Name: membrane proteins in liposome models
Uploaded: 2023-04-30T06:31:34.000Z
Duration: 7 min 5 s
Channel: JoVE

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HS-LS1-3.

Reconstitution of Membrane Proteins

reconstitution des protéines membranaires

Reconstitution est le processus du retour une biomolécule isolé à sa forme ou sa fonction originale. Ceci est particulièrement utile pour l’étude des protéines membranaires qui permettent les fonctions cellulaires importantes et influent sur le comportement des lipides à proximité. Pour étudier la fonction des protéines de la membrane purifiée sur place, ils doivent être reconstitués en les intégrant dans une membrane lipidique artificielle.
Cette vidéo présente les concepts de reconstitution de protéines membranaires et les procédures connexes, tels que l’isolement de protéine à l’aide d’un détergent, formation de vésicules artificielles à l’aide de lipides, incorporation de la protéine isolée dans la vésicule artificielle et la séparation du détergent de la solution. Enfin, les deux applications sont couvertes : reconstitution des protéines de transport membranaire et reconstitution des protéines de récolte de la lumière.
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Reconstitution est le processus de restauration d’une biomolécule isolé à sa forme originale ou sa fonctionnalité. Cette approche est souvent utilisée lors de l’étude des protéines membranaires qui permettent de nombreux processus cellulaires importants et affectent le comportement des lipides voisines. Cependant, la complexité de l’environnement de la cellule est difficile membrane fonctions protéiques d’étudier in situ. Les protéines peuvent être extraites et purifiées, mais leurs fonctions réelles ne peuvent être évaluées sans une membrane. Les protéines membranaires isolées sont donc reconstitué par l’intégration dans une membrane lipidique artificielle, par exemple un liposome. Cette vidéo va présenter les principes de reconstitution des protéines membranaires, une procédure de reconstitution générale et quelques applications en biochimie.
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Membranes cellulaires se composent principalement de phospholipides et de protéines membranaires. Les phospholipides forment une bicouche dont les têtes de phosphate hydrophile interagissent avec l’aqueux intérieur et l’extérieur de la cellule, alors que les queues hydrophobes des acides gras interagissent entre eux dans la bicouche.
Certaines protéines de la membrane n’interagissent avec la membrane par des interactions électrostatiques ou non covalentes. D’autres, appelés « protéines intégrale », sont insérées dans la bicouche lipidique.
Comme la bicouche, protéines de l’integral ont les extrémités hydrophiles et hydrophobe Centre et sont maintenus en place par des interactions hydrophobes. Protéines intégrale qui s’étendent sur l’ensemble membrane sont connus comme « protéines transmembranaires ».
Les interactions entre ces protéines et la membrane sont si fortes que même lyser les cellules ne se séparera pas eux. Un agent tensio-actif spécial appelé un détergent est utilisé pour extraire les protéines. Similaires aux phospholipides, détergents ont la tête hydrophile et lipophile queues et peuvent entrer librement dans la membrane.
À l’intérieur de la membrane, les queues lipophiles du détergent interagissent avec le noyau de protéines hydrophobes. Il entoure la protéine avec une coquille des chefs détergents hydrophiles, qui perturbe les interactions protéines-lipides.
Le complexe protéine-détergent est maintenant facilement séparé de la membrane. Le détergent rend le complexe soluble dans des solutions aqueuses et prêts pour la reconstitution dans une membrane artificielle.
