Name: detecting protein-dna binding by emsa
Uploaded: 2023-04-30T06:31:38.000Z
Duration: 6 min 57 s
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Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA)

le retard sur gel (emsa)

L’analyse de décalage de mobilité électrophorétique (EMSA) est une procédure biochimique utilisée pour élucider la liaison entre les protéines et les acides nucléiques. Dans cet essai un radiomarquées acides nucléiques et des protéines de test sont mélangés. Liaison est déterminée au moyen de l’électrophorèse sur gel qui sépare les composants basés sur la masse, charge et conformation.
Cette vidéo montre les notions d’EMSA et une procédure générale, y compris la détection, la liaison, l’électrophorèse et préparation de gel et de protéines. Les applications couvertes dans cette vidéo comprennent l’analyse des enzymes de remodelage de la chromatine, a mis à jour le EMSA qui intègre biontinylation et l’étude des sites des régulateurs bactériens réponse de liaison.
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L’AESM, l’analyse de décalage de mobilité électrophorétique, également connu sous le nom l’analyse de décalage de gel, est une procédure biochimique polyvalente et sensible. EMSA élucide la liaison entre les protéines et les acides nucléiques en détectant un changement dans les bandes en électrophorèse sur gel.
Cette vidéo décrit les principes de l’AESM, prévoit une procédure générale et traite de certaines applications.
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Réplication de l’ADN, transcription et de réparation, ainsi qu’ARN est des processus biochimiques tout critiques. Ils sont tous impliquent la liaison entre les protéines et les acides nucléiques. Beaucoup de maladies graves et de troubles sont associés à des modifications dans cette liaison. L’AESM est une technique pour la détermination qualitative si une protéine spécifique se lie à un acide nucléique. Tout d’abord, l’acide nucléique est étiqueté, généralement avec le phosphore radioactif-32, pour créer une sonde. Ensuite, le test de protéine et acide nucléique sonde sont mélangés. Lorsqu’une protéine se lie à une acide nucléique de sonde, le complexe qui en résulte a une plus grande masse et une conformation différente que l’acide nucléique seul.
Une fois lié, les complexes sont analysés par électrophorèse sur gel. Dans cette technique, un champ électrique force macromolécules à migrer sur une matrice de gel. Les composants séparent sur la base de masse, charge et conformation. L’électrophorèse peut séparer des complexes protéine-ADN de sondes non liés. Puisqu’ils ont des conformations et masses différentes, ils migrent à travers le gel à des rythmes différents et séparés. La séparation est facile à déceler, grâce à la présence du phosphore radioactif et prouve que la protéine se lie avec succès à l’acide nucléique donné. Pour vérifier l’identification de la protéine, un « supershift » utilise un anticorps avec une affinité connue à la protéine. Cela a l’avantage supplémentaire de passer outre le complexe, en augmentant la résolution.
Maintenant que nous avons vu les principes, nous allons le voir dans le laboratoire.
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Pour commencer la procédure, la protéine doit être isolée. Pour ce faire, des techniques de biologie moléculaire sont utilisées pour exprimer la protéine dans les cellules et ensuite purifier.
