Name: Costruzione di peptidi ciclici che penetrano nelle cellule per una maggiore penetrazione delle barriere biologiche (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Scopri la sintesi di peptidi ciclici che penetrano nelle cellule per migliorare la permeabilità attraverso le barriere biologiche. Questo metodo utilizza cross-link aromatici per aumentare l'idrofobicità e facilitare il rilascio di farmaci nelle cellule tumorali senza catalizzatori metallici.

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Questo lavoro è supportato dalla Natural Science Foundation of China (21708031), dalla China Postdoctoral Science Foundation (BX20180264, 2018M643519) e dai fondi di ricerca fondamentale per le università centrali (2682021ZTPY075).

1. Preparazione dell'attrezzatura
NOTA: Eseguire tutte le procedure in una cappa aspirante funzionante con idonei dispositivi di protezione individuale.
<ol><li>Assemblare l'apparato manuale di sintesi dei peptidi nella cappa aspirante (Figura 1). Posizionare i rubinetti di arresto a tre vie (vedi tabella dei materiali) sul collettore a vuoto (vedere tabella dei materiali) e collegarli all'azoto (N2). Assicurati di tappare le prese inutilizzate.</li>
	<li>Fissare una colonna in polipropilene da 10 mL (vedere la tabella dei materiali) sui rubinetti di arresto a tre vie. Scaricare la miscela di reazione o i solventi dalla colonna di polipropilene utilizzando una lampadina per pipette di gomma o un vuoto tramite una trappola per rifiuti.</li>
</ol>2. Sintesi del peptide lineare R8 marcato con FITC (FITC-R8) e del peptide R8 graffato marcato con fitc (FITC-sR8-4)
NOTA: I peptidi sono stati sintetizzati secondo un protocollo standard di sintesi peptidica in fase solida (SPPS) basato su Fmoc25. La resina 4-(2',4'-Dimethoxypheyl-Fmoc-aminomethyl)-phenoxyacetamido-norleucyl-MBHA (resina MBHA ammidica da pista, vedi Tabella dei materiali) è stata utilizzata durante lo studio.
ATTENZIONE: N, N-dimetilformammide (DMF), N, N-diisopropiletilamina (DIPEA), morfolina e diclorometano (DCM) sono tutti incolori e sono dannosi se inalati o assorbiti attraverso la pelle. L'etere è estremamente infiammabile. L'1,2-Etanditiolo (EDT) è una sostanza particolarmente odorosa. L'acido trifluoroacetico (TFA) è altamente corrosivo e la sua acidità è 105 volte quella dell'acido acetico. Di conseguenza, tutti i reagenti e le sostanze chimiche dovrebbero essere trattati utilizzando dispositivi di protezione in una cappa aspirante.
<ol><li>Preparare la resina per la sintesi peptidica.<ol><li>Calcola la massa di resina necessaria per la sintesi:Massa di resina (mg) = scala (mmol) / capacità di carico della resina (mmol / g) × 1.000 (mg / g) NOTA: Ad esempio, la massa di resina MBHA ammidica (0,572 mmol / g) per 0,2 mmol = 0,2 mmol / 0,572 mmol / g × 1.000 mg / g = 350 mg.</li>
		<li>Aggiungere 4-5 ml di DMF alla quantità necessaria di resina e trasferire nella colonna di polipropilene da 10 mL (fase 1.2) con un delicato gorgogliamento di N2 per 30 minuti per gonfiare adeguatamente la resina, quindi drenare il DMF.</li>
		<li>Aggiungere 4-5 ml di morfolina/DMF (v/v) al 50% alla resina, bollire delicatamente N2 per 30 minuti 2x per rimuovere il gruppo Fmoc N-terminale, quindi scolare la miscela. Successivamente, lavare accuratamente la resina 3 volte aggiungendo 4-5 ml di DMF alla colonna e gorgogliando con N2 per almeno 1 minuto ogni volta. Continuare a lavare la resina con DCM (3x) e DMF (3x) allo stesso modo.</li>
	</ol></li>
	<li>Eseguire l'accoppiamento aminoacidico protetto da Fmoc come descritto di seguito. NOTA: L'accoppiamento dell'arginina in una sintesi manuale su scala 0,2 mmol è descritto qui come esempio.<ol><li>Sciogliere Fmoc-Arg (Pbf)-OH (5 equiv., 648,8 mg) e 2-(7-azobenzotriazolo)-N, N, N', N'-tetrametiluronio esafluorofosfato (HATU, 4,9 equiv., 372,6 mg) in 5 mL di DMF in una provetta da centrifuga.</li>
		<li>Aggiungere DIPEA (10 equiv., 348,4 μL) per attivare la reazione di accoppiamento, quindi trasferire la miscela di reazione alla colonna di polipropilene da 10 mL con resina (preparata al punto 2.1.3). Quindi, agitare delicatamente la miscela con N 2 gorgogliando per1-2 ore.</li>
		<li>Ripetere una volta la reazione di accoppiamento (punto 2.2.1 e passaggio 2.2.2).</li>
		<li>Dopo il completamento dell'accoppiamento, scaricare la miscela di reazione e lavare la resina in sequenza con DMF, DCM e DMF 3 volte ciascuno per almeno 1 minuto ogni volta.</li>
		<li>Eseguire l'accoppiamento di ciascun amminoacido in fasi ordinate: aggiungere 4-5 ml di morfolina/DMF al 50% (v/v) alla resina, bollire delicatamente con N 2 per 30 minuti 2x per rimuovere il gruppo N α-Fmoc, quindi lavare la resina (come mostrato al punto 2.2.4) e procedere all'accoppiamento dell'amminoacido successivo (come mostrato nei punti 2.2.1 e 2.2.2). Procedere con diversi cicli di questo passaggio per ottenere la sintesi del peptide desiderato. NOTA: questo processo può essere sospeso qui. Condensare la resina con metanolo e asciugare la resina con un flusso continuo di N2. Tappare la colonna di polipropilene e conservare la resina a 4 °C per alcuni giorni (o a -20 °C per una conservazione più lunga). Gonfiare la resina con 4-5 ml di DMF per 0,5-1 h prima di iniziare una nuova sintesi. Se si procede direttamente al passaggio successivo, non è necessario condensare la resina.</li>