Les protéines sont souvent reconstitués dans les membranes des liposomes, qui sont des vésicules artificielles. Pour préparer les liposomes, lipides séchées sont hydratés et agités pour induire la formation de vésicules. Lorsqu’un détergent est ajouté, il est incorporé dans les membranes de liposome.
Pour reconstituer les protéines, les protéines solubilisées et les liposomes sont combinés, et puis le détergent est supprimé de la solution de dialyse ou adsorption chimique. Les protéines et les liposomes assemblent rapidement dans des protéoliposomes, alors que les groupes hydrophiles sont exposés. Les protéines fonctionnent alors puisqu’ils dans une membrane cellulaire et peuvent être étudiées isolément.
Maintenant que nous avons couvert les rudiments de la reconstitution de la protéine, Let ' s go via un protocole pour la reconstitution des protéines de la membrane dans les liposomes.
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Pour commencer à isoler les protéines de la membrane, les cellules sont lysées. Ininterrompue de cellules est éliminée par centrifugation.
Le surnageant est centrifugé à une vitesse supérieure pour granuler les membranes. Le culot est remises en suspension et ajouter un détergent pour extraire les protéines.
Les débris restants de la cellule sont enlevée par centrifugation supplémentaire. La protéine est purifiée à partir du surnageant par chromatographie sur colonne et ensuite concentrée ou purifiée davantage selon les besoins.
Pour commencer à préparer les liposomes, une suspension des phospholipides dans un solvant organique est séchée sous azote ou argon.
Les phospholipides sont hydratés avec tampon d’hydratation, et le mélange est sonication pour achever la création les liposomes.
Un détergent est ajouté à solubiliser les liposomes, qui se combine alors avec les protéines.
Le détergent est ensuite retiré par adsorption sur des billes de polystyrène, dialyse ou une colonne de liaison de détergent. Les protéoliposomes qui en résultent sont prêts à être purifié et utilisé dans des expériences ultérieures.
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Maintenant que vous êtes familier avec les bases d’une procédure de reconstitution de protéines membranaires, regardons quelques applications de reconstitution de la protéine en biochimie.
Une protéine de membrane-transport a été reconstituée pour acquérir une compréhension plus claire de son mécanisme de transport. Sa reconstitution après fonction a été vérifiée avec un efflux des ions iodure. Ensuite, l’activité de transport a été étudiée en présence de divers inhibiteurs du canal ionique petite molécule et potentialisateurs. De cette façon, les contacts directs de ces petites molécules avec la protéine de transport pourraient être étudiées.
Chlorophylle et protéines membranaires caroténoïde chez les plantes récoltent lumière, promouvoir la séparation des charges et atténuer les dégâts légers. En reconstituant ces protéines de récolte de la lumière, leur dynamique et l’interaction avec pigments pliantes peuvent être étudiés. Les protéines de lumière reconstitués avec cette technique avaient des propriétés optiques très similaires aux protéines natives. Spectroscopie d’émission de fluorescence permet ensuite d’étudier le transfert d’énergie des pigments aux protéines lumière reconstitués.
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Vous avez juste regardé les vidéo de JoVE sur la reconstitution des protéines membranaires. Reconstitution est un moyen de transférer des protéines importantes à un imitateur de cellule pour complément d’enquête. Cette vidéo a couvert les principes de reconstitution de la protéine, un protocole de reconstitution et quelques applications en biochimie. Merci de regarder !
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Reconstitution des protéines membranaires

