Name: クレマチディス・アルマンディ・カリスの真正性を識別するためのマルチパターン認識のための化学フィンガープリントと組み合わせたHPLC (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-11-11T14:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 29 s
Description: 学ぶHPLCと化学フィンガープリントによるマルチパターン認識を用いて、クレマチディス・アルマンディ・カリスの真正性と偽物を識別する方法。漢方薬の品質保証と品質基準の確立に貢献します。

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この研究は、四川省中医薬管理局のプロジェクト(番号2020JC0088、番号2021MS203)によってサポートされました。

1.化学的指紋検出方法
<ol><li>クロマトグラフィー条件<ol><li>アセトニトリル(A)/水(B)移動相を準備します。HPLCソフトウェアで次のようにグラジエントプログラムを設定します:0-20分、3%A-10%A;20-25分、10%A-13%A;25-65分、13%A-25%A;65-75分、25%A-40%A;75-76分、40%A-3%A;76-85分、3%A-3%A。</li>
		<li>移動相の流量を1.0 mL/分に維持します。</li>
		<li>30°Cに維持したC18カラム(250 mm x 4.6 mm、5 μm)でクロマトグラフィー分離を行います。</li>
		<li>注入量を10μLに設定します。</li>
		<li>波長205nmのサンプルを検出します。 注意: クロマトグラフィー条件の具体的な設定については、高速液体クロマトグラフィーの作業ソフトウェアの操作手順(材料表)を参照してください。</li>
	</ol></li>
	<li>試料溶液の調製<ol><li>原材料を内径850μm±29μmのナイロンメッシュに通して均一な粒子サイズに粉砕します。</li>
		<li>粉砕した原料2 g(正確に秤量)をストッパー付きの50 mLコニカルフラスコに入れ、50 mLのメタノールを加える。フラスコにストッパーを置き、超音波処理(600 W、40 kHz)を30分間行います。</li>
		<li>その後、フラスコを室温(RT)まで冷却する。サンプルを再度計量し、失われた抽出剤を交換して初期重量を補います。</li>
		<li>薬用抽出物を含むメタノール溶液4 mLを10 mLメスフラスコに注ぎます。6mLのH2Oを加えて混合し、10分間沈降させます。</li>
		<li>最後に、上清を0.45μmのフィルターメンブレンでろ過し、スタンバイ状態にします。</li>
	</ol></li>
	<li>指紋検出方法の検証<ol><li>上記のようにサンプルを調製し(ステップ1.2)、1日6回HPLC分析(ステップ1.1)にかけます。精度を評価するには、ステップ1.3.5の説明に従って、相対保持時間と相対ピーク面積の相対標準偏差(RSD)を計算します。</li>
		<li>RTで0、2、4、6、8、12、および24時間保存された同じサンプル溶液を分析してサンプル溶液の安定性を評価し、ステップ1.3.5の説明に従って相対保持時間と相対ピーク面積のRSDを計算します。</li>
		<li>同じサンプル(CMT-4)の6回の反復を取り、上記の手順に従ってサンプル溶液を調製し(ステップ1.2)、ステップ1.1に続いてHPLCでその指紋を検出します。相対保持時間と相対ピーク面積のRSDを計算し、ステップ1.3.5の説明に従ってその再現性を評価します。</li>
		<li>次に、 図1B のピーク数10を基準ピークとして使用し、ステップ1.3.5で説明したように、各共通ピークの相対保持時間と相対ピーク面積のRSDを計算します。</li>
		<li>以下の式を使用して、各共通ピークの相対保持時間と相対ピーク面積を計算します。 T re = T 特性/T参考 A re = A 特性/Aリファレンス ここで、T re = 相対保持時間、T 特性 = 特性ピーク保持時間、T 基準 = 基準ピーク保持時間、A re = 相対ピーク面積、A 特性 = 特性ピーク面積、および A 基準 = 基準ピーク面積。 注:伝統的な漢方薬の指紋を確立するには、通常、取得が容易で高分解能のクロマトグラフィーピークを選択する必要があります。これは、指紋を識別し、その安定性と再現性を調べるための基準ピークとして使用されます。</li>
	</ol></li>
</ol>2.チュアンムートンの指紋と類似性分析の確立