L’acide nucléique est amplifié et étiqueté de manière à créer une sonde. L’étiquetage se fait grâce à une incubation de 10 min avec dCTP contenant du phosphore radioactif-32. Un rayonnement sécurisé établi et un équipement de protection sont requis.
Le gel est alors établi. Le gel doit être non dénaturants, afin d’empêcher la protéine altérant la conformation et potentiellement la séparation de la sonde pendant l’électrophorèse. Gels de polyacrylamide ont la taille des pores de 5 à 20 nm et sont utile pour les sondes courtes jusqu'à 100 paires de bases en longueur. Des gels d’agarose ont la taille des pores de 70 à 700 nm et sont utiles pour les sondes plus grandes.
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Avec les protéines et les acides nucléiques sonde maintenant préparé, nous procédons à la liaison. Préparer une solution de tampon TRIS et la protéine et la sonde sont ajoutés. Le pH doit être similaire à des conditions physiologiques et concentration de sel suffisante pour empêcher la protéine formant des liaisons faibles avec des acides nucléiques non ciblés. La réaction se produit pendant 20-30 min à 4 ° C.
L’étape suivante est l’électrophorèse. Une zone tampon de faible force ionique et un pH identique à celui utilisé dans la réaction de liaison est utilisée. Il donne un « effet de mise en cage » qui stabilise complexes, augmente la mobilité et réduit la production de chaleur. Après électrophorèse, les composants du gel sont transférées sur du papier filtre. Dans une pièce sombre, le papier filtre est ensuite exposé au cinéma. Si la protéine se lie à la sonde, deux régions distinctes de marqués seront visibles dans le transfert. Représentant le complexe et une distincte représentant la sonde non liée. La séparation montre que la protéine a été liée à l’acide nucléique.
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Maintenant que nous avons vu la procédure de base, nous allons étudier certaines applications.
La chromatine est le complexe serré de l’ADN et les protéines des cellules eucaryotes. Enzymes de remodelage de la chromatine modifient la structure pour ouvrir l’ADN à la transcription. Que cela change la mobilité du complexe, EMSA permet d’explorer l’activité de liaison de l’enzyme.
Une autre approche à l’étiquetage tire profit de l’interaction entre l’ADN et l’enzyme méthyltransférase. Un cofacteur peut être modifié pour lier en permanence à l’ADN par l’intermédiaire de methyltransferase. Au lieu de marquage avec le phosphore-32, le cofacteur est conjugué à la biotine, qui est avantageux, car il n’est pas radioactif. Parce que le cofacteur est spécifique au site dans son attachement, il est pertinent de génotypage, détection de méthylation et la livraison de gène. Les acides nucléiques de biotinilated sont détectés par fluorescence ultraviolette.
Lorsque les stimuli environnementaux activent kinases de l’histidine, un « régulateur de réponse » est phosphorylé. C’est à son tour lie à l’ADN, affectant la transcription, qui peut être étudiée par l’EMSA. Par exemple, un régulateur de réponse chez Desulfovibrio vulgaris a été démontré à lier le gène d’intérêt. EMSA a été utilisée pour vérifier que la liaison a eu lieu.
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Vous avez juste regardé la vidéo sur l’analyse de décalage de mobilité électrophorétique de JoVE. Vous devez maintenant comprendre ses principes de fonctionnement, les étapes de sa procédure et ses principaux paramètres de fonctionnement.
Merci de regarder !
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Le retard sur gel (EMSA)

