedemonstreerd. LR-ExM is een zeer effectieve en flexibele methode om een hoge ruimtelijke resolutie te bereiken met verbeterde etiketteringsefficiëntie.

<table><tbody><tr><td>Acrylamide&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>A9099&nbsp;</td><td>ExM Gel</td></tr><tr><td>AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>H+L, 711&ndash;005-152</td><td>Antibody</td></tr><tr><td>AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>H+L, 712&ndash;005-153</td><td>Antibody</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488-Streptavidin</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>016-540-084</td><td>Fluorescent probes&nbsp;</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Streptavidin</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>016-580-084</td><td>Fluorescent probes&nbsp;</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Streptavidin</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>016-600-084</td><td>Fluorescent probes&nbsp;</td></tr><tr><td>Ammonium Persulfate&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>A3678&nbsp;</td><td>ExM Gel</td></tr><tr><td>anti-H3K4me3</td><td>Abcam</td><td>ab8580</td><td>Antibody</td></tr><tr><td>anti-H3K9me3</td><td>Abcam</td><td>ab176916</td><td>Antibody</td></tr><tr><td>DAPI dilacetate</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>D3571</td><td>Fluorescent probes&nbsp;</td></tr><tr><td>DyLight 488 Labeled Anti-Digoxigenin/Digoxin (DIG)</td><td>Vector Laboratories</td><td>DI-7488</td><td>Fluorescent probes&nbsp;</td></tr><tr><td>DyLight 594 Labeled Anti-Digoxigenin/Digoxin (DIG)</td><td>Vector Laboratories</td><td>DI-7594</td><td>Fluorescent probes&nbsp;</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>EMD Millipore Corp.</td><td>324626-25GM</td><td>Fixatie buffer</td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>EDTA</td><td>Digestie buffer</td></tr><tr><td>Glutaraldehyde 10% EM Grade</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>50-262-13</td><td>Anchoring</td></tr><tr><td>Grace Bio-Labs CultureWell removable chambered coverglass</td><td>Grace Bio-Labs&nbsp;</td><td>GBL112358-8EA</td><td>Cel cultuur kamer</td></tr><tr><td>Grace Bio-Labs CultureWell removal tool</td><td>Grace Bio-Labs&nbsp;</td><td>GBL103259</td><td>Verwijder gereedschap</td></tr><tr><td>Guanidine HCl&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>G3272&nbsp;</td><td>Digestie buffer</td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>Sigma</td><td>M8266-1KG</td><td>Fixatie buffer</td></tr><tr><td>McCoy's 5a</td><td>ATCC</td><td>30&ndash;2007</td><td>Cel cultuur medium</td></tr><tr><td>Methacrylic acid N-hydroxysuccinimide ester,98%&nbsp; (MA-NHS)</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>730300-1G</td><td>Anchoring</td></tr><tr><td>monoclonal mouse anti-Nup153 antibody</td><td>Abcam</td><td>ab24700</td><td>Antibody</td></tr><tr><td>N,N&prime;Methylenebisacrylamide&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>M7279&nbsp;</td><td>ExM Gel</td></tr><tr><td>N,N,N&prime;,N&prime; Tetramethylethylenediamine&nbsp;(TEMED)</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>T7024&nbsp;</td><td>ExM Gel</td></tr><tr><td>16% Paraformaldehyde Aqueous Solutions</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>50-980-487</td><td>Fixatie buffer</td></tr><tr><td>PIPES</td><td>Sigma</td><td>P6757-25G</td><td>Fixatie buffer</td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine</td><td>Sigma</td><td>P8920-100ML</td><td>Kamer coating</td></tr><tr><td>Proteinase K&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4850-5ML</td><td>Digestie buffer</td></tr><tr><td>Rabbit anti-clathrin heavy-chain antibody</td><td>Abcam</td><td>ab21679</td><td>Antibody</td></tr><tr><td>rat anti&ndash;&alpha;-tubulin antibody,tyrosinated, clone YL1/2</td><td>Millipore Sigma</td><td>MAB1864-I</td><td>Antibody</td></tr><tr><td>Sodium Acrylate&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>408220</td><td>ExM Gel</td></tr><tr><td>Streptavidin / Biotin blocking kit</td><td>Vector Laboratories</td><td>SP-2002</td><td>Blocking buffer</td></tr><tr><td>Tris-HCl&nbsp;</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>AM9855&nbsp;</td><td>Digestie buffer</td></tr><tr><td>U2OS</td><td>ATCC</td><td>HTB-96</td><td>Cel lijn</td></tr><tr><td>6 well glass bottom plates</td><td>Cellvis</td><td>P06-1.5H-N</td><td>Beeldplateau</td></tr></tbody></table>