<ol><li>本物のサンプルの10バッチと、 クレマチス・アルゼンティルシア (Levl. et Vant.) W. T. Wang(CC)、 Clematis apiifolia var. obtusidentata Rehdなどの偽和物の5バッチを使用してください。エトウィルズ。(DC)、 クレマチスペテラエ ハンド。(DE)、 クレマチス・グリアナ・ ロクスブ。Var. finetii Rehd.et Wils (XS)、および Clematis finetiana Levl.et Vaniot.(SMT)を指紋分析用のサンプルとして使用します。</li>
	<li>手順 1.2 の説明に従ってサンプル溶液を調製します。ステップ1.1に記載されている条件に従って、HPLCによるすべてのサンプル溶液の指紋分析を実行します。</li>
	<li>関連データを漢方薬のクロマトグラフィー指紋の類似性評価システムにインポートします(SESCF-TCM、2012年版)。システムは、すべてのサンプルのクロマトグラムで妥当な高さと良好な分解能を持つピークを共通のピークとして指定します。 注:SESCF-TCMソフトウェアは、中国薬局方委員会(http://114.247.108.158:8888/login)のウェブサイトで登録後にダウンロードできます。<ol><li>ソフトウェアで、メニューの [参照スペクトルの設定 ]ボタンをクリックします。</li>
		<li>次に、[パラメータ設定] ウィンドウで、[タイム ウィンドウ幅] を 0.5 に設定し、[中央値手法] として [スペクトル生成方法を制御] を選択します。</li>
		<li>メインメニューの[マルチポイントキャリブレーション]をクリックし、[フルスペクトルピークマッチング]として[ピークマッチング]を選択します。</li>
		<li>最後に、[ コントロールの生成 ]をクリックして、チュアンムトンの本物の種の参照クロマトグラフィーフィンガープリントを生成します。</li>
	</ol></li>
	<li>分析のために、本物のチュアンムトンサンプル10バッチと不純物混入物5バッチの保持時間とピーク面積をSESCF-TCMにインポートします。具体的な操作は次のとおりです。<ol><li>ソフトウェアで、メインメニューの[ 基準スペクトルの設定 ]ボタンをクリックします。</li>
		<li>[パラメータ設定]ウィンドウで、チュアンムトンの本物の種の参照クロマトグラフィーフィンガープリントを基準として設定し、[中央値法]として[制御スペクトル生成方法]を選択し、[タイムウィンドウ幅]を0.5に設定します。</li>
		<li>メインメニューの[マルチポイントキャリブレーション]をクリックし、[フルスペクトルピークマッチング]として[ピークマッチング]を選択します。</li>
		<li>最後に、[ 類似度の計算 ]をクリックして、Chuanmutongの参照クロマトグラムフィンガープリントに基づいて類似度を計算します。最後に、漢方薬クロマトグラフィー指紋評価システム(2012年版)を使用して指紋の類似性を計算します。 注意: 特定の操作については、漢方薬クロマトグラフィー指紋評価システム(2012年版)の動作仕様を参照してください。</li>
	</ol></li>
</ol>3. チュアンムトン指紋のマルチパターン認識解析
<ol><li>クラスター分析 (CA)<ol><li>本物のChuanmutongサンプルの10バッチとその5バッチの偽和物のフィンガープリントの12の一般的なピークのピーク領域を変数として使用し、それらを統計分析ソフトウェアに入力して体系的なクラスター分析(CA)を行います。</li>
		<li>グループ間法を選択し、ピアソン相関係数を分類基準として使用して、チュアンムトンとその不純物のクラスター分析図を作成します。具体的な操作は次のとおりです。<ol><li>統計分析ソフトウェアで、[ファイル]をクリックしてデータをインポートします。</li>
			<li>メニューの[分析]をクリックし、[分類]の[システムクラスタリング]をクリックします。</li>
			<li>共通ピーク面積を変数として選択し、クラスター数を4に設定します。</li>
