Name: fret as a molecular ruler in cells
Uploaded: 2023-04-30T06:31:47.000Z
Duration: 6 min 39 s
Channel: JoVE

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New York State Science Learning Standards

High School

Physical Science

HS. Waves and Electromagnetic Radiation

HS-PS4-5.

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)

Le transfert d’énergie par résonance de Förster (FRET) est un phénomène utilisé pour étudier les interactions biochimiques à courte portée. Dans le FRET, une molécule photoluminescente donneuse peut transférer de l’énergie de manière non radiative à une molécule accepteuse si leurs spectres d’émission et d’absorbance respectifs se chevauchent. La quantité d’énergie transférée – et par conséquent l’émission globale de l’échantillon – dépend de la proximité d’une paire accepteur-donneur de molécules photoluminescentes. L’analyse FRET est combinée à d’autres techniques de biochimie pour obtenir des informations détaillées sur les structures biomoléculaires et les interactions à partir de cette « règle spectroscopique ».
Cette vidéo couvre les principes et les concepts de l’analyse FRET. La procédure se concentre sur la préparation des échantillons pour la FRET et sur les façons de présenter et d’interpréter les données. Enfin, les applications comprennent la surveillance des processus conformationnels et cellulaires en marquant des parties d’une cellule ou d’une protéine, la surveillance des réactions enzymatiques qui modifient les structures protéiques et l’utilisation de FRET pour surveiller l’agrégation des monomères exprimés par les cellules.
<div class="chapter_text » id="script_0">
Le transfert d’énergie par résonance de Förster, ou FRET, est un transfert d’énergie non radiatif entre des molécules électroluminescentes, et est souvent utilisé pour étudier les interactions biochimiques à courte portée. La FRET ne se produit que lorsque les molécules fluorescentes sont espacées à moins de 10 nm les unes des autres. L’analyse FRET peut être combinée à d’autres techniques pour obtenir des informations structurelles détaillées. Cette vidéo présentera les principes sous-jacents du FRET, résumera un protocole et une présentation de données, et discutera de certaines applications biochimiques.
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<div class="chapter_text » id="script_1">
Une molécule photoluminescente telle qu’un fluorophore est excitée en absorbant le rayonnement électromagnétique à une longueur d’onde dans son spectre d’absorption. En se détendant, il émet de la lumière à une longueur d’onde dans son spectre d’émission. Pour plus d'informations sur la fluorescence, consultez la vidéo de JoVE sur la microscopie à fluorescence. Différents fluorophores absorbent et émettent de la lumière à différentes longueurs d’onde, qui se chevauchent fréquemment. Si le spectre d’émission d’un fluorophore chevauche de manière significative le spectre d’absorption d’un autre fluorophore, le « donneur » libérera un photon virtuel, qui est absorbé par « l’accepteur ». Lorsqu’un donneur excité se trouve à moins de 10 nm d’un accepteur, l’énergie est transférée du donneur à l’accepteur par des interactions dipôle-dipôle. La libération d’énergie par l’émission de lumière du donneur diminue en conséquence. Pendant ce temps, l’accepteur excité émet de la lumière à sa longueur d’onde d’émission. La réponse FRET est évaluée en termes d’efficacité, ou le pourcentage d’énergie libérée du donneur par FRET plutôt que par la fluorescence ou d’autres processus radiatifs. L'efficacité dépend fortement de la distance entre le donneur et l'accepteur, ce qui permet à la FRET d'agir comme une règle « moléculaire » ou « spectroscopique ».
En biochimie, le FRET est souvent utilisé qualitativement pour observer les changements de conformation des molécules en surveillant les fluorophores lorsqu’ils entrent et sortent de la plage FRET les uns des autres. De même, les fonctions cellulaires peuvent être étudiées avec des molécules contenant une paire FRET. Si la molécule marquée est clivée par l’activité enzymatique, le FRET s’arrête et la longueur d’onde de fluorescence observée change.
Maintenant que vous comprenez les principes qui sous-tendent le FRET, examinons une vue d'ensemble d'un protocole et quelques façons de présenter et d'interpréter les données.
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<div class="chapter_text » id="script_2">
Avant l’expérience, les biomolécules d’intérêt, généralement de l’ADN ou des protéines, sont modifiées à l’aide de marqueurs fluorescents, à l’aide de techniques de biologie moléculaire. Les méthodes courantes d’introduction du matériel génétique modifié dans les cellules comprennent la transfection et l’électroporation.
Ensuite, les cellules sont préparées pour la visualisation FRET sur un microscope à fluorescence. Par exemple, les molécules peuvent être immobilisées sur une lame pour le FRET à molécule unique, ou les échantillons sont chargés dans des puits pour un criblage à haut débit.
Ensuite, les lasers d’excitation, le microscope et l’équipement associé sont préparés. (A) Les expériences FRET impliquent souvent des lasers puissants ; (B) l’utilisation d’un EPI et de procédures de sécurité appropriés doit être utilisé. L’échantillon est ensuite placé dans l’instrument et éclairé par le laser d’excitation.
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<div class="chapter_text » id="script_3">
Pour les expériences de surveillance du comportement des cellules, des images couleur montrant les différences ou les changements d’intensité d’émission sont utilisées. Les intensités d’émission du donneur et de l’accepteur sont tracées ensemble pour suivre la réponse FRET au fil du temps.
Les données FRET peuvent également être adaptées à diverses fonctions pour des analyses plus complexes. Selon l’expérience, les données peuvent être présentées de plusieurs façons pour représenter au mieux les résultats, ce qui fait du FRET un outil expérimental flexible.
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<div class="chapter_text » id="script_4">
Maintenant que vous connaissez les bases de l'exécution et de l'analyse d'une expérience FRET, examinons certaines applications de FRET dans la recherche en biochimie.
La FRET peut être utilisée pour étudier les changements conformationnels ou les processus cellulaires en marquant les parties de la protéine ou de la cellule qui se déplacent à moins de 10 nm les unes des autres avec une paire FRET. Par exemple, les capteurs de protéines sont préparés en marquant les récepteurs avec une paire de fluorophores. La réponse FRET est surveillée en direct par microscopie confocale. La variation de la longueur d’onde et de l’intensité de l’émission indique des changements conformationnels.
Le FRET peut également être utilisé en préparant des molécules avec une paire FRET active et en observant les changements dans la réponse. Lorsque le substrat est clivé, le FRET est perturbé, ce qui entraîne une augmentation des émissions du donneur et une diminution de l’émission de l’accepteur. Les émissions sont analysées pour déterminer les contributions par donateur, accepteur et FRET. Une fois que les facteurs d’émission directe sont calculés pour les protéines fluorescentes cyan et jaune, la concentration et les paramètres cinétiques du substrat peuvent être déterminés.
Les cellules conçues pour exprimer des monomères contenant l'une ou l'autre des paires FRET fonctionnent comme des « capteurs » pour les interactions entre ces monomères. Si l’agrégation de ces monomères est induite, une réponse FRET est observée. Cela peut être utilisé pour étudier l'agrégation de protéines déclenchée par l'ensemencement de protéines mal repliées. Ici, les cellules ont été transduites avec des agrégats de la protéine d’intérêt, incubées et analysées par cytométrie en flux.
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<div class="chapter_text » id="script_5">
Vous venez de regarder la vidéo de JoVE sur le transfert d'énergie de résonance de Förster, ou FRET. Cette vidéo contenait les principes sous-jacents du FRET, la préparation et l’analyse d’une expérience FRET, ainsi que quelques applications biochimiques.
Merci d’avoir regardé !
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transfert d'énergie par résonance de type förster (fret)