label-retention expansion microscopy (lr-exm) maakt beeldvorming met superresolutie en zeer efficiënte etikettering mogelijk

Label-Retention Expansion Microscopy (LR-ExM) Enables Super-Resolution Imaging and High-Efficiency Labeling

Expansiemicroscopie (ExM) is een monstervoorbereidingstechniek die kan worden gecombineerd met de meeste lichtmicroscopiemethoden om de resolutie te verhogen. Na het inbedden van cellen of weefsels in opzwellende hydrogel, kunnen monsters fysiek drie- tot zestienvoudig (lineaire dimensie) worden uitgebreid in vergelijking met de oorspronkelijke grootte. Daarom wordt de effectieve resolutie van elke microscoop verhoogd door de expansiefactor. Een belangrijke beperking van de eerder geïntroduceerde ExM is verminderde fluorescentie na polymerisatie en de verteringsprocedure. Om deze beperking te overwinnen, is labelretentie-uitbreidingsmicroscopie (LR-ExM) ontwikkeld, die signaalverlies voorkomt en de etiketteringsefficiëntie aanzienlijk verbetert met behulp van een reeks nieuwe trifunctionele ankers. Deze techniek maakt het mogelijk om een hogere resolutie te bereiken bij het onderzoeken van cellulaire of subcellulaire structuren op nanometrische schaal met minimaal fluorescerend signaalverlies. LR-ExM kan niet alleen worden gebruikt voor immunofluorescentie-etikettering, maar ook met zelfetikettering van eiwittags, zoals SNAP- en CLIP-tags, waardoor een hogere etiketteringsefficiëntie wordt bereikt. Dit werk presenteert de procedure en probleemoplossing voor deze op immunostaining gebaseerde benadering, evenals een bespreking van zelflabelende taggingbenaderingen van LR-ExM als alternatief.

Clathrin-coated pits (CCP's) zijn immunostained met behulp van trifunctionele ankers (figuur 1B) en LR-ExM wordt uitgevoerd zoals beschreven in figuur 1A. LR-ExM (figuur 2C,E) vertoont een veel hogere fluorescentie-intensiteit in vergelijking met de eiwitretentie-expansiemicroscopie (proExM, figuur 2A) of biotine-ExM (figuur 2B); het signaal voor LR-ExM was...

Een protocol van labelretentie expansie microscopie (LR-ExM) wordt gedemonstreerd. LR-ExM maakt gebruik van een nieuwe set trifunctionele ankers, die een betere etiketteringsefficiëntie biedt in vergelijking met eerder geïntroduceerde uitbreidingsmicroscopieën.

Label-Retention Expansion Microscopy (LR-ExM) maakt beeldvorming met superresolutie en zeer efficiënte etikettering mogelijk

Expansion microscopy (ExM) is a sample preparation technique that can be combined with most light microscopy methods to increase the resolution. After ...