			<li>[方法]をクリックし、[クラスタリング 方法]を [グループ間接続]として選択し、[測定間隔]を [ピアソン相関]として選択し、[ OK ]をクリックしてCAマップを描画します。</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>主成分分析(PCA)<ol><li>本物の品種とその混入物の相対的な共通ピーク面積をPCA分析用の分析ソフトウェアにインポートし、PCAスコアマップを使用してサンプル差のスコアマトリックスマップを評価します。具体的な操作は次のとおりです。<ol><li>データ分析ソフトウェアを開き、メニューの[ ファイル ]をクリックして、新しい通常のプロジェクトを作成します。HPLCシステムからスプレッドシート(Excel形式など)で12の一般的なピークのピーク面積をインポートします。次に、[ 完了] をクリックしてデータのインポートを完了します。</li>
			<li>[ 新規 ] をクリックして新しいモデルを作成し、PCA でモデル タイプを設定します。[ 自動調整 ]と [追加 ]をクリックしてデータを合わせ、[スコア]をクリックしてPCA スコア マップを取得します。</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>直交偏最小二乗判別分析 (OPLS-DA)<ol><li>監督モードを使用した直交部分最小二乗識別分析法を使用して、本物のチュアンムトン品種と混入物の相対的な共通ピーク面積ピークをさらに分析し、すべてのサンプルのOPLS-DA分類スコアマップを作成します。具体的な操作は次のとおりです。<ol><li>データ解析ソフトで、メニューの「 ファイル 」をクリックしてファイルをインポートし、新しいレギュラープロジェクトを作成します。HPLCシステムからスプレッドシートに12の一般的なピークのピーク面積をインポートし、 完了 をクリックしてデータのインポートを完了します。</li>
			<li>[ 新規 ] をクリックして新しいモデルを作成し、PCA でモデル タイプを設定します。[ 自動調整 ] と [追加 ] をクリックして、データを合わせます。次に、[スコア ] をクリックしてPCAスコアマップを取得します。</li>
			<li>新規をクリックし、モデル1として新規を選択して、OPLS-DAでモデルタイプを設定します。</li>
			<li>[スケール]をクリックし、タイプを[すべてにパー]で設定します。最初に[自動調整]をクリックし、次に[スコア]をクリックしてOPLS-DAスコアマップを取得します。</li>
		</ol></li>
		<li>チュアンムトンの各共通ピークが分類結果に与える影響、および本物のチュアンムトン材料と関連する不純物の違いを判断するには、分析に投影法(VIP)の変数重要度を使用します。</li>
		<li>チュアンムートンのさまざまなコンポーネントのVIPマップを描きます。結果のVIPマップを使用して、分類に対する各変数の影響を評価し、グループ間の差に大きく寄与するコンポーネントを選別します。具体的な操作は次のとおりです。<ol><li>データ分析ソフトウェアで、メニューの[分析]をクリックし、[順列]をクリックし、順列の数を200に設定して、OPLS-DAスコアマップのR2とQ2を取得します。</li>
			<li>[VIP] をクリックし、[VIP 予測] を選択して VIP マップを取得します。</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>4.HPLCによるチュアンムートン中のβ-シトステロールの測定
<ol><li>クロマトグラフィー条件(ステップ1.1を参照)<ol><li>移動相を準備します:メタノール-水(97:3)。</li>
		<li>移動相の流量を1.0 mL/minに設定します。</li>
		<li>30°Cに維持したC18カラム(250 mm x 4.6 mm、5 μm)でクロマトグラフィー分離を行います。</li>
		<li>注入量を10μLに設定します。</li>
		<li>波長204nmの成分を検出します。</li>
	</ol></li>
	<li>試料溶液の調製<ol><li>β-シトステロール(0.1 mg/mL)の標準液は、対応する標準物質の正確な計量量をメタノールに溶解して調製します。</li>
		<li>原料の分析試料を内径180μm±7.6μmのナイロンメッシュに通して均一な粒径に粉砕する。</li>
		<li>粉砕した原料2 g(正確に秤量)を丸底フラスコに入れ、それに50 mLのクロロホルムを加える。</li>
		<li>フラスコを還流冷却器に接続し、沸騰水浴(中程度の沸騰)で60分間加熱します。抽出溶液を15〜20μmのろ紙でろ過します。</li>
		<li>ろ液を沸騰水浴(中程度の沸騰)で約10分間ほぼ乾くまで蒸発させます。</li>
		<li>残渣を溶解し、メタノールを使用して容量を5 mLに構成します。最後に、上清を0.45μmのフィルター膜に通し、スタンバイ状態にします。</li>