	</ol></li>
	<li>Etichettare i peptidi con isotiocianato di fluoresceina (FITC) come descritto di seguito.<ol><li>Accoppiare la beta-alanina come distanziatore per l'etichettatura FITC utilizzando lo stesso processo utilizzato per l'accoppiamento degli aminoacidi nel passaggio 2.2.</li>
		<li>Eseguire la marcatura FITC dei peptidi sulla resina aggiungendo una miscela di FITC (5 equiv.), DIPEA (10 equiv.) e DMF alla colonna di polipropilene e reagendo al buio per 8 ore.</li>
	</ol></li>
	<li>Per la sintesi di FITC-sR8-4, eseguire la ciclizzazione del peptide lineare come descritto di seguito.<ol><li>Aggiungere una miscela di TFA/triisopropilsilano (TIS)/DCM (3/5/92, v/v/v) alla colonna di polipropilene per 2 minuti per rimuovere selettivamente il gruppo protettivo Cys (Trt), quindi scolare la miscela. Ripetere la procedura precedente fino a quando la soluzione giallastra diventa incolore per rimuovere completamente il gruppo protettivo trt.</li>
		<li>Successivamente, eseguire lavaggi sequenziali della resina con DMF e DCM almeno 3x. Successivamente, sciogliere 4,4'-bis(bromometil)bifenile (2 equiv.) in DMF con DIPEA (4 equiv.), aggiungerlo alla colonna e reagire per 4 ore.</li>
	</ol></li>
	<li>Fendere i peptidi come descritto: Dopo il completamento della sintesi peptidica, lavare la resina con 4-5 ml di metanolo due volte per 5 minuti ciascuno e asciugarla con un flusso continuo di N2. Trattare la resina con un efficace cocktail di scissione TFA/TIS/H 2 O (95/2.5/2.5, v/v/v), o TFA/TIS/EDT/H 2 O (92.5/2.5/2.5/2.5, v/v/v/v) per peptidi contenenti cisteine, utilizzando circa 1 mL di cocktail di scissione per 100 mg di resina. Trattare la resina legata al peptide per 2-3 ore per scindere il peptide e quindi rimuovere accuratamente il TFA con un flusso di N2.</li>
	<li>Per ottenere i peptidi grezzi, aggiungere 4-5 ml di etere etilico alla preparazione del peptide scisso per precipitare i peptidi grezzi e centrifugare a 10.000 × g per 4 minuti. Scartare con attenzione il surnatante e asciugare all'aria il peptide per 3 minuti in una cappa aspirante efficace.</li>
	<li>Analisi dei peptidi: sciogliere un peptide grezzo su piccola scala (scisso da circa 10 mg di resina legata al peptide) in 800 μL di acetonitrile (ACN)/H2O (1/1, v/v) e quindi analizzare utilizzando cromatografia liquida ad alte prestazioni a fase inversa (RP-HPLC) e cromatografia liquida-spettrometria di massa (LC-MS) (vedi Tabella dei materiali).</li>
	<li>Purificare i peptidi utilizzando RP-HPLC e LC-MS.<ol><li>Sciogliere 50 mg di prodotto peptidico grezzo in 4 mL di ACN/H2O (1/1, v/v) e iniettare la soluzione in un sistema RP-HPLC dotato di una colonna C18 (4,6 mm x 150 mm, dimensione dei pori: 120 Å, dimensione delle particelle: 4 μm; vedere Tabella dei materiali). Eluire il peptide utilizzando una fase mobile contenente lo 0,1% di TFA/H2O (v/v) e ACN, con un gradiente dal 10% al 90% di ACN nell'arco di 30 minuti. I peptidi convenzionali sono stati rilevati a 220 nm e i peptidi marcati con FITC a 494 nm.</li>
		<li>Raccogliere le frazioni corrispondenti al picco peptidico principale identificato dalla SM e quindi liofilizzare le frazioni peptidiche desiderate. Conservare il peptide purificato a -20 °C. NOTA: I m/z trovati del FITC-R8 purificato sono i seguenti: [M + 3 H]3+: 576.63; [M + 4 H] 4+: 432,72; [M + 5 H] 5+: 346,39; [M + 6 H] 6+: 288,85. I m/z trovati del FITC-sR8-4 purificato sono i seguenti: [M + 3 H]3+: 704.74; [M + 4 H] 4+: 528,77; [M + 5 H] 5+: 423,34; [M + 6 H] 6+: 352,91. Condizioni analitiche MS: strumento: ESI (polarizzazione della sonda: +4,5 kV; rivelatore: 1,2 kV); flusso gas nebulizzatore: 1,5 L/min; linea di desolvatazione curva (CDL): -20 V; Temperatura CDL: 250 °C; temperatura blocco: 400 °C; portata: 0,2 ml/min; fase mobile: 50% H2O/50% ACN.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Quantificazione dei peptidi marcati con FITC
<ol><li>Sciogliere una piccola quantità di peptide purificato in DMSO come soluzione madre (ad esempio, 40 μmol / ml).</li>
	<li>Misurare l'assorbanza a 494 nm (A 494) di 2 μL della soluzione madre in498 μL di soluzione salina tamponata fosfato 10 mM (1x PBS, pH 7,4) con una piastra di microtitolazione (vedere Tabella dei materiali) utilizzando un lettore di micropiastre multitecnologia (vedere Tabella dei materiali). Il fattore di diluizione è 500 μL/ 2 μL = 250 e la lunghezza del percorso della piastra di microtitolazione è di 0,5 mm.</li>
	<li>Calcolare la concentrazione della soluzione madre utilizzando la seguente formula: Concentrazione (mM) = A494 × fattore di diluizione / 0,05 (cm) / 77.000 (cm−1· M−1) × 1.000 (mM·M−1)</li>