Reconstitution is the process of returning an isolated biomolecule to its original form or function. This is particularly useful for studying membrane ...

La reconstitution est le processus de restauration d’une biomolécule isolée à sa forme ou à sa fonctionnalité d’origine. Cette approche est souvent utilisée lors de l’étude des protéines membranaires, qui permettent de nombreux processus cellulaires importants et affectent le comportement des lipides voisins. Cependant, la complexité de l’environnement cellulaire rend les fonctions des protéines membranaires difficiles à étudier « in situ ». Les protéines peuvent être extraites et purifiées, mais leurs fonctions réelles ne peuvent pas être évaluées sans membrane. Par conséquent, les protéines membranaires isolées sont « reconstituées » par intégration dans une membrane lipidique artificielle, telle qu’un liposome. Cette vidéo présentera les principes de la reconstitution des protéines membranaires, une procédure générale de reconstitution et quelques applications en biochimie. Les membranes cellulaires sont principalement constituées de phospholipides et de protéines membranaires. Les phospholipides forment une bicouche dans laquelle les têtes de phosphate hydrophiles interagissent avec l’intérieur et l’extérieur aqueux de la cellule, tandis que les queues d’acides gras hydrophobes interagissent entre elles dans la bicouche. Certaines protéines membranaires n’interagissent avec la membrane que par des interactions électrostatiques ou non covalentes. D’autres, appelées « protéines intégrales », sont intégrées dans la bicouche lipidique. Comme la bicouche, les protéines intégrales ont des extrémités hydrophiles et un centre hydrophobe, et sont maintenues en place par des interactions hydrophobes. Les protéines intégrales qui s’étendent sur toute la membrane sont appelées « protéines transmembranaires ». Les interactions entre ces protéines et la membrane sont si fortes que même la lyse des cellules ne les séparera pas. Un tensioactif spécial appelé détergent est utilisé pour extraire les protéines. Semblables aux phospholipides, les détergents ont des têtes hydrophiles et des queues lipophiles, et peuvent pénétrer librement dans la membrane. À l’intérieur de la membrane, les queues lipophiles du détergent interagissent avec le noyau protéique hydrophobe. Celle-ci entoure la protéine d’une coquille de têtes détergentes hydrophiles, ce qui perturbe les interactions protéine-lipide. Le complexe protéine-détergent se sépare maintenant facilement de la membrane. Le détergent rend le complexe soluble dans des solutions aqueuses et prêt à être reconstitué dans une membrane artificielle. Les protéines sont souvent reconstituées dans les membranes des liposomes, qui sont des vésicules artificielles. Pour préparer les liposomes, les lipides séchés sont hydratés et agités pour induire la formation de vésicules. Lorsqu’un détergent est ajouté, il est incorporé dans les membranes des liposomes. Pour reconstituer la protéine, les protéines solubilisées et les liposomes sont combinés, puis le détergent est retiré de la solution par dialyse ou adsorption chimique. Les protéines et les liposomes s’assemblent rapidement en protéoliposomes, de sorte que seuls les groupes hydrophiles sont exposés. Les protéines fonctionnent alors comme elles le feraient dans une membrane cellulaire et peuvent être étudiées de manière isolée. Maintenant que nous avons couvert les bases de la reconstitution des protéines, passons en revue un protocole de reconstitution des protéines membranaires dans les liposomes. Pour commencer à isoler les protéines membranaires, les cellules sont lysées. Les cellules non brisées sont éliminées par centrifugation. Le surnageant est centrifugé à une vitesse plus élevée pour granuler les membranes. Le granulé est remis en suspension et un détergent est ajouté pour extraire les protéines. Les débris cellulaires restants sont éliminés par centrifugation supplémentaire. La protéine est purifiée du surnageant par chromatographie sur colonne, puis concentrée ou purifiée davantage selon les besoins. Pour commencer à préparer les liposomes, une suspension de phospholipides dans un solvant organique est séchée sous de l’azote ou de l’argon. Les phospholipides sont hydratés avec un tampon d’hydratation, et le mélange est soniqué pour finir de créer les liposomes. Un détergent est ajouté pour solubiliser les liposomes, qui sont ensuite combinés avec les protéines. Le détergent est ensuite éliminé par adsorption sur des billes de polystyrène, une dialyse ou une colonne de liaison détergente. Les protéoliposomes résultants sont prêts à être purifiés et utilisés dans des expériences ultérieures. Maintenant que vous connaissez les bases d’une procédure de reconstitution de protéines membranaires, examinons quelques applications de la reconstitution des protéines en biochimie. Une protéine de transport membranaire a été reconstituée pour mieux comprendre son mécanisme de transport. Sa fonction post-reconstitution a été vérifiée avec un efflux d’ions iodure. Ensuite, l’activité de transport a été étudiée en présence de divers inhibiteurs et potentialisateurs de canaux ioniques à petites molécules. De cette façon, les interactions directes de ces petites molécules avec la protéine de transport ont pu être étudiées. La chlorophylle et les protéines membranaires liant les caroténoïdes dans les plantes récoltent la lumière, favorisent la séparation des charges et atténuent les dommages causés par la lumière. En reconstituant ces protéines collectrices de lumière, leur dynamique de repliement et leur interaction avec les pigments peuvent être étudiées. Les protéines collectrices de lumière reconstituées avec cette technique avaient des propriétés optiques très similaires à celles des protéines natives. La spectroscopie d’émission de fluorescence peut ensuite être utilisée pour étudier le transfert d’énergie des pigments vers les protéines reconstituées qui collectent la lumière. Vous venez de regarder la vidéo de JoVE sur la reconstitution des protéines membranaires. La reconstitution est un moyen de transférer des protéines importantes à une imitation cellulaire pour une enquête plus approfondie. Cette vidéo couvrait les principes de la reconstitution des protéines, un protocole de reconstitution et quelques applications en biochimie. Merci d’avoir regardé !