	</ol></li>
	<li>メソッドバリデーション<ol><li>サブステップ4.2.1で調製したβ-シトステロールのストック溶液を取り、100%メタノールで希釈し、100 μg/mL、80 μg/mL、60 μg/mL、50 μg/mL、40 μg/mL、30 μg/mL、および20 μg/mLの濃度の溶液を調製します。</li>
		<li>ステップ4.1に記載のクロマトグラフィー条件でサンプルを注入してピーク面積を決定し、注入量に対するピーク面積で回帰分析を行い、回帰式と相関係数を取得してその直線性を評価します。</li>
		<li>上記のようにサンプルを調製し(ステップ4.2)、同じ日に6回HPLC分析(ステップ4.1)に供します。次に、ピーク面積のRSDを計算して精度を評価します。</li>
		<li>ステップ4.1で説明したように、RTで0、2、4、6、8、12、および24時間保存された同じサンプル溶液を分析することにより、サンプル溶液の安定性を評価します。次に、ステップ1.3.5の説明に従ってピーク面積のRSDを計算します。</li>
		<li>同じサンプル(CMT-4)を六重剤に溶解し、ステップ4.2の説明に従って調製し、ステップ4.1の説明に従ってHPLC分析にかけることにより、再現性を調べます。次に、6つのサンプルのβ-シトステロール含有量のRSDを計算します。</li>
		<li>標準的な加算方法を使用して、メソッドの精度を評価します。このためには、β-シトステロール含有量の80%、100%、および120%でβ-シトステロール参照溶液をサンプルに追加し、手順4.1で説明されているように各条件を3回繰り返します。平均回収率とRSDを計算して、メソッドの精度を評価します。 注: 回復率 (RR) の計算式は次のとおりです。 RR % = [(M t - M 0) / Ms] × 100 ここで、Mt=標準物質を添加した後のβ−シトステロールの品質、M0=試料溶液の品質、およびMs=添加したβ−シトステロールの品質。</li>
	</ol></li>
	<li>サンプルのβ-シトステロール含有量の測定<ol><li>本物の漢方薬材料10バッチと関連する不純物の5バッチを取り、ステップ4.2に従ってサンプル溶液を調製します。</li>
		<li>次に、各試料溶液およびβ−シトステロール参照溶液を注入して、ステップ4.1に記載の条件下でピーク面積を決定し、外部標準ワンポイント法を用いて各試料のβ−シトステロール含有量を算出する。</li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>Qing, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+oleanolic+acid+in+Caulis+clematidis+armandii+by+HPLC%5BTitle%5D)+AND+%22West+China+Journal+of+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Determination of oleanolic acid in Caulis clematidis armandii by HPLC.</a> West China Journal of Pharmaceutical Sciences. 21 (3), 273-274 (2006).</li>
<li>Yang, S. D., Wang, R., Fu, D. Y., Guo, J. J., Tan, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+on+oleanolic+acid+in+caulis+clematidis+armandii+by+microwave+assisted+extraction-HPLC%2FMS%5BTitle%5D)+AND+%22Anhui+Academy+of+Agricultural+Sciences%22%5BJournal%5D)">Determination on oleanolic acid in caulis clematidis armandii by microwave assisted extraction-HPLC/MS.</a> Anhui Academy of Agricultural Sciences. 38 (13), 6929-6931 (2010).</li>
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著者は開示するものは何もありません。