	<li>Regolare una diluizione corretta in modo che il valore A494 misurato sia compreso tra 0,1 e 1,0. NOTA: le misurazioni devono essere ripetute più volte per garantire che la concentrazione misurata sia accurata. Il coefficiente di estinzione di 77.000 cm−1· M−1 deriva dal gruppo FITC.</li>
</ol>4. Stabilità dei peptidi nel siero fetale bovino (FBS)
<ol><li>Incubare il peptide ad una concentrazione di 100 μM con 250 μL di FBS/H2O (v/v) al 25% a 37 °C. Dopo l'incubazione per 0 ore, 1 ora, 2 ore e 4 ore, prendere 10 μL di aliquote e quindi aggiungere 150 μl di acido tricloroacetico al 12% sciolto in H2O/ACN (1/3, v/v) per precipitare le proteine sieriche.</li>
	<li>Centrifugare i campioni a 10.000 × g per 5 minuti e analizzare il surnatante utilizzando HPLC (come descritto nella fase 2.8) per determinare l'entità della degradazione del peptide.</li>
	<li>Calcolare il rapporto tra l'area di picco a 1 h, 2 h e 4 h e quella a 0 h per ottenere la frazione di peptide non degradato al momento corrispondente. Il risultato è la media di tre campioni paralleli.</li>
</ol>5. Assorbimento cellulare dei peptidi
<ol><li>Imaging microscopico a fluorescenza<ol><li>Posizionare un coprislip rotondo in una piastra a 12 pozzetti. Quindi, inoculare 1 x 105 cellule uniformemente su vetrini di copertura e coltura durante la notte con 2 ml di terreno. Rimuovere il mezzo e lavare le celle 3 volte con 1 mL di PBS. NOTA: In questo studio, le cellule HeLa e le cellule 4T1 sono state coltivate nel Modified Eagle Medium (DMEM, vedi Tabella dei materiali) di Dulbecco integrato con il 10% di FBS in un incubatore umidificato a 37 °C contenente il 5% di CO2.</li>
		<li>Incubare le cellule con 1 mL di peptidi marcati con FITC da 3 μM in DMEM privo di FBS per 1 ora a 37 °C. Successivamente, rimuovere il mezzo contenente peptidi e lavare le cellule 3 volte con 1 mL di PBS.</li>
		<li>Colorare le cellule con 1 mL di Hoechst 33258 per 15 min. Osservare l'internalizzazione di ciascun peptide utilizzando un microscopio a fluorescenza (vedi Tabella dei materiali) con la stessa intensità di fluorescenza e tempo di esposizione. NOTA: per la microscopia a fluorescenza sono state utilizzate le seguenti impostazioni. Obiettivo: Plan-Apochromat: 63 x/1.40 Oil DIC M27; Canale 1 per FITC: filtro di eccitazione: 450-490 nm, filtro di emissione: 500-550 nm, tempo di esposizione: 230 ms; Canale 2 per Hoechst 33258: filtro di eccitazione: 335-383 nm, filtro di emissione: 420-470 nm, tempo di esposizione: 27 ms.</li>
	</ol></li>
	<li>Analisi citometrica a flusso<ol><li>Inoculare uniformemente 5 x 10cellule HeLa 5 x 10 in piastre a 12 pozzetti e coltura in DMEM per 24 ore a 37 °C. Successivamente, rimuovere il mezzo e lavare le celle 3x con 1 mL di PBS.</li>
		<li>Incubare le cellule con 1 mL di peptidi marcati con FITC da 3 μM in DMEM privo di FBS per 1 ora a 37 °C. Rimuovere il mezzo contenente peptidi, dissociare le cellule con tripsina allo 0,25% (p/v) e 0,53 mM di EDTA in PBS per 5 minuti, quindi raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 306 × g per 4 minuti. Lavare il pellet cellulare con PBS.</li>
		<li>Incubare le cellule con 1 mL di blu tripano allo 0,05% (p/v) in PBS per 3 minuti per estinguere la fluorescenza legata alla superficie ed eseguire l'analisi quantitativa della fluorescenza intracellulare utilizzando un citometro a flusso (vedere Tabella dei materiali). NOTA: Impostazioni della citometria a flusso: eccitazione: 488 nm, emissione: 530 nm. Il blu di Trypan può anche estinguere la fluorescenza delle cellule morte e aiutare a distinguere le cellule vive / morte durante l'analisi dell'assorbimento del peptide.</li>
		<li>Trattare e dosare le cellule 4T1 utilizzando la citometria a flusso seguendo lo stesso protocollo descritto per le cellule HeLa. Raccogliere 5 x 105 celle per campione e impostare tre campioni paralleli per gruppo.</li>
	</ol></li>
</ol>6. Esplorazione della penetrazione cellula-cellula dei peptidi utilizzando modelli transwell
<ol><li>Inoculare 1 x 10 5 cellule HeLa in 2 mL di DMEM in una camera a 12 pozzetti con un inserto in piastra di coltura tissutale (vedi Tabella dei materiali) e incubare per 24 ore in un incubatore umidificato a 37 °C contenente il5% di CO2. Successivamente, rimuovere il mezzo e incubare le cellule nelle camere con 1 mL di 10 μM FITC-R8 o FITC-sR8-4 (purificato con HPLC) in DMEM privo di FBS per 1 ora.</li>
	<li>Rimuovere il mezzo contenente i peptidi e lavare le cellule 3 volte con 1 mL di PBS. Aggiungere 1 mL di DMEM fresco privo di FBS alle camere e quindi co-incubare le cellule HeLa nella camera con l'inserto della piastra di coltura tissutale con le cellule HeLa sui vetrini rotondi sul fondo per 2 ore.</li>
	<li>Fissare le cellule HeLa sui coprivetrini rotondi con glutaraldeide al 2,5% per 15 minuti e quindi colorare le cellule con DAPI per 15 minuti. Quindi, osservare le cellule HeLa sui vetrini sotto un microscopio a fluorescenza. Trattare e dosare le cellule 4T1 utilizzando lo stesso protocollo utilizzato per le cellule HeLa.</li>
</ol>