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membrane proteins in liposome models

Membrane proteins can be moved into liposome models so their function can be studied outside a cell. Reconstitution means restoring an isolated biomolecule to a working form. For membrane proteins, that usually means placing a purified protein into an artificial lipid membrane.

Cell membranes are made mainly of phospholipids and membrane proteins. The phospholipids form a bilayer with hydrophilic phosphate heads facing water and hydrophobic fatty acid tails facing inward. Some membrane proteins attach by noncovalent or electrostatic interactions, while integral proteins are embedded in the bilayer. Transmembrane proteins are integral proteins that span the full membrane, and their strong interactions with the membrane are not broken just by lysing cells.

Detergent is used to extract these proteins. Detergents have hydrophilic heads and lipophilic tails, so they can enter the membrane. Their tails interact with the hydrophobic protein core and surround it with detergent heads, which breaks protein-lipid interactions. The protein-detergent complex becomes soluble in water and is ready for reconstitution.

Liposomes are artificial vesicles often used for this step. They are made by hydrating dried lipids and agitating them to form vesicles. When detergent is added, it becomes part of the liposome membrane. The purified protein and liposomes are then mixed, and the detergent is removed by dialysis or chemical adsorption. As the detergent leaves, the protein and lipids assemble into proteoliposomes, with hydrophilic groups exposed to water. The reconstituted proteins can then work in a membrane-like setting and be studied in isolation.

A general liposome protocol starts with cell lysis. Unbroken cells are removed by centrifugation, and the membranes are pelleted at higher speed. The pellet is resuspended, detergent is added to extract the proteins, and more centrifugation removes leftover debris. The protein is then purified by column chromatography and concentrated if needed.

Liposome preparation follows a separate path. Phospholipids in organic solvent are dried under nitrogen or argon, then hydrated with buffer. Sonication finishes the liposome formation. After detergent is added to solubilize the liposomes, the proteins are combined with them. The detergent is removed with polystyrene beads, dialysis, or a detergent-binding column, leaving proteoliposomes that can be purified and used in later experiments.

Reconstituted membrane proteins have several uses in biochemistry. One transport protein was reconstituted to better understand how it moves molecules. Its activity was checked by the efflux of iodide ions. Researchers also tested small-molecule ion channel inhibitors and potentiators to study how they interact with the transport protein directly.

Plant light-harvesting proteins are another example. These chlorophyll- and carotenoid-binding membrane proteins help harvest light, support charge separation, and reduce light damage. After reconstitution, scientists can study folding dynamics and pigment interactions. The reconstituted proteins showed optical properties very similar to native proteins, and fluorescence emission spectroscopy can be used to follow energy transfer from pigments to the proteins.

Membrane Proteins in Liposome Models

dialysis: diffusion based separation

Dialysis for Buffer Exchange in Biochemistry

Dialysis is a common biochemistry technique for buffer exchange and desalting. It separates molecules by diffusion through a semipermeable membrane, which lets small molecules pass while holding larger biomolecules inside the sample. The membrane is the key part of the setup. Its pores create a molecular weight cutoff, so a membrane such as a 10 kDa membrane usually keeps molecules larger than 10 kilodaltons inside. This cutoff is not exact, because membranes have a range of pore sizes.