The electrophoretic mobility shift assay (EMSA) is a biochemical procedure used to elucidate binding between proteins and nucleic acids. In this assay a ...

L’EMSA, le test de déplacement de mobilité électrophorétique, également connu sous le nom de test de déplacement de gel, est une procédure biochimique polyvalente et sensible. L’EMSA élucide la liaison entre les protéines et les acides nucléiques en détectant un décalage des bandes dans l’électrophorèse sur gel. Cette vidéo décrit les principes de l’EMSA, fournit une procédure générale et aborde certaines applications. La réplication, la transcription et la réparation de l’ADN, ainsi que le traitement de l’ARN sont tous des processus biochimiques critiques. Ils impliquent tous une liaison entre les protéines et les acides nucléiques. De nombreuses maladies et troubles graves sont associés à des modifications de cette liaison. L’EMSA est une technique permettant de déterminer qualitativement si une protéine spécifique se lie à un acide nucléique spécifique. Tout d’abord, l’acide nucléique est marqué, généralement avec du phosphore 32 radioactif, pour créer une sonde. Ensuite, la protéine d’essai et la sonde d’acide nucléique sont mélangées. Lorsqu’une protéine se lie à une sonde d’acide nucléique, le complexe résultant a une masse plus importante et une conformation différente de celle de l’acide nucléique seul. Une fois liés, les complexes sont analysés par électrophorèse sur gel. Dans cette technique, un champ électrique force les macromolécules à migrer à travers une matrice de gel. Les composants se séparent en fonction de la masse, de la charge et de la conformation. L’électrophorèse peut séparer les complexes protéine-ADN des sondes non liées. Comme ils ont des masses et des conformations différentes, ils migreront à travers le gel à des vitesses différentes et se sépareront. La séparation est facilement détectée, grâce à la présence du phosphore radioactif, et prouve que la protéine se lie avec succès à l’acide nucléique donné. Pour vérifier l’identification de la protéine, un « test supershift » utilise un anticorps ayant une affinité connue pour la protéine. Cela a l’avantage supplémentaire de déplacer davantage la résolution complexe et croissante. Maintenant que nous avons vu les principes, voyons-le en laboratoire. Pour commencer la procédure, la protéine doit être isolée. Pour ce faire, des techniques de biologie moléculaire sont utilisées pour exprimer la protéine dans les cellules, puis la purifier. L’acide nucléique est amplifié et marqué pour créer une sonde. Le marquage se fait par incubation pendant 10 min avec du dCTP contenant du phosphore radioactif 32. Un établi résistant aux radiations et un équipement de protection sont nécessaires. Le gel est ensuite préparé. Le gel doit être non dénaturant, pour éviter que la protéine ne modifie sa conformation et ne se détache potentiellement de la sonde pendant l’électrophorèse. Les gels de polyacrylamide ont des tailles de pores de 5 à 20 nm et sont utiles pour les sondes courtes d’une longueur maximale de 100 paires de bases. Les gels d’agarose ont des tailles de pores de 70 à 700 nm et sont utiles pour les sondes plus grandes. Une fois la sonde de protéines et d’acides nucléiques préparée, nous procédons à la liaison. Une solution tampon TRIS est préparée et la protéine et la sonde sont ajoutées. Le pH doit être similaire aux conditions physiologiques et la concentration en sel doit être suffisante pour empêcher la protéine de former des liaisons faibles avec les acides nucléiques non cibles. La réaction dure 20 à 30 minutes à 4 °C.L’étape suivante est l’électrophorèse. Un tampon de faible force ionique et d’un pH similaire à celui utilisé dans la réaction de liaison est utilisé. Il produit un « effet de cage » qui stabilise les complexes, augmente la mobilité et réduit la production de chaleur. Après l’électrophorèse, les composants du gel sont transférés sur du papier filtre. Dans une pièce sombre, le papier filtre est ensuite exposé à un film. Si la protéine se lie à la sonde, deux régions marquées distinctes seront visibles dans le transfert. L’une représentant le complexe, et l’autre représentant la sonde non liée. La séparation démontre que la protéine s’est liée avec succès à l’acide nucléique. Maintenant que nous avons vu la procédure de base, examinons quelques applications. La chromatine est le complexe serré d’ADN et de protéines que l’on trouve dans les cellules eucaryotes. Les enzymes de remodelage de la chromatine modifient la structure pour ouvrir l’ADN à la transcription. Comme cela modifie la mobilité du complexe, l’EMSA peut être utilisée pour explorer l’activité de liaison de l’enzyme. Une autre approche de marquage tire parti de l’interaction entre l’ADN et l’enzyme méthyltransférase. Un cofacteur peut être modifié pour se lier de façon permanente à l’ADN via la méthyltransférase. Plutôt que de marquer avec du phosphore 32, le cofacteur est conjugué à la biotine, ce qui est avantageux car il n’est pas radioactif. Parce que le cofacteur est spécifique au site dans son attachement, il est pertinent pour le génotypage, la détection de la méthylation et la livraison de gènes. Les acides nucléiques biotinilés sont détectés par fluorescence ultraviolette. Lorsque les stimuli environnementaux activent les histidine kinases, un « régulateur de réponse » est phosphorylé. Celui-ci se lie à son tour à l’ADN, affectant la transcription, qui peut être étudiée par l’AESM. Par exemple, un régulateur de réponse dans ? Il a été démontré que Desulfovibrio vulgaris se lie au gène d’intérêt. L’EMSA a été utilisée pour vérifier que la liaison avait bien eu lieu. Vous venez de regarder la vidéo de JoVE sur le test de déplacement de mobilité électrophorétique. Vous devriez maintenant comprendre ses principes de fonctionnement, les étapes de sa procédure et ses principaux paramètres de fonctionnement. Merci d’avoir regardé !