<ol><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-targeted+dual+site-selective+functionalized+poly%28%CE%B2-amino+esters%29+delivery+platform+for+nerve+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Brain-targeted dual site-selective functionalized poly(β-amino esters) delivery platform for nerve regeneration.</a> Nano Letters. 21 (7), 3007-3015 (2021).</li>
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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

La stabilizzazione chimica dei peptidi incorporando vincoli conformazionali si è dimostrata una strategia efficace per migliorare la stabilità e la permeabilità cellulare del peptide26. In questo protocollo, viene descritta una procedura passo-passo per la sintesi di CPP ciclici con legami incrociati aromatici e la valutazione della loro permeabilità attraverso barriere biologiche. Rispetto ai legami incrociati idrofili lattamici o triazolici22,27, l'incorporazione di legam...

Gli ultimi decenni hanno assistito a rapidi progressi nello sviluppo di peptidi che penetrano nelle cellule (CPP) per la somministrazione di farmaci. I CPP sono stati ampiamente utilizzati come trasportatori molecolari per il trattamento di una serie di malattie potenzialmente letali, tra cui disturbi neurologici1,2, malattie cardiache3, diabete4, dermatosi5 e cancro 6,7. Il cancro rimane un onere sanitario globale accompagnato da un alto tasso di morbilità e mortalità nonostante i diffusi sforzi di ricerca8. Un serio ostacolo al trattamento del cancro è l'accesso limitato delle terapie alle cellule tumorali più profonde a causa di barriere fisiologiche come la matrice extracellulare compatta (ECM), la vascolarizzazione tumorale anormale, le barriere multimembrana e l'alta pressione del liquido interstiziale (IFP)9. Pertanto, lo sviluppo di nuovi CPP con una capacità superiore di consegnare carichi attraverso le barriere biologiche è considerato una strategia essenziale per il trattamento del cancro10,11.
I CPP possono essere classificati in CPP cationici, anfipatici e idrofobici in termini di proprietà fisico-chimiche12. Tra questi, il peptide HIV-TAT caricato positivamente e la poliarginina sintetica sono di notevole importanza nella ricerca biomedica e sono stati ampiamente studiati per facilitare la somministrazione intracellulare di farmaci13. Tunnemann et al. hanno riferito che una lunghezza minima di otto arginine è essenziale per un'efficiente penetrazione cellulare dei peptidi sintetici di poliarginina, sulla base di uno studio di permeabilità cellulare condotto utilizzando i peptidi da R3 a R1214. Tuttavia, questi CPP hanno generalmente brevi emivite plasmatiche a causa della loro rapida idrolisi in vivo. Inoltre, si sa poco per quanto riguarda l'ottimizzazione della struttura chimica dei CPP per aumentare la loro capacità di trans-barriera in quanto è difficile penetrare più membrane cellulari15. Pertanto, lo sviluppo di nuovi trasportatori molecolari in grado di penetrare le barriere biologiche è fortemente desiderato per migliorare l'efficienza della somministrazione dei farmaci. Nel 2020, Komin et al.16 hanno scoperto un CPP chiamato peptide CL, che contiene un motivo elicoidale (RLLRLLR) e una coda di poliarginina (R7) per attraversare il monostrato epiteliale. Una serie di varianti peptidiche CL sono state anche sintetizzate alterando il modello elicoidale. Questa esplorazione potrebbe essere una guida significativa per lo sviluppo di nuovi CPP per la consegna di carichi attraverso barriere biologiche. Inoltre, Dietrich et al. hanno ottimizzato la permeabilità cellulare del peptide StAX, inibendo la via di segnalazione Wnt / β-catenina aumentando l'idrofobicità complessiva dei peptidi17.
La restrizione conformazionale di peptidi lineari non strutturati mediante ciclizzazione è un modo efficace per migliorare la loro stabilità proteolitica e permeabilità18,19,20. Il rinforzo strutturale aumenta la resistenza alla proteasi dei peptidi ciclici, rendendoli più stabili in vivo rispetto alle loro controparti lineari. Inoltre, la ciclizzazione dei peptidi può potenzialmente mascherare la spina dorsale del peptide polare promuovendo il legame idrogeno intramolecolare, aumentando così la permeabilità della membrana dei peptidi21. Negli ultimi due decenni, i metodi di ciclizzazione chemioselettiva sono diventati strategie efficaci per la costruzione di peptidi ciclici con architetture diverse, come tutto idrocarburi, lattamici, triazolo, m-xilene, perfluoroarile e altri legami incrociati22,23. La barriera biologica imposta dal sofisticato microambiente tumorale potrebbe ridurre la penetrazione dei farmaci nei tumori solidi24. Abbiamo precedentemente