enzyme assays and kinetics

Measuring Enzyme Reaction Rates

Enzyme reaction rates can be measured with assays that track how substrate or product levels change over time. Enzymes are proteins, or sometimes RNAs, that speed up chemical reactions by lowering the activation energy needed to start them. They act on a specific substrate and help form a product that supports life processes. Enzymatic reactions are often described in three steps. First, the substrate binds to the enzyme active site and forms an enzyme-substrate complex. That complex can fall...

maldi-tof mass spectrometry

How MALDI-TOF Reads Biomolecules

MALDI-TOF mass spectrometry reads biomolecules by using a laser, a matrix, and a time-of-flight analyzer. MALDI, or matrix-assisted laser desorption ionization, helps fragile molecules keep their structure while they are moved into the mass analyzer. The analyzer then separates compounds based on size and charge. In MALDI, the sample is mixed into a matrix, usually an organic compound with aromatic and conjugated double bonds. A laser pulse strikes the spot, and the matrix absorbs most of the...

tandem mass spectrometry

Tandem Mass Spectrometry for Biomolecule Analysis

Tandem mass spectrometry is used to isolate a biomolecule and break it into smaller pieces so its makeup can be studied. Because biomolecules often have large, complex structures, it can be hard to identify their molecular composition and sequence from a single measurement. By linking mass spectrometers in series, the technique first selects one ion and then analyzes the fragments it produces. The process starts with an ion source that converts the sample into ions. A mass analyzer then...

protein crystallization

Protein Crystals for Structure Analysis

Protein crystals help scientists study protein structure and function. A crystal is a solid lattice made from purified protein molecules. These crystals are useful in structural biology because they reveal details that methods like mass spectrometry and SDS-PAGE cannot show on their own. Protein crystallization is paired with recombinant protein expression and x-ray diffraction to support this work. The process starts with a large amount of very pure protein. Researchers often make that...

chromatography-based biomolecule purification methods

chromatography-based-biomolecule-purification-methods

Protein Purification with SEC and IMAC

Protein purification with size-exclusion chromatography and affinity chromatography helps isolate biomolecules from complex mixtures. These methods are common in biochemistry because purified samples are needed before a biomolecule’s properties and activity can be studied. The video focuses on the principles behind size-exclusion chromatography, affinity chromatography, and immobilized metal affinity chromatography, or IMAC. Size-exclusion chromatography, or SEC, separates molecules by size. A...

two-dimensional gel electrophoresis

Protein Mapping with 2D Gel Electrophoresis

Protein mapping with 2D gel electrophoresis separates complex protein mixtures across two steps. The method combines isoelectric focusing, or IEF, with sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, or SDS-PAGE. Together, these methods can resolve thousands of biomolecules from a single sample by their isoelectric point and molecular weight. The first dimension is IEF. Each protein has an isoelectric point, or pI, which is the pH where its net charge is zero. Proteins are loaded...

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Tracking Cell Chemistry with Metabolic Labels

Metabolic labeling tracks cell chemistry by using chemical analogs that cells take up and build into biomolecules. These labels help scientists follow biochemical changes and modifications inside cells. The labeled products can then be studied with tools such as SDS-PAGE and NMR to learn more about metabolic pathways. Several labeling strategies are shown here. Isotopic labeling uses analogs that match the natural molecule but contain uncommon isotopes, such as carbon-13 and nitrogen-15 in an...

electrophoretic mobility shift assay (emsa)

electrophoretic-mobility-shift-assay-emsa

Detecting Protein-DNA Binding by EMSA

Electrophoretic mobility shift assay, or EMSA, is a biochemical method used to detect binding between proteins and nucleic acids. It is also called a gel shift assay. The test compares how a labeled nucleic acid moves through a gel before and after it binds a protein. EMSA is used to see whether a specific protein binds to a specific nucleic acid. First, the nucleic acid is labeled to make a probe. The transcript describes radioactive phosphorus-32 as a common label. The probe is then mixed...

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Measuring Protein Concentration with Absorbance

Measuring protein concentration with absorbance is a key step in many biochemical assays. Photometric methods use the fact that samples with more light-absorbing material transmit less light. Because concentration and absorption are directly related, this makes it possible to measure an unknown sample. The core idea comes from the Beer-Lambert Law. This law states that the concentration of a light-absorbing species is proportional to its absorbance. The video also introduces the Bradford assay...

