Name: Um conjunto de técnicas de triagem para uma rápida visão geral da função dos neutrófilos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-09T12:40:00.000+00:00
Duration: 12 min 27 s
Description: Aprenda o protocolo NeutroFun para triagem funcional de neutrófilos usando reagentes de baixo custo. Este método avalia viabilidade, migração, fagocitose e produção de espécies reativas de oxigênio em tempo real.

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As agências de fomento FAPDF, CNPq, CAPES, UnB, FINEP e FINATEC são reconhecidas pelos autores.

Todos os experimentos seguiram rigorosamente as diretrizes éticas estabelecidas pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade de Brasília (processo 13364819.0.0000.5558), e as amostras foram identificadas por códigos para garantir o anonimato dos doadores. As células foram obtidas de doadores normais do sexo masculino, saudáveis, com idade entre 18 e 35 anos, que assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido e preencheram os seguintes critérios de elegibilidade: não fumantes/vapers, sem condições crônicas de saúde e sem história de condições inflamatórias nos últimos 14 dias.
1. Coleta de sangue
<ol><li>Coloque assepticamente 0,3 mL de 5.000 UI/mL de heparina (ver Tabela de Materiais) em uma seringa estéril de 20 mL para heparinizá-la.</li>
	<li>Aplicar um torniquete venoso cerca de 4 pontos acima do local da punção e identificar a veia cubital ou cefálica mediana para punção venosa. NOTA: Certifique-se de que o tempo total de torniquete não exceda 1 min.</li>
	<li>Limpar o local da punção com álcool a 70% e realizar a punção venosa.</li>
	<li>Inverta suavemente a seringa três ou quatro vezes depois de coletar o sangue para misturar o sangue e a heparina corretamente.</li>
</ol>2. Isolamento de neutrófilos
NOTA: Leucócitos polimorfonucleares (PMNs) são isolados por centrifugação por gradiente de densidade seguido de lise hipotônica das hemácias remanescentes (RBC), como descritoanteriormente11 com algumas alterações. Este método não é obrigatório para a realização dos ensaios de triagem, podendo ser substituído desde que o método escolhido resulte em uma viabilidade de &gt;97%, priming ou ativação de &lt;3% dos PMNs, e produza células suficientes para todos os ensaios, réplicas e condições. A realização dessas etapas em condições assépticas e o uso de soluções livres de endotoxinas são mandatórios para evitar a ativação celular.
<ol><li>Fazer diluições de 12 mL de meios de separação de 60% e 70% (comercialmente disponíveis; ver Tabela de Materiais) em tubos cônicos de 50 mL.</li>
	<li>Prepare o gradiente de baixo para cima adicionando 4 mL de cada vez a diluição de 60% sobre a diluição de 70%, usando uma pipeta de 5 mL. Faça isso suavemente para evitar misturar a interface.</li>
	<li>Colocar cuidadosamente 12 mL de sangue heparinizado sobre o gradiente de densidade. Centrifugar a 200 x g durante 15 min à temperatura ambiente. OBS: A partir desta etapa, até a ativação do PMN, todos os reagentes e tubos utilizados devem ser mantidos em um resfriador cheio de gelo.</li>
	<li>Descarte a camada de plasma/células mononucleares e, em seguida, transfira suavemente a camada acima da pastilha de eritrócitos para dois tubos cônicos de 15 mL com aproximadamente 7,5 mL em cada. Completar o volume do tubo com solução salina balanceada de Hank (HBSS; ver Tabela de Materiais).</li>
	<li>Centrifugar a 300 x g durante 5 min a 19 °C.</li>
	<li>Lave o pellet de célula com HBSS.<ol><li>Descarte o sobrenadante despejando o tubo e ressuspenda suavemente o pellet em 7 mL de HBSS.</li>