Een belangrijke beperking van expansiemicroscopie is dat fluorescentie vertraagt na polymerisatie en spijsvertering. Labelretentie expansiemicroscopie, we noemen het LR-ExM, maakt gebruik van tri functionele ankers, die polymerisatie en vertering zijn. Nadat we tri-functieanker hebben gebruikt, introduceren we fluorescentie na expansiestap.We behouden dus een goede signaal-ruisverhouding terwijl we een hoge resolutie hebben. Labelretentie-uitbreidingsmicroscopie kan worden gecombineerd met andere eerder geïntroduceerde expansiemicroscopieën en ook fluorescerende microscopieën. Het is zeer robuust in veelzijdige methode.En voor beeldvorming met een hoge regulatie is het echt belangrijk om een verbeterd signaal te hebben. Om te beginnen kweekcellen op een 16 goed verwijderbare kamerglas met compleet medium bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Zodra het aantal cellen ongeveer 40.000 bereikt, fixeert u cellen met 100 microliter 3,2% PFA in PEM-buffer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.Permeabiliseer vervolgens cellen met de 100 microliter permeablisatiebuffer bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten. Incubeer cellen met de streptavidinoplossing verdund in een celblokkerende buffer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur en spoel vervolgens kort met 200 microliter celblokkerende buffer. Incubeer vervolgens cellen met 100 microliter biotineoplossing verdund in een celblokkerende buffer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.Daarna incubeer cellen met 100 microliter primaire antilichaamoplossing die rat anti-alfa tubuline anti-alfa tubuline antilichaam en konijn anti clathrin zware keten antilichaam gedurende ofwel 16 uur bij vier graden Celsius of een uur bij kamertemperatuur. Incubeer vervolgens cellen met 100 microliter secundaire antilichaamoplossing met tri functionele ankers, ezel anti konijn graaf MA en ezel anti rat biotine MA gedurende een uur bij kamertemperatuur. Incubeer cellen met 100 microliter 0,25% glutaaraldehyde gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur om de eiwitten op de hydrogel te verankeren.Verwijder de bovenste structuur van de 16 putplaat met het scheermesje of een ander verwijdergereedschap naar keuze en houd het onderste dekselglas. Leg het afdekglas in een petrischaaltje en leg ze op ijs. Voeg 45 microliter een monomeeroplossing toe aan elke put om cellen te conditioneren.Broed vijf minuten op ijs. Om de gelation-oplossing te maken, bereidt u een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter voor. Meng monomeer, dubbel gedestilleerd water en 10% T med.Voeg het ammonium per sulfaat nog niet toe. Houd ondertussen de buis van de gelation-oplossing op het ijs. Voeg 10% ammoniumpersulfaat toe aan de gelatatieoplossing.Pipetteer onmiddellijk 40 microliter gelation-oplossing op elke put terwijl u een buis met gelation-oplossing op ijs bewaart. Leg de putplaat nog drie minuten op ijs. Om de vochtigheid van de gel tijdens de incubatie van 37 graden Celsius te behouden, bedekt u de petrischaal met het deksel en doet u een paar druppels water in de petrischaal.Terwijl u het monster beschermt tegen licht, verplaatst