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detecting protein-dna binding by emsa

Electrophoretic mobility shift assay, or EMSA, is a biochemical method used to detect binding between proteins and nucleic acids. It is also called a gel shift assay. The test compares how a labeled nucleic acid moves through a gel before and after it binds a protein.

EMSA is used to see whether a specific protein binds to a specific nucleic acid. First, the nucleic acid is labeled to make a probe. The transcript describes radioactive phosphorus-32 as a common label. The probe is then mixed with the test protein, and any binding changes the size and shape of the complex.

The bound and unbound molecules are then separated by gel electrophoresis. An electric field pulls macromolecules through a gel matrix. They separate by mass, charge, and conformation. Protein-DNA complexes move differently from free probe, so the shifted band shows that binding occurred. A supershift assay can also confirm the protein’s identity. In that step, an antibody with known affinity binds the protein and shifts the complex even further.

The lab procedure begins by isolating the protein. Molecular biology methods are used to express the protein in cells and then purify it. The nucleic acid is amplified and labeled to form the probe. Because phosphorus-32 is radioactive, a radiation-safe workbench and protective equipment are required during labeling.

The gel must be non-denaturing so the protein does not change conformation or fall off the probe during electrophoresis. Polyacrylamide gels have pore sizes of about 5 to 20 nm and are used for short probes up to 100 base pairs long. Agarose gels have larger pores, about 70 to 700 nm, and are used for larger probes. After the protein and probe are ready, they are mixed in TRIS buffer for binding.

The binding reaction uses a pH close to physiological conditions. The salt concentration must be high enough to reduce weak, non-target binding. The reaction runs for 20 to 30 min at 4 °C. Electrophoresis is then done in a buffer with low ionic strength and a similar pH. This creates a caging effect that helps stabilize complexes, increases mobility, and reduces heat generation.

After the gel runs, the components are transferred onto filter paper. The paper is exposed to film in a dark room. If binding occurred, two labeled regions appear: one for the protein-nucleic acid complex and one for the unbound probe. That separation shows the protein successfully bound the nucleic acid.

EMSA is useful in several research areas. Chromatin-remodeling enzymes can be studied because they change chromatin structure and affect DNA mobility. A modified EMSA can use biotinylated nucleic acids instead of radioactive labels. This approach is site-specific and useful for genotyping, methylation detection, and gene delivery. It is also detected through ultraviolet fluorescence.

The assay can also help study bacterial response regulators. When environmental stimuli activate histidine kinases, a response regulator becomes phosphorylated and binds DNA to affect transcription. The transcript gives an example from Desulfovibrio vulgaris, where EMSA was used to confirm binding to a gene of interest. EMSA therefore provides a sensitive way to study protein-nucleic acid interactions and their role in DNA replication, transcription, repair, and RNA processing.