		<li>Centrifugar a 300 x g durante 5 minutos a 19 °C para remover todos os meios de separação.</li>
	</ol></li>
	<li>Realizar lise hipotônica das hemácias remanescentes.<ol><li>Descarte o sobrenadante e combine os pellets em um único tubo.</li>
		<li>Ressuspender a pastilha de CH/PMN em 3 mL de H2O estéril e adicionar 3 mL de HBSS (2x) dentro de 25 s para restaurar a osmolaridade. Em seguida, centrifugar a 300 x g por 5 min a 19 °C.</li>
		<li>Repita os passos 2.8.1 e 2.8.2 para uma pastilha branca e sem eritrócitos. NOTA: O sobrenadante deve ser removido o mais rapidamente possível para minimizar o contacto dos neutrófilos com os produtos de degradação das hemácias. Alternativamente, a segunda lise hipotônica pode ser substituída ressuspendendo suavemente a camada residual de hemácias e removendo todo o sobrenadante, pois as hemácias restantes sedimentarão acima da pelota de PMN.</li>
	</ol></li>
	<li>Descarte o sobrenadante despejando o tubo, ressuspenda suavemente os PMNs no buffer restante e transfira-os para um microtubo gelado. NOTA: Certifique-se de anotar o volume durante a transferência das células ressuspensas com uma micropipeta.</li>
	<li>Transferir 3 x 1 μL da suspensão celular para uma lâmina de vidro limpa (três poços de 1 μL cada) e corar com panóptica rápida (ver Tabela de Materiais) para avaliação da morfologia e pureza12.<ol><li>Para coloração com panóptica rápida, imergir a lâmina cinco vezes no fixador panóptico n° 1, seis vezes em eosina n° 2 e duas vezes em hematoxilina n° 3, com duração de 1 s cada imersão.</li>
		<li>Lave suavemente a lâmina de vidro com água destilada.</li>
		<li>Deixe escorrer e secar ao ar.</li>
	</ol></li>
	<li>Observar ao microscópio e contar 300 células aleatórias em cada poço, diferenciando os neutrófilos dos demais granulócitos.</li>
	<li>Transferir 1 μL da suspensão celular para 49 μL do corante azul de tripano a 0,2%13 e contar as células usando uma câmara de Neubauer, distinguindo entre células mortas e viáveis.</li>
	<li>Ajustar a concentração celular para 6.667 células/μL utilizando uma solução de plasma autólogo a 50% e HBSS a 50% suplementada com cálcio e magnésio. Dividir uniformemente a suspensão de 6.667 células/μL entre os microtubos correspondentes às condições a serem testadas, incluindo o controle negativo. NOTA: Qualquer concentração celular semelhante aos neutrófilos circulantes no organismo modelo pode ser usada, mas é importante usar a mesma concentração celular em todos os experimentos para reprodutibilidade.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65329/65329fig01.jpg"> Figura 1: Protocolo de isolamento de neutrófilos. Duas concentrações do meio de separação (percoll) (A) são empilhadas (B), então o sangue é colocado em camadas no topo do gradiente de separação (C). Após a centrifugação, o PMN fica na camada central (D), que é dividida em dois tubos de 15 mL (E). A suspensão celular é lavada duas vezes em HBSS e centrifugada (G-I) para remover o meio, em seguida, as células são ressuspensas e as hemácias residuais são submetidas a duas rodadas de lise hipotônica (J-M). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65329/65329fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
3. Preparação para ativação de neutrófilos