研究用のサンプルコレクションは、漢方薬の真正性を特定する際のマルチパターン認識を構築するための最初の重要なステップです。市場調査を通じて、四川亜安、梁山、楽山が川和通の野生資源の主な生産地であることがわかりました。同じ属の関連品種も同じ地理的分布を持っています6,20;CC、DC、DE、XS、およびSMTは、チュアンムトン16,21として誤用されることがよくあります。そこで、本研究では、上記の原産地において、本物のチュアンムトン10バッチと混合サンプル5バッチを採取し、品種の正確性を確認した。
2番目の重要なステップは、化学成分に関する可能な限り多くの情報を表示できるHPLCフィンガープリントの検出条件をスクリーニングすることです。本研究では、 補足図1に示すように、抽出方法、抽出溶媒、抽出時間など、さまざまな調製条...

チュアンムトン、クレマチスアルマンディフランシュのドライカリス。またはクレマチスモンタナBuch.-Ham.は、クリニック1,2,3で一般的に使用される伝統的な漢方薬です。尿の問題、浮腫、舌や口の痛み、乳汁分泌の低下、関節のこわばり、湿った熱によって引き起こされる筋肉痛の治療に使用されます4。Chuanmutongは常に野生品種から得られており、主に中国南西部、特に四川省に分布しており、最高の品質が見られます5,6。本物の品種とそれらの密接に関連する不純物を区別することは困難です7,8,9,10。中国薬局方の2020年版のChuanmutongの品質基準は、含有量決定なしの特性、顕微鏡識別、および薄層識別のみを規定しており、偽和物を効果的に識別できないため、潜在的なリスクがあります。さらに、チュアンムトンと関連植物を比較および特定した報告はほとんどありません。したがって、チュアンムトンの信憑性を確保するための品質管理方法は、さらに研究する価値があります。
チュアンムートンの化学成分は、主にオレアナン型五環式トリテルペノイドとその配糖体、フラボノイド、および有機酸で構成されています11,12,13,14。その中で、オレアノール酸、β−シトステロール、スチグマステロール、およびエルゴステロールは、異なる強度の利尿作用を有し、これは、利尿を促進し、絞尿を緩和するための潜在的な薬力学的物質であり得る15,16。化学指紋は、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)、ガスクロマトグラフィー(GC)などによってサンプルに含まれる多くの化学成分を分離して検出することによって得られます。Chuanmutongの特性を分析するために適切な統計分析方法を採用することで、伝統的な漢方薬の全体的な品質管理と科学的識別を決定できます17,18,19。
この研究では、チュアンムトン本物の品種の10バッチと偽和物の5バッチが収集されました。それらの品質は、クラスター分析(CA)、主成分分析(PCA)、直交部分最小二乗弁別分析(OPLS-CA)、および薬力学的成分の含有量決定を含むマルチパターン認識と組み合わせたHPLCフィンガープリント法によって比較および分析されました。このプロトコルは、高い特異性を持つ本物の品種を識別するための方法を確立し、本物の品種と中国の医薬品の不純物を科学的に識別するための新しい戦略を確立します。