Detecting Protein-DNA Binding by EMSA

dialysis: diffusion based separation

Dialysis for Buffer Exchange in Biochemistry

Dialysis is a common biochemistry technique for buffer exchange and desalting. It separates molecules by diffusion through a semipermeable membrane, which lets small molecules pass while holding larger biomolecules inside the sample. The membrane is the key part of the setup. Its pores create a molecular weight cutoff, so a membrane such as a 10 kDa membrane usually keeps molecules larger than 10 kilodaltons inside. This cutoff is not exact, because membranes have a range of pore sizes.

enzyme assays and kinetics

Measuring Enzyme Reaction Rates

Enzyme reaction rates can be measured with assays that track how substrate or product levels change over time. Enzymes are proteins, or sometimes RNAs, that speed up chemical reactions by lowering the activation energy needed to start them. They act on a specific substrate and help form a product that supports life processes. Enzymatic reactions are often described in three steps. First, the substrate binds to the enzyme active site and forms an enzyme-substrate complex. That complex can fall...

maldi-tof mass spectrometry

How MALDI-TOF Reads Biomolecules

MALDI-TOF mass spectrometry reads biomolecules by using a laser, a matrix, and a time-of-flight analyzer. MALDI, or matrix-assisted laser desorption ionization, helps fragile molecules keep their structure while they are moved into the mass analyzer. The analyzer then separates compounds based on size and charge. In MALDI, the sample is mixed into a matrix, usually an organic compound with aromatic and conjugated double bonds. A laser pulse strikes the spot, and the matrix absorbs most of the...

tandem mass spectrometry

Tandem Mass Spectrometry for Biomolecule Analysis

Tandem mass spectrometry is used to isolate a biomolecule and break it into smaller pieces so its makeup can be studied. Because biomolecules often have large, complex structures, it can be hard to identify their molecular composition and sequence from a single measurement. By linking mass spectrometers in series, the technique first selects one ion and then analyzes the fragments it produces. The process starts with an ion source that converts the sample into ions. A mass analyzer then...

protein crystallization

Protein Crystals for Structure Analysis

Protein crystals help scientists study protein structure and function. A crystal is a solid lattice made from purified protein molecules. These crystals are useful in structural biology because they reveal details that methods like mass spectrometry and SDS-PAGE cannot show on their own. Protein crystallization is paired with recombinant protein expression and x-ray diffraction to support this work. The process starts with a large amount of very pure protein. Researchers often make that...

chromatography-based biomolecule purification methods

chromatography-based-biomolecule-purification-methods

Protein Purification with SEC and IMAC

Protein purification with size-exclusion chromatography and affinity chromatography helps isolate biomolecules from complex mixtures. These methods are common in biochemistry because purified samples are needed before a biomolecule’s properties and activity can be studied. The video focuses on the principles behind size-exclusion chromatography, affinity chromatography, and immobilized metal affinity chromatography, or IMAC. Size-exclusion chromatography, or SEC, separates molecules by size. A...

two-dimensional gel electrophoresis

Protein Mapping with 2D Gel Electrophoresis

Protein mapping with 2D gel electrophoresis separates complex protein mixtures across two steps. The method combines isoelectric focusing, or IEF, with sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, or SDS-PAGE. Together, these methods can resolve thousands of biomolecules from a single sample by their isoelectric point and molecular weight. The first dimension is IEF. Each protein has an isoelectric point, or pI, which is the pH where its net charge is zero. Proteins are loaded...

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Tracking Cell Chemistry with Metabolic Labels

Metabolic labeling tracks cell chemistry by using chemical analogs that cells take up and build into biomolecules. These labels help scientists follow biochemical changes and modifications inside cells. The labeled products can then be studied with tools such as SDS-PAGE and NMR to learn more about metabolic pathways. Several labeling strategies are shown here. Isotopic labeling uses analogs that match the natural molecule but contain uncommon isotopes, such as carbon-13 and nitrogen-15 in an...

electrophoretic mobility shift assay (emsa)

Electrophoretic mobility shift assay, or EMSA, is a biochemical method used to detect binding between proteins and nucleic acids. It is also called a gel shift assay. The test compares how a labeled nucleic acid moves through a gel before and after it binds a protein. EMSA is used to see whether a specific protein binds to a specific nucleic acid. First, the nucleic acid is labeled to make a probe. The transcript describes radioactive phosphorus-32 as a common label. The probe is then mixed...