<ol><li>Em microtubos de 1,5 mL, preparar um sistema de ativação para cada condição de modo que a concentração celular final seja de 6.600 células/μL. Por exemplo, para testar os efeitos de 100 nM fMLP (N-formil-metionil-leucil-fenilalanina; ver Tabela de Materiais), adicione 5 μL de 10 μM fMLP a 495 μL da suspensão de 6.667 células/μL. Para o controle negativo (não estimulado), adicionar HBSS contendo Ca2+ e Mg2+. NOTA: Para demonstrar esta metodologia, foram utilizadas as seguintes concentrações finais dos estímulos: 100 nM fMLP, 16 μM de falaxin, um peptídeo antimicrobiano de ocorrência natural14, e 100 nM PMA (phorbol 12-miristato 13-acetato) (ver Tabela de Materiais).</li>
	<li>Incubar a 37 °C sem rotação. NOTA: Todas as alíquotas para ensaios funcionais são retiradas desta suspensão celular, doravante denominada sistema de ativação.</li>
</ol>4. Ensaio de cloreto de azul de nitrotetrazólio (NBT) para avaliação da produção de ROS
<ol><li>Preparação da solução de trabalho NBT: Para cada condição experimental, prepare uma solução de trabalho NBT (ver Tabela de Materiais) de 6 mM usando as seguintes etapas:<ol><li>Dissolver 0,0005 g de NBT em 10 μL de dimetilsulfóxido (DMSO) e vórtice por pelo menos 15 min.</li>
		<li>Adicionar 90 μL de HBSS Ca2+Mg2+ e vórtice até 2 min. OBS: Todas as etapas que envolvem o NBT devem ser realizadas no escuro.</li>
	</ol></li>
	<li>Realizar teste de lâminas NBT.<ol><li>Após 20 minutos de ativação celular, misture suavemente a suspensão celular e transfira cuidadosamente 2 μL de PMN para uma lâmina de vidro limpa. Incubar durante 20 min numa câmara humidificada a 37 °C. OBS: Não espalhe muito a suspensão da célula sobre a lâmina; caso contrário, pode secar antes da incubação.</li>
		<li>Adicionar 1 μL da solução de trabalho NBT sobre as células e incubar durante 20 minutos protegido da luz.</li>
		<li>Seque a lâmina com ar quente e fixe-a com uma gota de metanol em cada poço por 1 min. Coloração com 0,03% de safranina (ver Tabela de Materiais) por 1 min.</li>
		<li>Lave suavemente a lâmina de vidro com água destilada.</li>
		<li>Deixe a lâmina secar ao ar e observe ao microscópio.</li>
		<li>Contar 100 células aleatórias em cada poço, diferenciando neutrófilos com e sem depósitos de formazana.</li>
	</ol></li>
	<li>Realizar ensaio de espectrofotometria NBT.<ol><li>Após 40 min de ativação celular, misture suavemente a suspensão celular e transfira 90 μL de PMNs do sistema de ativação para um microtubo limpo. Em seguida, adicione cuidadosamente 20 μL da solução NBT 6 mM. Incubar no escuro durante 20 minutos a 37 °C.</li>
		<li>Adicionar 100 μL de dodecil sulfato de sódio a 10% (SDS; ver Tabela de Materiais) e vórtice.</li>
		<li>Sonicate usando um sonicator de ponta a uma amplitude de 60%, cinco ciclos de 15 s cada com intervalos de 15 s. Centrifugar a 12.000 x g por 5 min.</li>
		<li>Transferir 60 μL do sobrenadante para uma placa de fundo claro de 96 poços e medir a absorbância do produto formazan a 570 nm.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Ensaio de fagocitose
<ol><li>Prepare uma suspensão de 33.000 leveduras/μL para cada condição, conforme descrito abaixo:<ol><li>Adicionar aproximadamente 0,75 mg de levedura seca (Saccharomyces cerevisiae; ver Tabela de Materiais) a 200 μL de HBSS Ca2+Mg2+ e incubar num termomisturador a 100 °C com 500 rpm durante, pelo menos, 15 min.</li>
		<li>Homogeneizar a mistura por vórtice e transferir 5 μL de suspensão de levedura para 45 μL de corante azul de tripano a 0,2%. Conte as leveduras usando uma câmara de Neubauer.</li>
		<li>Ajustar a concentração da suspensão inicial para 33.000 células de levedura/μL utilizando HBSS Ca2+Mg2+. Mantenha a suspensão no gelo até o uso.</li>
	</ol></li>