u het afdekglas en de petrischaal van 10 centimeter naar een incubator van 37 graden Celsius gedurende 1,5 uur voor gelation. Snijd na het bakken het afdekglas om elke gel te scheiden. Breng gels over op zes putplaten.Voeg twee milliliter verteringsbuffer toe aan elk putje. Laat de monsters een nacht bij kamertemperatuur of vier uur bij 37 graden Celsius. Was vervolgens gels met ten minste 10 keer overtollig volume water dan het uiteindelijke gelvolume, terwijl u de wasstap vier keer herhaalt gedurende 20 tot 30 minuten per keer, en de gel zet uit met ongeveer vier vouwen in elke dimensie.Incubeer gels in twee milliliter volume streptavidin digoxigenine kleuringsbuffer met twee tot vijf micromolar streptavidin kleurstof en / of anti-digoxigenine kleurstof gedurende 24 uur bij kamertemperatuur terwijl de monsters in het donker worden gehouden. Was en breid de gel vervolgens twee tot vier keer uit met overmatig water. Elke wasbeurt duurt ongeveer 30 minuten tot een uur.Voor eenvoudigere visualisatie van cellen onder fluorescerende microscopie, kleur cellen met DAPI tijdens de derde wasbeurt. Verdun DAPI-voorraad in één tot 5.000 waanideeën in waswater. Incubeer de gel met een DAPI-oplossing gedurende 30 minuten tot een uur.Was vervolgens nog twee keer met drie milliliter water. Bedek de zes put glazen bodembeeldvormingskamer met drie milliliter van 0,01% polylysine om de gelmonsters te immobiliseren. Breng vervolgens gelmonsters over naar de gecodeerde beeldkamer en beeld de monsters af met de gewenste fluorescentiescopen.Labelretentie-expansiemicroscopie toont verbeterde fluorescentielabeling in vergelijking met eiwitretentie-expansiemicroscopie of biotine-expansiemicroscopiemonsters. Labelretentie-expansiemicroscopie toont ongeveer zes keer hoger fluorescentiesignaal in vergelijking met eiwitretentie-expansiemicroscopie. LR-ExM kan effectief kleine structuren vastleggen, zoals met clathrin gecoate putten met subdefractionlimietresolutie.Microtubuli en clathrin gecoate putten waren co-immunovlekken met behulp van functionele ankers, NHS MA-graaf en NHS MA-biotine. Evenzo werden clathrin gecoate putten en mitochondriën gelabeld met behulp van een enzymatische eiwittagbenadering met tri functionele ankers, zoals BG MA-biotine en BC MA-graaf. Bovendien worden immunokleuring gebaseerde benadering en de enzymatische eiwittagbenadering gecombineerd om de structuur van lamin A / C en nucleopore-complex te laten zien.Labelretentie-expansiemicroscopie werd uitgevoerd op het hersenweefsel van de muis door co-immunokleuring van de presynaptische marker, Fagot en postsynaptische marker, Homerus 1. De twee labels waren duidelijk en goed gescheiden, wat een hoge resolutie en etiketteringsefficiëntie ondersteunt. Arbeidsretentie-uitbreidingsmicroscopie is een veelzijdige en robuuste methode, die kan worden gecombineerd met andere eerder geïntroduceerde uitbreidingsmicroscopieën.Voor beeldvorming met hoge resolutie is het belangrijk om een goede etiketteringsefficiëntie te bereiken om de moleculaire schaalstructuur beter vast te leggen. Arbeidsretentie-uitbreidingsmicroscopie is een effectieve en robuuste methode om het signaal te verbeteren.