scoperto che i CPP ciclici mostravano una resistenza superiore alla digestione enzimatica rispetto alle loro controparti lineari20. Inoltre, l'idrofobicità complessiva dei peptidi è fondamentale per la loro maggiore permeabilità cellulare22. Sulla base degli studi discussi sopra, la combinazione di un modello caricato positivamente, elevata idrofobicità complessiva e maggiore stabilità della proteolisi può essere ipotizzata per aumentare la permeabilità dei CPP attraverso le barriere biologiche. In uno studio recente, abbiamo identificato due CPP ciclici con legami incrociati aromatici nelle posizioni i e i + 7 che mostrano una migliore permeabilità nelle cellule e nei tessuti tumorali rispetto alle loro controparti lineari15. Qui viene presentato un protocollo sintetico conciso per la sintesi di CPP ciclici marcati con fluorescenza e i passaggi chiave per studiarne la permeabilità.

<table><tbody><tr><td>1,2-etanedithiol</td><td>Aladdin</td><td>K1722093</td><td>puzza</td></tr><tr><td>2-(7-Azobenzotriazolo)-N,N,N',N'-tetrametiluronio esafluorofosfato (HATU)</td><td>HEOWNS</td><td>A-0443697</td><td></td></tr><tr><td>4,4'-bis(bromomethyl)biphenyl</td><td>TCI</td><td>B1921</td><td></td></tr><tr><td>4T1 cells</td><td>ATCC</td><td></td><td>Le cellule 4T1 sono state coltivate in terreno DMEM integrato con il 10% di FBS (Hyclone) in un 37 &deg; C umidificato contenente il 5% di CO2.</td></tr><tr><td>Acetonitrile&nbsp;</td><td>Adamas</td><td>1484971</td><td>tossicità</td></tr><tr><td>Diclorometano</td><td>Energia</td><td>W330229</td><td>pelle dannosa</td></tr><tr><td>Etere dietilico</td><td>Aldrich</td><td>673811</td><td>infiammabile</td></tr><tr><td>Dimetil solfossido</td><td>Beyotime</td><td>ST038</td><td>pelle dannosa</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>Spettrometro di massa a ionizzazione <td>Gibco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Electrospray</td><td>Waters</td><td>G2-S Tof</td><td></td></tr><tr><td>Acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)</td><td>BioFroxx</td><td>1340</td><td></td></tr><tr><td>Siero bovino fetale (FBS)</td><td>Citometro a flusso HyClone</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Beckman Coulter</td><td>CytoFLEX</td><td></td></tr><tr><td>Isotiocianato di fluoresceina ( FITC)</td><td>Microscopio</td><td>a fluorescenza per E0801812500</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Carl Zeiss</td><td>Axio Observer 7</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Arg(Pbf)-OH</td><td>HEOWNS</td><td>F-81070</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Cys(Trt)-OH</td><td>GL Biochem</td><td>GLS201115-35202</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-&beta; Cellule HeLa Ala-OH</td><td>Adamas</td><td>51341C</td><td></td></tr><tr>Le cellule<td>HeLa</td><td>ATCC</td><td></td><td>sono state coltivate in DMEM integrato con il 10% di FBS (Hyclone) in un 37 &deg; C umidificato contenente il 5% di CO2.</td></tr><tr><td>Cromatografia liquida ad alte prestazioni</td> Colonna per <td></td> cromatografia liquida ad alte <td>prestazioni Agilent</td> Agilent <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>Poroshell EC-C18 120, 4,6 &volte; 150 mm (dimensione dei pori 120 & Aring;, dimensione delle particelle 4 & mu; m)</td><td></td></tr><tr><td>Liofilizzatore</td><td>SP Scientific</td><td>Vir Tis</td><td></td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>Aldrich</td><td>9758</td><td>tossicità</td></tr><tr><td>Piastra per microtitolazione</td><td>Thermo &mu; piastra a goccia</td><td>N12391</td><td></td></tr><tr><td>Morfolina</td><td>HEOWNS</td><td>M99040</td><td>irritante</td></tr><tr><td>Lettore di micropiastre multitecnologico</td><td>Thermo</td><td>VARIOSKAN LUX</td><td></td></tr><tr><td>N,N-Diisopropiletilammina</td><td>HEOWNS</td><td>E-81416</td><td>irritante</td></tr><tr><td>N,N-Dimetil formammide</td><td>Energia</td><td>B020051</td><td>dannoso per la pelle</td></tr><tr><td>Colonna Poly-Prep</td><td>Bio-Rad</td><td>7321010</td><td>colonne per cromatografia in polipropilene</td></tr><tr><td>Rink Amide Resina MBHA (0,572 mmol/g)</td><td>GL Biochem</td><td>GLS180301-49101</td><td></td></tr><tr><td>Rubinetti a tre vie</td><td>Bio-Rad</td><td>7328107</td><td></td></tr><tr><td>Inserto per piastra per coltura tissutale</td><td>LABSELECT</td><td>14211</td><td></td></tr><tr><td>Acido trifluoroacetico</td><td>HEOWNS</td><td>T63278</td><td>corrosivo</td></tr><tr><td>Triisopropilsilano</td><td>HEOWNS</td><td>T-0284475</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>BioFroxx</td><td>1004</td><td></td></tr><tr><td>Collettore per vuoto</td><td>Promega</td><td>A7231</td><td></td></tr></tbody></table>