	<li>Após 20 min de ativação celular, misturar suavemente a suspensão celular e transferir 5 μL do sistema de ativação para 5 μL da suspensão de 33.000 leveduras/μL de Saccharomyces cerevisiae em um novo microtubo estéril. NOTA: A relação neutrófilo/levedura é de 1:5 (PMN:levedura).</li>
	<li>Transferir imediatamente 6 μL da suspensão PMN/levedura para três poços de uma lâmina de vidro limpa (2 μL cada) e incubar a lâmina em uma câmara umidificada por 40 min. OBS: Não espalhe muito a suspensão da célula sobre a lâmina; caso contrário, pode secar antes da incubação.</li>
	<li>Secar a lâmina sob ar quente e manchar com panóptica rápida, conforme descrito no passo 2.9 acima. NOTA: O terceiro passo da coloração panóptica rápida é fundamental para a análise microscópica da lâmina. A coloração da lâmina por ≥3 s nesta etapa pode torná-la imprópria para análise, uma vez que será difícil diferenciar leveduras de lobos nucleares de neutrófilos.</li>
	<li>Observar as lâminas ao microscópio, contando 100 neutrófilos aleatórios de cada poço e discriminando entre PMNs positivos e negativos para fagocitose. NOTA: Pelo menos uma partícula de levedura dentro ou em contato direto com a membrana celular PMN indica um PMN positivo para fagocitose. Se estiver interessado na relação levedura/neutrófilo, conte também o número de partículas de levedura engolfadas.</li>
</ol>6. Ensaio de quimiotaxia PMN em tempo real
OBS: O ensaio de migração é realizado de forma semelhante ao protocolo descrito anteriormente15, com as seguintes adaptações:
<ol><li>Prepare o gradiente quimiotático adicionando 160 μL de quimioatrativo (por exemplo, fMLP, IL-8, C5 ou LTB4; ver Tabela de Materiais) à câmara inferior de uma placa de análise de células em tempo real (RTCA) baseada em impedância. Para controles negativos e brancos, adicionar 160 μL de HBSS Ca2+Mg2+.</li>
	<li>Fixar a câmara superior e adicionar 25 μL de HBSS Ca2+Mg2+. Incubar à temperatura ambiente durante pelo menos 1 h para formar o gradiente quimiotático.</li>
	<li>Após 60 min de ativação celular, misturar suavemente a suspensão celular e colocar 60 μL de suspensão celular na câmara superior. Adicionar 60 μL de HBSS Ca2+Mg2+ ao branco.</li>
	<li>Coloque a placa RTCA e programe o software RTCA para medir o índice celular (IC) a cada 60 s por 2 h. NOTA: As placas de ATR podem ser lavadas para reutilização conforme descrito anteriormente16. Em resumo, lave as câmaras e eletrodos de ATR com solução salina buferred de fosfato (PBS) três vezes, depois com água ultrapura tipo I duas vezes. Incubar a câmara inferior e superior com tripsina 0,25% 0,53 mM ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) por 40 min. Lave com água ultrapura três vezes.</li>
</ol>7. Ensaio sugestivo de NET
<ol><li>Após 10 min de ativação celular, misturar suavemente a suspensão celular e transferir 4 μL dos PMNs de cada sistema de ativação sob avaliação, divididos em dois poços de uma lâmina de vidro limpa. Incubar numa câmara humidificada a 37 °C durante 30 min.</li>
	<li>Adicionar 1 μL de DNAse I a um dos poços e incubar durante 20 min a 37 °C (numa câmara húmida).</li>
	<li>Secar a lâmina e corar com panóptica rápida, conforme descrito anteriormente no passo 2.9 da seção "isolamento de neutrófilos".</li>
	<li>Avalie as lâminas ao microscópio. Observação : procure qualquer indicação de versão NET, caracterizada pela presença de estruturas semelhantes à Web. Uma vez identificado, confirme se o tratamento com DNAse I foi capaz de remover tais estruturas. Este ensaio é sugestivo de formação de NET, uma vez que testes adicionais são necessários para confirmar sua presença.</li>
</ol>

