Evaluación de las respuestas foliares a metabolitos microbianos secundarios utilizando un formato de alto rendimiento

Mi laboratorio trabaja en las interacciones entre microbios vegetales con el objetivo final de mejorar la resistencia de los cultivos de foca mediante genética. Desarrollos recientes han demostrado que los metabolitos microbianos secundarios desempeñan un papel clave en la promoción de la susceptibilidad o resistencia de las plantas. Para empezar, utiliza un tubo de corcho de cuatro milímetros de diámetro para recoger tres discos de hoja por planta, evitando la vena media.

Con la punta afilada, aplica un movimiento de torsión para evitar que el tejido se macere. Añadir metabolitos secundarios o tratamientos con disolventes a la concentración deseada en pozos individuales de una placa de 96 pozos para alcanzar un volumen final de 200 microlitros. Coloca suavemente los discos de hojas en los pozos.

Coloque la placa de 96 pozos con la tapa retirada en un juguete equipado con una boquilla de vacío. Luego, conecta la manguera de vacío a la boquilla del jarro de campana y activa la presión de vacío a 9,8 libras por pulgada cuadrada durante 10 segundos. Apaga el vacío y libera la presión lentamente durante 10 segundos, y luego repite el ciclo de vacío.

Ahora vuelve a colocar la tapa en la placa de 96 pozos e incubarla en un agitador orbital bajo una fuente de luz. Posición 23 centímetros por encima del agitador durante cuatro horas. Lava la sonda con agua ultrapura y dale un toque suave en una toallita sin pelusa para que se seque.

Fíjate en la lectura de conductividad del agua para futuras referencias. Entre cuatro y seis horas después del tratamiento, se mide y registra la conductividad en pozos individuales sumergiendo la sonda en el líquido que rodea el disco de la hoja. Sujeta la placa en un ángulo de 45 grados para asegurarte de que la sonda está completamente inmersa.

Tras enjuagar la sonda se ha demostrado antes, de vez en cuando se prueba la conductividad del agua para confirmar la estabilidad de la sonda. Luego, coloca una película plástica para el techo sobre la placa de 96 pozos y devuelva al agitador orbital para incubación durante la noche. Para preparar el sustrato de peroxidasa, calienta 40 mililitros de agua estéril destilada a 70 grados Celsius en un vaso con una barra de agitación.

Disuelva 50 miligramos de cinco aminoácido salicílico en agua caliente. Luego, añade agua adicional para llevar el volumen total a 50 mililitros y ajusta el pH a seis usando hidróxido de sodio. Protege la solución fotosensible cubriendo el recipiente con papel de aluminio.

En un tubo cónico ámbar de 50 mililitros, preparar una solución de peróxido de hidrógeno al 1% en agua ultrapura. Luego, añadir 10 microlitros de la solución de peróxido de hidrógeno al 1% por mililitro de la solución de cinco aminosalicílicos necesaria para generar el medio de ensayo. En el momento deseado, mezcla cinco veces y luego transfiere 50 microlitros de cada pozo de la placa de muestra a una nueva placa.

Añade 50 microlitros del medio de ensayo y incuba a temperatura ambiente durante tres minutos. Para detener la reacción, añadir 20 microlitros de dos hidróxidos de sodio normales a cada pozo y usar un lector de placas para medir la absorbancia de cada pozo a 595 nanómetros. El agua y el sulfóxido de dimetil al 0,1% produjeron niveles similares de fuga iónica y actividad peroxidasa, validando su uso como controles negativos.

El tratamiento con un micromolar FLG 22 indujo significativamente fuga iónica, actividad de peroxidasa y producción de calosa, confirmando que era un control positivo robusto. El tratamiento con gramilina indujo una fuga de iones significativa y una producción de calosa, pero tuvo efectos variables sobre la actividad de la peroxidasa. La surfactina a 10 micromolares indujo tanto la actividad de la peroxidasa como la producción de calosa, mientras que la fuga de iones permaneció sin cambios.

El tratamiento con toxina T-2 suprimía la actividad de la peroxidasa, mientras inducía la producción de calosas y no tenía impacto en la fuga de iones. Nuestro hidroensayo permite a los investigadores muestrear tres respuestas diferentes al estrés en la misma muestra, lo que permite a los investigadores aprovechar cantidades limitadas de metabolitos microbianos secundarios. La capacidad de comparar 96 muestras en la misma placa permite a los investigadores realizar cribados a nivel de genética poblacional, o biología de sistemas, para entender las interacciones entre microbios vegetales.

Mi investigación continuará centrada en las interacciones entre microbios vegetales y en la caracterización de los genes vegetales que podemos aprovechar para desarrollar resistencia a enfermedades en cultivos cerealicos.