costruzione di peptidi ciclici che penetrano nelle cellule per una maggiore penetrazione delle barriere biologiche

Construction of Cyclic Cell-Penetrating Peptides for Enhanced Penetration of Biological Barriers

Il cancro è stato una grande sfida per la salute globale. Tuttavia, il complesso microambiente tumorale generalmente limita l'accesso delle terapie alle cellule tumorali più profonde, portando alla recidiva del tumore. Per superare la limitata penetrazione delle barriere biologiche, sono stati scoperti peptidi che penetrano le cellule (CPP) con un'eccellente capacità di traslocazione della membrana e sono emersi come utili trasportatori molecolari per trasportare vari carichi nelle cellule. Tuttavia, le CPP lineari convenzionali mostrano generalmente una stabilità proteolitica compromessa, che limita la loro permeabilità attraverso le barriere biologiche. Pertanto, lo sviluppo di nuovi trasportatori molecolari in grado di penetrare le barriere biologiche e mostrare una maggiore stabilità proteolitica è altamente desiderato per promuovere l'efficienza della somministrazione di farmaci nelle applicazioni biomediche. Abbiamo precedentemente sintetizzato un pannello di CPP ciclici corti con reticoli aromatici, che hanno mostrato una permeabilità superiore nelle cellule tumorali e nei tessuti rispetto alle loro controparti lineari. Qui, viene descritto un protocollo conciso per la sintesi del peptide poliarginina R8 ciclico marcato fluorescentmente e della sua controparte lineare, nonché i passaggi chiave per studiare la loro permeabilità cellulare.

In questo protocollo, è stata presentata una procedura sintetica per vincolare la poliarginina lineare R8 nella sua forma ciclica. L'SPPS è stato condotto manualmente utilizzando un semplice apparato (Figura 1). Il processo sintetico dettagliato di SPPS è mostrato nella Figura 2. In breve, la resina è stata sufficientemente gonfiata, seguita dalla deprotezione del gruppo protettivo N α-Fmoc. Quindi, l'amminoacido protetto da N α-Fmoc ...

Questo protocollo descrive la sintesi di peptidi ciclici penetranti nelle cellule con legami incrociati aromatici e la valutazione della loro permeabilità attraverso le barriere biologiche.

Costruzione di peptidi ciclici che penetrano nelle cellule per una maggiore penetrazione delle barriere biologiche

Cancer has been a grand challenge in global health. However, the complex tumor microenvironment generally limits the access of therapeutics to deeper ...