Ensaios funcionais de neutrófilos para triagem de diferentes vias de sinalização

Os autores declaram a inexistência de conflitos de interesse.

Os neutrófilos são células altamente dinâmicas e responsivas, de curta duração e ainda não podem ser criopreservados19, o que torna as investigações sobre sua biologia desafiadoras. Portanto, é essencial seguir passos cuidadosos para obter neutrófilos viáveis, enriquecidos e em repouso11,20. Este estudo empregou uma técnica de isolamento baseada em densidade que enfatiza a manipulação suave e mínima, bem como o uso de baixas temperaturas a...

Os neutrófilos são as células imunes inatas mais abundantes no sangue humano e são conhecidos por desempenhar um papel importante na infecção e inflamação, sendo os primeiros respondedores a chegar ao local do dano tecidual1. Nos últimos anos, tem havido um crescente reconhecimento do papel crucial que os neutrófilos desempenham em uma variedade de doenças e no suporte da homeostase2. Os neutrófilos não só têm sinalização fortemente regulada, mas também participam da regulação de outros componentes do sistema imune 3,4,5. Portanto, investigar os neutrófilos e suas diversas funções celulares incomuns, como quimiotaxia, migraçãoreversa6, fagocitose7, burst respiratório8 e liberação de armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs)7, é imperativo em inúmeros contextos de pesquisa onde é necessário avaliar as potenciais alterações funcionais, morfológicas ou moleculares dos neutrófilos desencadeadas por condições específicas em análise.
Os neutrófilos recém-isolados são terminalmente diferenciados, de curta duração, altamente dinâmicos e facilmente ativados9. No entanto, um método de armazenamento eficiente que não afete as respostas dos neutrófilos ainda não foi alcançado, tornando desafiadora a realização de múltiplos ensaios que devem ser ininterruptos. Além disso, análises funcionais previamentedescritas10,11, baseadas em ensaios que requerem citometria e/ou coloração fluorescente, podem não ser uma escolha viável quando uma avaliação ampla e inicial dos neutrófilos é necessária.
Para resolver essas questões, este protocolo descreve um conjunto de testes que podem ser realizados após um único processo de isolamento, incluindo a avaliação da viabilidade celular, produção de espécies reativas de oxigênio (EROs), migração em tempo real e fagocitose de Saccharomyces cerevisiae, cujos resultados podem ser usados para fundamentar estudos de seguimento aprofundados. Este procedimento, denominado NeutroFun Screen, foi projetado para abranger as principais atividades efetoras, exceto a degranulação, e pode ser concluído em um tempo médio de 4 h, incluindo 1 h de ativação. Além disso, as células remanescentes podem ser usadas para abordagens mais detalhadas, como estudos ômicos. A vantagem desse método está no equilíbrio entre rapidez, abrangência, custo e precisão.
Além disso, há uma maneira de observar facilmente uma sugestão preliminar de NETs, sem marcadores específicos, mas o suficiente para indicar se mais esforços nessa direção valeriam a pena. A diversidade de funções testadas visa combinar pontos comuns entre os testes, reduzindo o tempo de análise e os gastos. O principal objetivo deste método é fornecer uma análise funcional equilibrada em relação à velocidade, abrangência, custo e acurácia que permita uma visão geral da resposta dos neutrófilos, tornando-se um passo inicial útil na investigação dos efeitos de novos estímulos sobre os neutrófilos de densidade normal.