<table><tbody><tr><td>酢酸</td><td>Zhiyuan化学試薬Co.、Ltd.、天津、中国</td><td>2017381038</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;Trading Co., Ltd., Shanghai, China</td><td>WXBD5243V</td><td></td></tr><tr><td>ベータ;-Sitosterol</td><td>Meisai Biological Technology Co., Ltd., Chongqing, China</td><td>20210201</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;C18コラム</td><td>Yuexu材料技術有限公司、上海、中国</td><td>ウェルチアルティメットLP</td><td></td></tr><tr><td>チュアンムトン</td><td>国強中国薬草小品有限公司、四川省、中国&nbsp;</td><td>19020103</td><td>CMT-1</td></tr><tr><td>Chuanmutong</td><td>Hongya Wawushan Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China&nbsp;</td><td>200701</td><td>CMT-2</td></tr><tr><td>Chuanmutong</td><td>Hongpu Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China&nbsp;</td><td>200701</td><td>CMT-3</td></tr><tr><td>Chuanmutong</td><td>Hongpu Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China&nbsp;</td><td>200901</td><td>CMT-4</td></tr><tr><td>Chuanmutong</td><td>Xinrentai Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China&nbsp;</td><td>210701</td><td>CMT-5</td></tr><tr><td>Chuanmutong</td><td>Haobo Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China&nbsp;</td><td>210401</td><td>CMT-6</td></tr><tr><td>Chuanmutong</td><td>Xinrentai Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China&nbsp;</td><td>200901</td><td>CMT-7</td></tr><tr><td>Chuanmutong</td><td>Wusheng Pharmaceutical Group Co., Ltd., Sichuan, China&nbsp;</td><td>201201</td><td>CMT-8</td></tr><tr><td>Chuanmutong</td><td>Limin Chinese Herbal Pieces Co., Ltd., Sichuan, China&nbsp;</td><td>201001</td><td>CMT-9</td></tr><tr><td>Chuanmutong</td><td>Yuhetang Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China</td><td>210501</td><td>CMT-10</td></tr><tr><td>Clematis argentilucida (Levl. et Vant.) W. T. Wang</td><td>Madzi Bridge, Sanlang Township, Tianquan County, Sichuan, China&nbsp;</td><td>-</td><td>CC</td></tr><tr><td>Clematis apiifolia var. obtusidentata Rehd. et Wils.</td><td>中国四川省紅雅県吉立平郷黒林村&nbsp;</td><td>-</td><td>DC</td></tr><tr><td>Clematis peterae Hand.-マズ。</td><td>黄木村、黄武郷、漢源県、四川省、中国&nbsp;</td><td>-</td><td>DE</td></tr><tr><td>Clematis gouriana Roxb. Var. finetii Rehd. et Wils</td><td>Mixedang Mountain, Huangwan Township, Emei County, Sichuan, China&nbsp;</td><td>-</td><td>XS</td></tr><tr><td>Clematis finetiana Levl. et Vaniot.</td><td>中国四川省峨眉県黄湾郷万年村&nbsp;</td><td>-</td><td>SMT</td></tr><tr><td>電子天秤</td><td>Haozhuang Hengping Scientific Instrument Co., Ltd.、上海、&nbsp;中国&nbsp;</td><td>FA1204</td><td></td></tr><tr><td>Ergosterol</td><td>Meisai Biological Technology Co., Ltd, Chongqing, China</td><td>20210201</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol Kelon</td><td>Chemical Co., Ltd., Chengdu, China</td><td>2021112602</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl acetate</td><td>Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China</td><td>2017042043</td><td></td></tr><tr><td>Formic</td><td>acid Kelon Chemical Co., Ltd., Chengdu, China</td><td>2016062901</td><td></td></tr><tr><td>高速液体クロマトグラフィーAgilent</td><td>、米国。</td><td>1260</td><td></td></tr><tr><td>IBM SPSS Statistics version 26.0</td><td>International Business Machines Corporation, USA-Methanol</td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;貿易Co.、株式会社、上海、中国</td><td>WXBD6409V</td><td></td></tr><tr><td>メタノール</td><td>Kelon化学Co.、Ltd.、成都、中国</td><td>202010302</td><td></td></tr><tr><td>n-ブチルアルコール</td><td>Zhiyuan化学試薬Co.、Ltd.、天津、中国</td><td>2020071047</td><td></td></tr><tr><td>石油エーテル</td><td>Zhiyuan化学試薬Co.、Ltd.、天津、中国</td><td>2020090125</td><td></td></tr><tr><td>リン酸</td><td>Comeo化学試薬Co.、Ltd.、天津、中国</td><td>20200110</td><td></td></tr><tr><td>SESCF-TCM version 2012</td><td>National Pharmacopoeia Commission,</td> <td>China-http://114.247.108.158:8888/login</td><td></td></tr> <tr><td>Stigmasterol</td><td>Meisai Biological Technology Co., Ltd., Chongqing, China</td><td>20210201</td><td></td></tr><tr><td>Trichloromethane</td><td>Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd., Shanghai, China</td><td>20200214</td><td></td></tr><tr><td>Umetrics SIMCA version14.1.0.2047</td><td>Umetrics、スウェーデン</td><td>-</td><td>https://www.sartorius.com/en/products/process-analytical-technology/data-analytics-software/mvda-software/simca/simca-free-trial-download</td></tr><tr><td>超純水機</td><td>Youpu Ultrapure Technology Co., Ltd., Sichuan, China</td><td>UPH-II-10T</td><td></td></tr><tr><td>超音波洗浄機</td><td>Kunshan Hechuang Ultrasound Instrument Co., Ltd., Jiangsu, China</td><td>KH3200E</td><td></td></tr></tbody></table>

