Un método QuEChERS-HPLC modificado para la detección de hidrocarburos aromáticos policíclicos en embriones de pez cebra expuestos a partículas finas

Esta investigación tiene como objetivo desarrollar un método QuEChERS-HPLC modificado para cuantificar los HAP en embriones de pez cebra expuestos a MOE, abordando la brecha actual causada por los desafíos técnicos en la medición de los niveles internos de HAP debido al tamaño de masa de los embriones y la complejidad de su matriz biológica. La obtención de resultados fiables requiere 200 embriones por grupo, lo que supone un reto práctico. La combinación de HPLC con detector de fluorescencia podría mejorar aún más la sensibilidad del método. En comparación con otras técnicas, este método modificado QuEChERS-HPLC reduce significativamente el tiempo de suspensión de la muestra y proporciona un enfoque rápido y eficiente para analizar los niveles de 16 HAP en embriones de pez cebra expuestos a EOM.

[Narrador] Para empezar, prepare la muestra QuEChERS sacando los platos que contienen los embriones del incubador a las 72 horas después de la fecundación. Lavar los embriones tres veces con agua pura. Transfiera los embriones a tubos de 1,5 mililitros y elimine el exceso de agua. Coloque los tubos en un congelador a menos 80 grados centígrados durante 30 minutos para liofilizar los embriones. Después de la liofilización, muele los embriones con una varilla de vidrio. Agregue 25 microlitros de 16 hidrocarburos aromáticos policíclicos, o HAP, mezcla de solución estándar al grupo de control de DMSO para probar la recuperación de picos. Luego, agregue un mililitro de n-hexano y vórtice durante 30 segundos. Ultrasonique la mezcla a 35 grados centígrados durante 30 minutos. Ahora, centrifuga la muestra a 7.000g durante cinco minutos. Transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo. Evapore los sobrenadantes recolectados hasta que se sequen bajo el flujo de nitrógeno en un baño de agua a 35 grados centígrados. Agregue un mililitro de acetonitrilo y vórtice durante 30 segundos. Agregue 10 miligramos de amina secundaria primaria, 45 miligramos de sulfato de magnesio y 15 miligramos de empaque de C18 a la muestra, luego haga un vórtice durante 30 segundos. Centrifugar a 7.000 g durante cinco minutos y transferir el sobrenadante a un tubo nuevo. Evapore el sobrenadante a 0,5 mililitros bajo nitrógeno y filtre la muestra a través de una membrana microporosa de 0,22 micrómetros. Prepare una serie de soluciones de trabajo que van de uno a 500 nanogramos por mililitro para el estándar de mezcla de 16 HAP utilizando acetonitrilo. Inyecte 20 microlitros de las soluciones de muestra en un cromatógrafo líquido utilizando una fase de acetonitrilo o aguamóvil y siga el procedimiento de elución que se muestra en la pantalla. Trace una curva estándar con concentraciones de masa de las soluciones de trabajo estándar en el eje x y las áreas de pico correspondientes en el eje y, que cubren un rango de cinco nanogramos por mililitro a 500 nanogramos por mililitro. Inyecte la muestra purificada en el cromatógrafo de líquidos equipado con un detector de fluorescencia, o FLD, y un detector de matriz de diodos, o DAD. Identifique la presencia de HAP comparando los tiempos de retención. Mida las áreas de pico para determinar la concentración. Finalmente, calcule las concentraciones internas de los 16 HAP en función de las concentraciones de masa medidas. En esta tabla se indican las concentraciones de hidrocarburos aromáticos policíclicos, o HAP, en embriones de pez cebra a las 72 horas después de la fertilización. Se detectaron con éxito seis HAP en embriones de pez cebra expuestos a materia orgánica extraíble, o EOM. En contraste, solo se identificaron dos HAP en las muestras de control de DSMO, a niveles significativamente más bajos que los de las muestras EOM.