Un serio ostacolo per il trattamento del cancro è l'accesso limitato delle terapie alle cellule tumorali più profonde a causa delle barriere fisiologiche. Pertanto, lo sviluppo di nuovi trasportatori molecolari in grado di trattare le barriere biologiche è fortemente desiderato per migliorare l'efficienza della somministrazione dei farmaci. Lo scopo di questa procedura è sintetizzare i peptidi ciclici che penetrano nelle cellule per una maggiore penetrazione da cellula a cellula.Il vantaggio di questo metodo è che la ciclizzazione del peptide può essere facilmente raggiunta attraverso reazioni di sostituzione con cisteine e resina senza richiedere catalizzatori metallici. L'incorporazione di legami incrociati aromatici migliora l'idrofobicità complessiva dei peptidi rispetto ai legami incrociati idrofili o triazolici, migliorando così la loro permeabilità. Per iniziare, assemblare l'apparato manuale di sintesi peptidica nella cappa aspirante.Posizionare i rubinetti a tre vie sul collettore del vuoto e collegarli all'azoto. Assicurati di tappare le prese inutilizzate. Fissare una colonna di polipropilene da 10 millilitri sui rubinetti di arresto a tre vie e scaricare la miscela di reazione o i solventi dalla colonna di polipropilene utilizzando una lampadina per pipette di gomma o un vuoto tramite una trappola per rifiuti.Per preparare la resina per la sintesi peptidica, aggiungere da 4 a 5 millilitri di DMF alla quantità richiesta di resina e trasferirla alla colonna di polipropilene con un delicato gorgogliamento di azoto per 30 minuti per gonfiare adeguatamente la resina. Drenare il DMF e aggiungere da 4 a 5 millilitri di 50% morfolina/DMF alla resina. Raccogliere delicatamente l'azoto per 30 minuti per rimuovere il gruppo Fmoc N-terminale, quindi scolare la miscela.Lavare accuratamente la resina tre volte aggiungendo da 4 a 5 millilitri di DMF alla colonna e gorgogliando con azoto per almeno 1 minuto ogni volta. Allo stesso modo, lavare la resina con diclorometano tre volte e DMF tre volte. Quindi, sciogliere 648,8 milligrammi di Fmoc e arginina protetta da PBF e 372,6 milligrammi di HATU in 5 millilitri di DMF in una provetta da centrifuga.Aggiungere 348,4 microlitri di DIPEA per attivare la reazione di accoppiamento e trasferire la miscela di reazione alla colonna di polipropilene con resina. Agitare delicatamente la miscela con gorgogliamento di azoto per 1 o 2 ore, quindi ripetere la reazione di accoppiamento una volta. Scolare la miscela di reazione e lavare la resina in sequenza con DMF, diclorometano e di nuovo DMF tre volte ciascuna per almeno 1 minuto ogni volta.Rimuovere il gruppo protettivo Fmoc e lavare la resina seguendo la procedura illustrata in precedenza prima di procedere all'accoppiamento dell'amminoacido successivo. Successivamente, accoppiare la beta-alanina come distanziatore per l'etichettatura FITC utilizzando lo stesso processo mostrato per l'accoppiamento degli aminoacidi, quindi aggiungere una miscela di FITC, DIPEA e DMF alla colonna di polipropilene al buio per eseguire l'etichettatura FITC dei peptidi sulla resina. La reazione richiederebbe quasi 8 ore.Per eseguire la ciclizzazione del peptide lineare, aggiungere una miscela di acido trifluoroacetico, triisopropilsilano e diclorometano alla colonna di polipropilene per 2 minuti per rimuovere selettivamente il gruppo di protezione del tritile della cisteina. Scolare la miscela e ripetere la procedura fino a quando la soluzione giallastra diventa incolore per rimuovere completamente il gruppo di protezione del tritil. Eseguire lavaggi sequenziali della resina con DMF e diclorometano almeno tre volte e sciogliere 4, 4'bis-bromometil-bifenile in DMF con DIPEA.Aggiungi la soluzione alla colonna e reagisci per 4 ore. Lavare la resina con 4-5 millilitri di metanolo due volte per cinque minuti ciascuno e asciugarla con un flusso continuo di azoto. Per i peptidi contenenti cisteine, trattare la resina con un efficace cocktail di scissione di acido trifluoroacetico, triisopropilsilano e acqua o acido trifluoroacetico, triisopropilsilano, 1, 2-etanedithiol e acqua.Trattare la resina legata al peptide per 2 o 3 ore per scindere il peptide, quindi rimuovere accuratamente l'acido trifluoroacetico con un flusso di azoto. Per ottenere i peptidi grezzi, aggiungere da 4 a 5 millilitri di etere etilico alla preparazione del peptide scisso per precipitare i peptidi grezzi e centrifugare a 10.000 x g per 4 minuti. Scartare con attenzione il surnatante e asciugare all'aria il peptide per 3 minuti in una cappa aspirante efficace.Sciogliere il peptide grezzo su piccola scala in 800 microlitri di acetonitrile, quindi analizzarlo utilizzando la cromatografia liquida ad alte prestazioni a fase inversa e la cromatografia liquida-spettrometria di massa. Inoculare 100.000 cellule HeLa in 2 millilitri di DMEM in una camera a 12 pozzetti con un inserto in piastra di coltura tissutale e incubare per 24 ore in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius contenente il 5% di anidride carbonica. Rimuovere il mezzo e incubare le cellule nelle camere con 1 millilitro di 10 micromolari FITC-R8 o FITC-sR8-4 in DMEM privo di FBS per 1 ora.Successivamente, rimuovere il mezzo contenente i peptidi e lavare le cellule tre volte con 1 millilitro di PBS. Aggiungere 1 millilitro di DMEM fresco privo di FBS alle camere, quindi co-incubare le cellule HeLa nella camera con l'inserto della piastra di coltura tissutale, con le cellule HeLa sui coperchi rotondi sul fondo per 2 ore. Fissare le cellule HeLa sui coprivetrini rotondi con glutaraldeide al 2,5% per 15 minuti, quindi colorare le cellule con DAPI per 15 minuti.Infine, osservare le cellule HeLa sui vetrini sotto un microscopio a fluorescenza. Un diagramma schematico della sintesi del peptide R8 lineare marcato con FITC e del peptide R8 graffato marcato con FITC è presentato qui. Gli spettri HPLC e MS del peptide lineare R8 e del peptide R8 pinzato sono mostrati in questa figura.Il tempo di ritenzione del peptide pinzato era sostanzialmente più lungo di quello dell'analogo lineare, indicando una maggiore idrofobicità complessiva del peptide dopo la ciclizzazione con il cross-link idrofobico. Questa immagine grafica rappresenta la stabilità del peptide lineare e del peptide pinzato in presenza del 25% di FBS. L'R8 ciclico rimane intatto al 77,3% dopo l'incubazione con FBS per 4 ore, mentre la sua controparte lineare è stata per lo più degradata, suggerendo una maggiore stabilità proteolitica del peptide ciclico R8.Qui sono mostrate immagini al microscopio a fluorescenza di cellule HeLa e cellule 4T1 dopo 1 ora di incubazione con 3 peptidi R8 lineari marcati con FITC micromolari e peptide R8 pinzato marcato con FITC. Si può vedere che le cellule trattate con R8 ciclico con reticolazione aromatica hanno mostrato una fluorescenza intracellulare più elevata rispetto a quelle trattate con la loro controparte lineare. Risultati simili sono stati ottenuti con l'analisi della citometria a flusso.Per indagare ulteriormente se l'R8 ciclico conferisce una maggiore penetrazione da cellula a cellula, sono stati utilizzati modelli transwell per simulare la permeabilità barriera dei peptidi da uno strato cellulare all'altro. L'R8 ciclico ha chiaramente mostrato una maggiore penetrazione trans-barriera rispetto al peptide lineare R8, come indicato da un significativo aumento della fluorescenza intracellulare. La completa deprotezione del gruppo tritilico di cisteina e resina è importante per la successiva fase di ciclizzazione.Inoltre, l'efficienza di ciclizzazione dipende anche dalle sequenze specifiche e dalle lunghezze dei peptidi dovuti agli effetti sterici. In tal caso, sarebbe utile utilizzare una resina con minore capacità di carico o ciclizzazione dei peptidi sotto concentrazioni diluite in fase di soluzione. Questi peptidi ciclici hanno mostrato una maggiore permeabilità cellula-cellula rispetto alle loro controparti lineari.Crediamo che siano molto promettenti per superare le barriere biologiche e saranno utilizzati come molecolari per ulteriori applicazioni nel campo della somministrazione di farmaci.