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Measuring Protein Concentration with Absorbance

Measuring protein concentration with absorbance is a key step in many biochemical assays. Photometric methods use the fact that samples with more light-absorbing material transmit less light. Because concentration and absorption are directly related, this makes it possible to measure an unknown sample. The core idea comes from the Beer-Lambert Law. This law states that the concentration of a light-absorbing species is proportional to its absorbance. The video also introduces the Bradford assay...

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Sucrose Gradient Separation in an Ultracentrifuge

Sucrose gradient separation in an ultracentrifuge is a lab method for isolating cell parts and biomolecules. It uses differences in density to make particles sink or rise in a liquid. A high-speed ultracentrifuge speeds up this process so components can be separated without destroying them. The basic idea starts with a suspension, which is particles mixed in a liquid solvent. Particles that are denser than the solvent sediment, while less dense particles float. A rotor inside the...

co-immunoprecipitation and pull-down assays

co-immunoprecipitation-and-pull-down-assays

Protein Interaction Capture Methods in Cells

Co-immunoprecipitation and pull-down assays are laboratory methods used to capture stable protein-protein interactions. Protein-protein interactions help control many biological functions, but many of them have not yet been identified. These assays are related to immunoprecipitation, which isolates a target protein from a mixed sample using an antibody. In co-immunoprecipitation, or CoIP, an antibody binds the target protein, and that protein is already attached to another protein that the...

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Membrane Proteins in Liposome Models

Membrane proteins can be moved into liposome models so their function can be studied outside a cell. Reconstitution means restoring an isolated biomolecule to a working form. For membrane proteins, that usually means placing a purified protein into an artificial lipid membrane. Cell membranes are made mainly of phospholipids and membrane proteins. The phospholipids form a bilayer with hydrophilic phosphate heads facing water and hydrophobic fatty acid tails facing inward. Some membrane...

f&#246;rster resonance energy transfer (fret)

FRET as a Molecular Ruler in Cells

Föster resonance energy transfer, or FRET, is a way to study close-range biochemical interactions using light-emitting molecules. A donor fluorophore can pass energy to an acceptor fluorophore when their emission and absorption spectra overlap. This transfer happens only when the pair is very close together, usually within 10 nm. Because FRET depends on distance, it is often called a molecular or spectroscopic ruler. The strength of the signal is measured as FRET efficiency, which describes...

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Surface plasmon resonance, or SPR, is a way to track biomolecular binding on a label-free biosensor. It is used to measure molecular affinity, kinetics, specificity, and concentration. The method works with a thin metal layer on a prism, where changes in reflected light reveal interactions in real time. SPR sensors use a thin layer of a noble metal on the face of a prism. Light is reflected from the prism-metal interface into a photodetector. At one specific angle, called the surface plasmon...

biochemistry

Cette collection présente des méthodes de purification couramment utilisées, comme la chromatographie d'affinité, ainsi que des méthodes analytiques, comme le MALDI-TOF. En outre, les vidéos présentent des méthodes permettant d'évaluer l'interaction et la fonction des biomolécules, telles que la co-immunoprécipitation et le marquage métabolique.

Learn how EMSA detects protein-DNA binding with labeled probes, gel electrophoresis, and band shifts. See the steps and common applications.

Detecting Protein-DNA Binding by EMSA | JoVE K12

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Matter and Energy in Organisms and Ecosystems

HS-LS1-6.

Inheritance and Variation of Traits

HS-LS3-1.

Earth and Space Sciences

Human Sustainability

HS-ESS3-3.

Overview

Principles of EMSA

Protein and Gel Preparation

Binding, Electrophoresis, and Detection

Applications

Summary

Characteristics of Life

Biology is a natural science that studies life and living organisms, including their structure, function, development, interactions, evolution, ...

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Construct an explanation based on evidence for how the structure of DNA determines the structure of proteins which carry out the essential functions of life through systems of specialized cells.

Detecting Protein-DNA Binding by EMSA

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