label-retention-expansion-microscopy-lr-exm-enables-super-resolution

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Een eenvoudige en nieuwe techniek voor het registreren van afferent ontlading als gevolg van mechanische stimulatie van lancetvormige uiteinden van palissade-uiteinden die muisorenhuid-haarzakjes innerveren, wordt gepresenteerd.

Gecombineerde Registratie van mechanisch gestimuleerde Afferente Output en Nerve Terminal Etikettering Mouse haarfollikel Lanceolate Endings

Dit manuscript beschrijft een methode voor het labelen van individuele boodschapper-RNA (mRNA) afschriften met fluorescently-geëtiketteerden DNA sondes, voor gebruik in single-molecuul fluorescentie in situ hybridisatie (smFISH) proeven in E. coli. smFISH is een visualisatie methode waarmee de simultane detectie-, lokalisatie- en kwantificering van afzonderlijke mRNA moleculen in vaste afzonderlijke cellen.

Methode voor het labelen van afschriften in individuele Escherichia coli cellen voor Single-molecuul fluorescentie In Situ hybridisatie experimenten

Hier presenteren we een praktische gids voor het bouwen van een geïntegreerde microscopie-systeem, dat wordt samengevoegd conventionele epi-belichting fluorescerende imaging, single-molecuul detectie gebaseerde Super resolutie beeldvorming en Multi-Color single-molecuul detectie, met inbegrip van single-molecuul fluorescentie resonantie energieoverdracht imaging, in één set-up op een kostenefficiënte manier.

Uitvoeren van meerdere Imaging modi met één fluorescentie Microscoop

Superresolutiemicroscopie kan een gedetailleerd inzicht geven in de organisatie van componenten binnen het synaptonemale complex bij meiose. Hier demonstreren we een protocol om individuele eiwitten van het Caenorhabditis elegans synaptonemale complex op te lossen.

Superresolutiemicroscopie van het synaptonemale complex binnen de Caenorhabditis elegans kiembaan

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor de implementatie van expansiemicroscopie in vroege Drosophila-embryo's om beeldvorming met superresolutie te bereiken met behulp van een conventionele confocale microscoop met laserscanning.

Expansiemicroscopie gebruiken om Drosophila-embryo's in het geheel fysiek te vergroten voor beeldvorming met superresolutie

Hier wordt een nieuwe versie van expansiemicroscopie (ExM) gepresenteerd, Magnify, die is aangepast voor maximaal 11-voudige expansie, met behoud van een uitgebreide reeks biomolecuulklassen en compatibel is met een breed scala aan weefseltypen. Het maakt de ondervraging van de nanoschaalconfiguratie van biomoleculen mogelijk met behulp van conventionele diffractie-beperkte microscopen.

Universele moleculaire retentie met 11-voudige expansiemicroscopie

Hier stellen we een eenvoudig protocol voor dat metabole oligosacharide-engineering, klikchemie en expansiemicroscopie combineert en dat bioimaging van intracellulaire gesialyleerde N-glycoproteïnen met verbeterde resolutie mogelijk maakt met behulp van routinematige microscopieapparatuur.

Visualisatie van intracellulaire sialylering met klikchemie en expansiemicroscopie

Hier presenteren we een gedetailleerd protocol dat cryofixatie- en expansiemicroscopiemethoden (Cryo-ExM) combineert, waardoor hogeresolutiebeeldvorming met structureel behoud mogelijk is, aangepast aan diverse biologische monsters. Biologische monsters worden ingevroren, ingebed in een zwellbaar polymeer, gedenatureerd, uitgezet en immuno-labeld, waardoor superresolutiebeeldvorming met standaard lichtmicroscopen mogelijk is.

Expansiemicroscopie: Fluorescentiebeeldvorming met hoge resolutie met een conventionele microscoop

Dit protocol beschrijft de procedure voor het uitvoeren van diepe, whole-cell single-molecule localization microscopy (SMLM) met behulp van een draaiende schijf confocale microscoop met optische fotonherplaatsing, waardoor DNA-PAINT-beeldvorming mogelijk is zonder de noodzaak van aangepaste optica of complexe verlichting.

Superresolutiebeeldvorming van hele cellen via DNA-PAINT op een draaiende schijf confocaal met optische fotonhertoewijzing

We beschrijven een super-resolutie beeldvorming methode om de structurele organisatie van de bacteriële FtsZ-ring, een essentieel inrichting voor celdeling sonde. Deze methode is gebaseerd op kwantitatieve analyses van fotogeactiveerde lokalisatie microscopie (PALM) beelden en kan worden toegepast op andere bacteriële cytoskeleteiwitten.

Super-resolution Imaging van de bacteriële Division Machinery

Leer label-retentie-expansiemicroscopie (LR-ExM) voor superresolutiebeeldvorming van celstructuren met trifunctionele ankers. Deze methode levert zes keer hogere fluorescentie dan traditionele technieken.

Label-Retention Expansion Microscopy (LR-ExM) maakt beeldvorming met superresolutie en zeer efficiënte etikettering mogelijk

Meer video's verkennen