クレマチディス・アルマンディ・カリスの真正性を識別するためのマルチパターン認識のための化学フィンガープリントと組み合わせたhplc

HPLC Coupled with Chemical Fingerprinting for Multi-Pattern Recognition for Identifying the Authenticity of Clematidis Armandii Caulis

漢方薬とその関連不純物を同定する方法は、 クレマチディス・アルマンディ・カリス (チュアンムトン、普遍的に使用されている伝統的な漢方薬)を例に構築されました。クラスター分析(CA)、主成分分析(PCA)、直交部分最小二乗弁別分析(OPLS-DA)を含むケモメトリックスと組み合わせた高速液体クロマトグラフィー(HPLC)フィンガープリントに基づいて、本物のチュアンムトン品種の10バッチと関連する不純物の5バッチを分析および比較しました。さらに、β-シトステロールの含有量を測定した。チュアンムートンの対照化学的指紋が確立され、12の一般的なピークが特定されました。本物のチュアンムトン品種の10バッチの指紋と対照指紋の類似性は0.910〜0.989でしたが、5バッチの混入物の類似性はわずか0.133〜0.720でした。クロマトグラムの一般的なピークに基づいて、15バッチのサンプルがPCAによって3つの含有量レベルに分類され、CAによって4つのカテゴリに集約され、本物のチュアンムトンとチュアンムートンの不純物を明確に区別しました。さらに、OPLS-DAを通じて、本物のチュアンムトンとチュアンムトンの不純物を効果的に識別できる7つの差動成分が見つかりました。本物のチュアンムトン品種の10バッチのβ-シトステロール含有量は97.53-161.56μg / gでしたが、偽和物の5つのバッチのβ-シトステロール含有量は大きく異なり、その中で クレマチスペテラエ ハンドのβ-シトステロール含有量。と クレマチス・グリアナ・ ロクスブ。Var. finetii Rehd.エトウィルズ。チュアンムートンの本物の品種よりも大幅に低かった。本研究で確立されたHPLC指数成分含有量と化学指紋マルチパターン認識法は、本物の漢方薬材料および関連する不純物を効果的に識別するための新しい戦略を提供します。

チュアンムートンのクロマトグラフィーフィンガープリントと類似性分析(SA) 精度、再現性、安定性の相対保持時間のRSD値は、それぞれ0.46%、1.65%、0.53%未満でした。相対ピーク面積のRSD値は、それぞれ4.23%、3.56%、3.96%未満でした。 図1A、Bに示すように、10個の本物のチュアンムトンサンプルのHPLCフィンガープリントには、12個の異なる共通ピーク(ピーク1からピーク12まで)がありました。No.10のピーク面積が比較的大きかったため、解像度は良好でした。各試料に存在する成分をそのまま、指紋の安定性や再現性を調べるための基準ピークとした。そして、ピークNo.10を基準ピーク(S)とし、残りの11個のピークの相対保持時間を算出した。
類似度分析では、相関係数が1に近いほど、サンプル間の類似度が高くなります。 表1に示すように、チュアンムトンの10バッチの類似度は0.910〜0.989であっ...

ここでは、クレ マチディス・アルマンディ・カウリス とその偽和物の本物の品種を効果的に識別するための新しい戦略を提供する、化学的指紋マルチパターン認識と組み合わせた高速液体クロマトグラフィー(HPLC)を確立するためのプロトコルを提示します。

クレマチディス・アルマンディ・カリスの真正性を識別するためのマルチパターン認識のための化学フィンガープリントと組み合わせたHPLC

A method for identifying Chinese medicinal materials and their related adulterants was constructed by taking Clematidis Armandii Caulis (Chuanmutong, a ...