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Chimica

Trasduzione proteina consente la fornitura diretta di proteine ​​biologicamente attive nelle cellule. A differenza dei metodi tradizionali come la transfezione di DNA o di trasduzione virale questo non invasivo consente paradigma altamente efficiente manipolazione cellulare in modo titolabile eludere tossicità cellulare e il rischio di trasformazione oncogena permanente da modificazione genetica.

Ingegneria Cell-permeabile proteine

Questa dettagli del protocollo un metodo per la misura quantitativa della traslocazione peptidica in grandi vescicole lipidiche unilamellari. Questo metodo fornisce anche informazioni circa la velocità di traslocazione della membrana e può essere utilizzato per identificare i peptidi che in modo efficiente e spontaneamente croce doppi strati lipidici.

Misurazione Traslocazione Peptide in grandi vescicole unilamellari

Questo video mostra una tecnica che utilizza peptidi biotinilati che penetrano nelle cellule per rilevare le interazioni intracellulari proteina-proteina. I peptidi che penetrano nelle cellule facilitano l'ingresso del peptide coniugato in una cellula e si legano specificamente alle sue proteine interagenti. La biotina, dopo essersi legata all'avidina, permette la purificazione del complesso proteico interagente da un lisato cellulare.

Sonda peptidica biotinilata a penetrazione cellulare per rilevare le interazioni proteina-proteina

Domini zinco-dita sono intrinsecamente cellula-permeabile e capace di mediare consegna proteine ​​in una vasta gamma di tipi di cellule di mammifero. Qui, un protocollo dettagliato passo-passo per l'attuazione tecnologia zinc finger-consegna proteina intracellulare è presentato.

Diretto Protein Consegna a cellule di mammifero Utilizzando Cell-permeabile Cys<sub&gt; 2</sub&gt; -Il suo<sub&gt; 2</sub&gt; domini zinc-finger

Viene delineato un metodo semplice e generale per la sintesi di peptidi ciclici utilizzando l'irradiazione a microonde. Questa procedura consente la sintesi di peptidi ciclici della spina dorsale con una raccolta di diverse conformazioni mantenendo le catene laterali e le frazioni farmacoforiche., e quindi, consente lo screening della conformazione bioattiva.

Sviluppo di un Backbone ciclico Peptide Biblioteca come potenziale Antiparassitaria Therapeutics Uso Microonde irradiazione

Si tratta di un protocollo per studiare le interazioni proteina-proteina intracellulare basate sul sistema avidina-biotina menu a tendina con la novità di combinare sequenze cellula-penetrante. Il vantaggio principale è che la sequenza di destinazione viene incubata con le cellule viventi invece di lisati cellulari e pertanto si verificherà le interazioni all'interno del contesto cellulare.

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