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Sucrose Gradient Separation in an Ultracentrifuge

Sucrose gradient separation in an ultracentrifuge is a lab method for isolating cell parts and biomolecules. It uses differences in density to make particles sink or rise in a liquid. A high-speed ultracentrifuge speeds up this process so components can be separated without destroying them. The basic idea starts with a suspension, which is particles mixed in a liquid solvent. Particles that are denser than the solvent sediment, while less dense particles float. A rotor inside the...

co-immunoprecipitation and pull-down assays

co-immunoprecipitation-and-pull-down-assays

Protein Interaction Capture Methods in Cells

Co-immunoprecipitation and pull-down assays are laboratory methods used to capture stable protein-protein interactions. Protein-protein interactions help control many biological functions, but many of them have not yet been identified. These assays are related to immunoprecipitation, which isolates a target protein from a mixed sample using an antibody. In co-immunoprecipitation, or CoIP, an antibody binds the target protein, and that protein is already attached to another protein that the...

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Membrane proteins can be moved into liposome models so their function can be studied outside a cell. Reconstitution means restoring an isolated biomolecule to a working form. For membrane proteins, that usually means placing a purified protein into an artificial lipid membrane. Cell membranes are made mainly of phospholipids and membrane proteins. The phospholipids form a bilayer with hydrophilic phosphate heads facing water and hydrophobic fatty acid tails facing inward. Some membrane...

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FRET as a Molecular Ruler in Cells

Föster resonance energy transfer, or FRET, is a way to study close-range biochemical interactions using light-emitting molecules. A donor fluorophore can pass energy to an acceptor fluorophore when their emission and absorption spectra overlap. This transfer happens only when the pair is very close together, usually within 10 nm. Because FRET depends on distance, it is often called a molecular or spectroscopic ruler. The strength of the signal is measured as FRET efficiency, which describes...

surface plasmon resonance (spr)

SPR Biosensors for Tracking Binding Kinetics

Surface plasmon resonance, or SPR, is a way to track biomolecular binding on a label-free biosensor. It is used to measure molecular affinity, kinetics, specificity, and concentration. The method works with a thin metal layer on a prism, where changes in reflected light reveal interactions in real time. SPR sensors use a thin layer of a noble metal on the face of a prism. Light is reflected from the prism-metal interface into a photodetector. At one specific angle, called the surface plasmon...

biochemistry

Cette collection présente des méthodes de purification couramment utilisées, comme la chromatographie d'affinité, ainsi que des méthodes analytiques, comme le MALDI-TOF. En outre, les vidéos présentent des méthodes permettant d'évaluer l'interaction et la fonction des biomolécules, telles que la co-immunoprécipitation et le marquage métabolique.

See how membrane proteins are extracted with detergent and reinserted into liposomes so students can study transport and light-harvesting function.

Membrane Proteins in Liposome Models | JoVE K12

matter-and-energy-in-organisms-and-ecosystems

Matter and Energy in Organisms and Ecosystems

HS-LS1-5.

HS-LS1-6.

Overview

Principles of Membrane Protein Reconstitution

Protocol for Reconstitution of Membrane Proteins in Liposomes

Applications

Summary

Characteristics of Life

Biology is a natural science that studies life and living organisms, including their structure, function, development, interactions, evolution, ...

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Cell Structure

Background
Cells represent the most basic biological units of all organisms, whether it be simple, single-celled organisms like bacteria, or large, ...

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Visualizing Onion and Human Cells
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What are Cells?

Cell Diversity

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Nucleic Acids

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Base-pairing and DNA Repair

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Development and Reproduction of the Laboratory Mouse

Successful breeding of the laboratory mouse (Mus musculus) is critical to the establishment and maintenance of a productive animal colony. Additionally, ...

Construct an explanation based on evidence for how the structure of DNA determines the structure of proteins which carry out the essential functions of life through systems of specialized cells.

HS-LS1-1.

Membrane Proteins in Liposome Models

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