<table><tbody><tr><td>CIM-Plate 16</td><td>Agilent&nbsp;</td><td></td><td></td>5665825001</tr><tr><td>Leitor de Placas CLARIOstar&nbsp;</td><td>BMG LABTECH</td><td></td><td>US Patente Número 9,733,124 Detalhes do produto: Software de Análise de Dados MARS</td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido</td><td>Din&acirc; mica</td><td>1582</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>DN 25</td><td></td></tr><tr><td>Ácido etilenodiaminotetracético sal dissódico di-hidratado</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Coloração panóptica rápida</td><td>Laborclin</td><td>620529</td><td></td></tr><tr><td>Lâmina de vidro</td><td>Exacta</td><td>7102</td><td></td></tr><tr><td>Hank' s Solução salina balanceada com cálcio, com magnésio, sem vermelho de fenol.</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>55037C</td><td></td></tr><tr><td>Hank' s Solução salina balanceada sem cloreto de cálcio, sulfato de magnésio e bicarbonato de sódio.</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>H4641</td><td></td></tr><tr><td>Heparina</td><td>Blau</td><td>&nbsp; </td><td></td>7896014655229</tr><tr><td>Gabinete de fluxo laminar</td><td>Veco</td><td>VLFS-12</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio</td><td>Zeiss</td><td>415501-0101-002</td><td>Detalhes do produto: Bloco de mistura Primostar 1</td></tr><tr><td></td><td>BIOER</td><td>MB-102</td><td></td></tr><tr><td>Neubauer melhorado com linhas brilhantes</td><td>Novo Optik</td><td>1110000</td><td></td></tr><tr><td>N-formil-metionil-leucil-fenilalanina</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>F3506</td><td></td></tr><tr><td>Nitroblue tetrazólio</td><td>Neon</td><td>CAS 298-83-9</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Cytiva</td><td>17089101</td><td>meios</td></tr><tr><td>de separação Phorbol 12-miristato 13-acetato</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>P8139</td><td></td></tr><tr><td>Comprimido de solução salina tamponada com fosfato</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>ROTOFIX 32 A</td><td>Hettich</td><td>1206</td><td></td></tr><tr><td>Saccharomyces cerevisiae</td><td>Fleischmann</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Safranin</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>50240</td><td></td></tr><tr><td>Dodecil sulfato de sódio</td><td>Cytiva</td><td>17-1313-01</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td></td><td>Qsonica Q125</td><td></td></tr><tr><td>Solução azul de tripano</td><td>Vetec</td><td>C.I. 23850</td><td></td></tr><tr><td>Vortex Genie 2</td><td>Scientific Industries, Inc.</td><td>0K-0500-902</td><td></td></tr><tr><td>xCELLigence Análise Celular em Tempo Real (RTCA) DP (dupla finalidade)</td><td>Agilent&nbsp;</td><td>380601050</td><td>Detalhes do produto: Sistema RTCA composto por hardware de detecção, placas celulares e software</td></tr></tbody></table>

um conjunto de técnicas de triagem para uma rápida visão geral da função dos neutrófilos

A Set of Screening Techniques for a Quick Overview of the Neutrophil Function

Os neutrófilos são conhecidos como uma das primeiras linhas de defesa da resposta imune inata e podem desempenhar muitas funções celulares particulares, como quimiotaxia, migração reversa, fagocitose, degranulação de enzimas e metabólitos citotóxicos e liberação de DNA como armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs). Os neutrófilos não só têm sinalização fortemente regulada, mas também participam da regulação de outros componentes do sistema imunológico. Como os neutrófilos frescos são terminalmente diferenciados, de curta duração e altamente variáveis entre os indivíduos, é importante aproveitar ao máximo as amostras coletadas. Os pesquisadores muitas vezes precisam realizar ensaios de triagem para avaliar uma visão geral das muitas funções dos neutrófilos que podem ser afetadas por condições específicas sob avaliação. Um conjunto de testes seguindo um único processo de isolamento de neutrófilos de densidade normal foi desenvolvido para atender a essa necessidade, buscando um equilíbrio entre rapidez, abrangência, custo e acurácia. Os resultados podem ser usados para fundamentar e orientar estudos de seguimento aprofundados. Este procedimento pode ser realizado em um tempo médio de 4 h e inclui a avaliação da viabilidade celular, produção de espécies reativas de oxigênio (EROs), migração em tempo real e fagocitose de leveduras em lâminas de vidro, deixando células suficientes para abordagens mais detalhadas, como estudos ômicos. Além disso, o procedimento inclui uma maneira de observar facilmente uma sugestão preliminar de TNEs após coloração panóptica rápida observada por microscopia de luz, com falta de marcadores específicos, embora suficientes para indicar se esforços adicionais nesse sentido valeriam a pena. A diversidade de funções testadas combina pontos comuns entre os testes, reduzindo o tempo e os gastos da análise. O procedimento foi denominado NeutroFun Screen e, apesar de apresentar limitações, equilibra os fatores supracitados. Além disso, o objetivo deste trabalho não é um conjunto de testes definido, mas sim uma diretriz que possa ser facilmente ajustada aos recursos e demandas de cada laboratório.