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このプロトコルは、クレマチディス・アルマンディ・カリスとその偽和物の真正材料を効果的に識別するための新しい戦略を提供することができます。この方法は、医薬品の品質研究に使用でき、他の漢方薬品の品質基準を研究するためのリファレンスを提供します。サンプル調製を開始するには、適切な内径のナイロンメッシュに原料を通過させて、原料を均一な粒子サイズに粉砕します。50ミリリットルのメタノールをフラスコに加える前に、2グラムの粉砕原料を栓付きの50ミリリットルの円錐フラスコに正確に計量した。600ワットと40キロヘルツで30分間加熱された超音波でフラスコに栓を置きます。インキュベーションの終わりに、ろ紙を通して薬用抽出物溶液をこすります。濾した後、薬用抽出物を含むメタノール溶液4ミリリットルを10ミリリットルのメスフラスコに移します。それからそれに6ミリリットルの水を加えて、そして溶液を混ぜる。溶液を10分間沈降させます。サンプルのHPLC分析用。まず、移動相を準備し、原稿に記載されているようにHPLCグラジエントプログラムを設定します。0.45ミクロンのマイクロポーラスフィルターメンブレンでサンプルをろ過し、HPLC分析にかけます。各サンプルについて、1日6回分析を行います。サンプル溶液の安定性を評価するには、調製後0、2、4、6、8、12、および24時間室温で保存した同じサンプル溶液を分析します。同じサンプルの6回の反復を採取し、HPLCでその指紋を検出します。関連するデータを、漢方薬のクロマトグラフィー指紋の類似性評価システムまたはSESCF TCMバージョン2012という名前のソフトウェアにインポートします。分析のために、本物のチュアンムトンサンプルの10バッチすべてと不純物の5バッチの保持時間とピーク面積をSESCF TCMにインポートします。メインメニューで、設定された参照スペクトルをクリックし、パラメータ設定ウィンドウに移動して、Chuanmutongの本物の種の参照クロマトグラフィーフィンガープリントを基準として設定します。次に、制御スペクトル生成方法を中央値法として設定し、タイム ウィンドウ幅を 0.5 に設定します。次に、メインメニューのマルチポイントキャリブレーションをクリックし、ピークを選択してから、マークされたピークとしてピークマッチングオプションを選択します。最後に、[類似度の計算]をクリックして、Chuanmutongの参照クロマトグラムフィンガープリントに基づいてサンプルの類似性分析を実行します。全身クラスター分析を実行するには、関連する統計分析ソフトウェアを開き、ファイルをクリックして、本物のサンプルの10バッチと不純物の5バッチのデータをソフトウェアにインポートします。メニューの [分類] タブで、[分析とシステム クラスタリング] をクリックします。変数として、10バッチの真正サンプルと5バッチの混入物の一般的なピーク領域を選択します。クラスターの数を 4 に設定します。次に、[方法]をクリックして、グループ間接続としてクラスタリング方法を選択します。測定間隔をピアソン相関として選択し、[OK]タブを使用してクラスター分析マップを描画します。主成分分析またはPCAの場合は、データ分析ソフトウェアを開きます。メニューのファイルをクリックし、新しい通常のプロジェクトを作成します。HPLCシステムからExcelまたは同様のスプレッドシートで12の一般的なピークのピーク面積をインポートします。ヒット 完了 ボタンをクリックして、データのインポートを完了します。PCAでモデルタイプを設定するには、[新規]をクリックして新しいモデルを作成し、自動調整と追加タブを使用してデータを適合させます。スコアに移動して、PCAスコアマップを取得します。直交偏最小二乗判別分析またはOPLSDAを使用します。前に示したように、PCA スコア マップを生成します。をクリックしてOPLSDAでモデルタイプを設定します 新規 及び 新規 モデル1として スケールインする前に すべてのパーを選択し、次にスコアで自動調整を押してOPLSDAスコアマップを生成します。変数の重要度と射影を推定するには、データ分析ソフトウェアメニューに移動し、分析に移動してから、突然変異ごとに数値を200に設定します。OPLSDAスコアからR二乗とQ二乗の値を取得し、VIPおよびVIP予測をクリックしてVIPマップを取得します。10個の本物のチュアンムトンサンプルのHPLCフィンガープリントは、12の異なる共通のピークを示し、そのうち比較的大きく、よく解像されました。ピーク数10を基準ピークとして用い、残りのピークの相対保持時間を推定した。本物のサンプルは、1に非常に近い類似度を示し、良好な一貫性で高い類似性を意味します。しかし、混入物の5つのバッチと対照のチュアンムトンの間の類似度は非常に低かった。5つの不純物のHPLCフィンガープリントは、主に28〜55分の保持時間を持つ領域で、本物のサンプルとは異なることが観察されました。PCAは、真正品種と混入物CCとの差との間に明らかな類似性を示し、分類距離が20の場合のクラスター分析からも同様の結果が得られました。OPLSDAから生成されたスコアマトリックスは、本物のサンプルのサンプルポイントと偽和物の間に交差がないことを示しました。繰り返しになりますが、偽和物CCは他の姦淫物よりも本物の品種に似ていました。VIPマップによると、1より大きい値を持つピークが、本物のサンプルと混入物の違いを引き起こす主要なマーカー成分として特定されました。チュアンムトンに含まれる有効成分であるベータシトステロールの含有量は、混和物の5つのバッチすべてで検出されましたが、含有量は大きく異なりました。このプロトコルは、医薬品に関するすべての情報を複数の角度から反映し、チュアンムートンの医薬品の信憑性を推定するためのさまざまな分析方法を確立します。

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Research

JoVE Journal

Chemistry

化学

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クレマチディス・アルマンディ・カリスの真正性を識別するためのマルチパターン認識のための化学フィンガープリントと組み合わせたHPLC

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