O método de isolamento baseado em densidade utilizado neste estudo (Figura 1) atendeu aos critérios para os experimentos propostos. Os parâmetros neutrófilos obtidos por esse método incluíram viabilidade ≥98%, pureza ≥94% e rendimento celular ≥1,5 x 107, sem ativação detectável pelos testes de triagem. Duas etapas relevantes no isolamento dos PMNs são a anticoagulação e a remoção das hemácias. Manter o tubo de sangue anticoagulado ou a seringa em um balanço suave antes de sobrepor...

Este protocolo apresenta um conjunto de ensaios funcionais de neutrófilos para ser usado como um método de triagem para cobrir funções de diferentes vias de sinalização. O protocolo inclui uma avaliação inicial e simples da viabilidade celular, pureza, produção de espécies reativas de oxigênio, migração em tempo real, fagocitose e uma sugestão preliminar de armadilhas extracelulares para neutrófilos.

Um conjunto de técnicas de triagem para uma rápida visão geral da função dos neutrófilos

Neutrophils are known as one of the first lines of defense in the innate immune response and can perform many particular cellular functions, such as ...

O NeutroFun Screen Protocol fornece um grupo de testes funcionais que usam produtos químicos de baixo custo e podem ser realizados em um único experimento a partir de neutrófilos frescos. Isso permite uma avaliação preliminar de algumas das principais funções dos neutrófilos para orientar estudos de seguimento mais trabalhosos e caros. A pesquisa de neutrófilos emprega várias condições de modulação.Como citocinas, peptídeos, produtos microbianos e estímulos físicos. Adicionalmente, analisa citometria de fluxo, multiômica, dispositivos microfluídicos e imunocitoquímica. A extensa marca de condições e ensaios usados em combinação torna o fluxo de trabalho da pesquisa de neutrófilos longo, trabalhoso e caro.Normalmente, nessas reduções, no número de condições testadas ou no número de testes realizados, os métodos atuais de última geração exigem extensas configuráveis, muitas células e longos procedimentos de preparação. Nosso protocolo NeutroFun Screen oferece uma abordagem mais rápida e econômica para avaliar a funcionalidade celular em comparação com outros métodos. Isso é conseguido combinando várias análises dentro do protocolo, mantendo a precisão e abrangência nos resultados.Doi

a-set-screening-techniques-for-quick-overview-neutrophil

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Este vídeo demonstra um ensaio in vitro para estudar a interação neutrófilo-biofilme. As bactérias patogênicas embutidas no biofilme e neutrófilos isolados foram marcadas usando marcadores fluorescentes, e a resposta imune pelos neutrófilos e a evasão da resposta imune pelas bactérias foram avaliadas usando um microscópio de fluorescência.

Um ensaio in vitro para estudar a interação entre neutrófilos e biofilme

Este protocolo detalha um ensaio concebido para medir a quimiotaxia de neutrófilos humanos a partir de uma gota de sangue total com reprodutibilidade robusta. Esta abordagem evita a necessidade de separação de neutrófilos e requer apenas alguns minutos de ensaio tempo de preparação. O chip de microfluídica permite a medida repetida de quimiotaxia de neutrófilos ao longo do tempo em crianças ou pequenos mamíferos, onde o volume da amostra é limitado.

Plataforma microfluídica para medição de quimiotaxia de neutrófilos não transformados Sangue Total

Os neutrófilos desempenham um papel importante não apenas na defesa do hospedeiro contra microrganismos invasores, mas também estão envolvidos na vigilância imunológica das células tumorais. Aqui, descrevemos técnicas relacionadas ao isolamento de neutrófilos com propriedades antitumorais e métodos para monitorar a função de neutrófilos antitumorais in vitro e in vivo.

Isolamento e Caracterização de neutrófilos com propriedades anti-tumorais

Este artigo fornece o método detalhado de realização de um teste rápido de quimiotaxis de neutrófilos integrando o isolamento de neutrófilos no chip do sangue total e o teste de quimiotaxia em um único microfluídico.

Um método All-on-chip para análise rápida de quimiotaxis de neutrófilos diretamente de uma gota de sangue

Aqui, apresentamos um protocolo para detectar a presença de neutrófilos em seções fixas/permeabilizado histologia e avaliar o estado de ativação de neutrófilos purificados ao vivo. Em particular, o peptídeo de40 MUB vincula lactoferrina presente nos grânulos neutrófilos específicos e terciários. Exposição do conteúdo do grânulo através de permeabilização ou ativação de neutrófilos permite a marcação de neutrófilos.

O peptídeo de40 MUB para uso na detecção de eventos inflamação mediada por neutrófilos

Este protocolo gera micromatrizes de biopartículas que fornecem enxame de neutrófilos espacialmente controlados. Ele fornece fácil acesso aos mediadores que os neutrófilos liberam durante a migração e permite análise quantitativa de imagem.

Micromatrizes de biopartículas para análise quimiotática e molecular de swarming de nêutrons humanos in vitro

Este protocolo descreve um método de triagem de alto rendimento baseado em citometria de fluxo para identificar drogas de moléculas pequenas que inibem a ativação de integrinas β2 em neutrófilos humanos.

Uma Técnica de Alto Rendimento Baseada em Citometria de Fluxo para Triagem de Drogas Inibidoras de Integrinas

Apresenta-se aqui um protocolo para a indução e análise de armadilhas extracelulares (TNEs) de neutrófilos in vitro . A quantificação do DNA, da catelicidina (LL37) e da atividade enzimática produziu dados que mostram a variabilidade na composição e morfologia dos TNEs induzidos por estímulos microbianos e químicos em condições controladas semelhantes.

Análise morfológica e composicional de armadilhas extracelulares de neutrófilos induzidas por estímulos microbianos e químicos

Apresentamos um método automatizado de alto rendimento para quantificar armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs) utilizando o sistema de análise de células vivas, juntamente com uma abordagem dual-dye dependente de permeabilidade de membrana.

Técnica de Alto Rendimento em Tempo Real para Quantificar a Formação de Armadilhas Extracelulares de Neutrófilos em Neutrófilos Humanos

Este protocolo definido descreve uma abordagem de microscopia de alto rendimento em tempo real para visualizar e quantificar a liberação de armadilha extracelular de neutrófilos humanos (NET) in vitro. O método reprodutível permite a investigação das características e cinética da liberação de NET após estimulação com indutores distintos de NETosis e permite a avaliação da farmacologia dos antagonistas da NETosis.

Quantificação microscópica em tempo real e de alto rendimento da liberação de armadilhas extracelulares de neutrófilos humanos e avaliação da farmacologia dos antagonistas

Os neutrófilos de baixa densidade (LDN) aumentam significativamente em várias doenças. Os LDN são geralmente isolados por meio de classificação de células. Apresentamos um método prático para obter LDN puro e viável. Após a centrifugação do sangue periférico com gradiente de densidade, as células são incubadas com microesferas magnéticas e, em seguida, o LDN é separado por meio de colunas magnéticas.

Método rápido de microesferas magnéticas para purificação eficiente de neutrófilos de baixa densidade

Aprenda o protocolo NeutroFun para triagem funcional de neutrófilos usando reagentes de baixo custo. Este método avalia viabilidade, migração, fagocitose e produção de espécies reativas de oxigênio em tempo real.

Um conjunto de técnicas de triagem para uma rápida visão geral da função dos neutrófilos

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