Transfert d’énergie Förster (FRET) est un phénomène utilisé pour étudier les interactions biochimiques de courte portée. Dans la frette, une molécule de photoluminescent donneur peut transférer non-radiativement énergie à une molécule d’accepteur si leurs spectres d’émission et d’absorption respectifs se chevauchent. La quantité d’énergie transférée &#8212; et par conséquent l’ensemble des émissions d’échantillon &#8212; dépend de la proximité d’une paire de donneur-accepteur de molécules photoluminescentes. Analyse de la frette est combiné avec d’autres techniques de biochimie pour obtenir des informations détaillées des structures biomoléculaires et les interactions de ce &#8220; souverain spectroscopiques. &#8221; cette vidéo couvre les principes et les concepts d’analyse de la frette. La procédure se concentre sur la préparation des échantillons pour le FRET et les moyens présenter et interpréter les données. Enfin, les applications incluent la surveillance des procédés conformationnelles et cellulaires par marquage des pièces d’une cellule ou de la protéine, les réactions enzymatiques qui altèrent les structures de protéine, de surveillance et à l’aide de FRET pour surveiller l’agrégation des monomères exprimé par les cellules.
<div class="chapter_text" id="script_0"> Förster Resonance Energy transfert ou frette, est un non radiatif transfert d’énergie entre molécules émettrices de lumière et est souvent utilisée pour étudier les interactions biochimiques de courte portée. FRETTE se produit uniquement lorsque les molécules fluorescentes sont espacés de moins de 10 nm de l’autre. Analyse de la frette est cumulable avec d’autres techniques pour obtenir des informations structurelles détaillées. Cette vidéo va introduire les principes sous-jacents de la frette, résumer une présentation de données et de protocole et discuter certaines applications biochimiques.
</div> <div class="chapter_text" id="script_1"> molécule de photoluminescent A par exemple un fluorophore est excitée en absorbant le rayonnement électromagnétique à une longueur d’onde dans le spectre d’absorption. Comme il se détend, il émet de la lumière à une longueur d’onde au sein de son spectre d’émission. Pour plus d’informations sur la fluorescence, consultez JoVE &#39; s-vidéo sur la microscopie de fluorescence. Fluorophores différents absorbent et émettent de la lumière à différentes longueurs d’onde, qui souvent se chevauchent. Si le spectre d’émission d’un fluorophore chevauche considérablement le spectre d’absorption d’une autre molécule, la &#8220; donneur &#8221; publiera un photon virtuel, qui est absorbé par la &#8220; accepteur &#8221;. Quand un donneur excité est moins de 10 nm d’un accepteur, l’énergie est transférée du donneur à accepteur par interactions dipôle-dipôle. La libération d’énergie par émission de lumière par le donateur diminue proportionnellement. Pendant ce temps, l’accepteur excité émet de la lumière à sa longueur d’onde d’émission. La réponse de la frette est évaluée en termes d’efficacité, ou le pourcentage d’énergie libérée du donneur par FRET, plutôt que par fluorescence ou autres processus radiatifs. L’efficacité dépend fortement de la distance entre le donneur et l’accepteur, qui permet la frette d’agir comme un &#39; moléculaire &#39; ou &#39; spectroscopiques &#39; souverain.
En biochimie, frette sert souvent qualitativement à observer des changements conformationnels dans les molécules en surveillant les fluorophores comme ils se déplacent dans et hors de la gamme FRET de l’autre. De même, les fonctions cellulaires peuvent être étudiées avec des molécules contenant une paire de frette. Si la molécule marquée est clivée par l’activité enzymatique, frette s’arrête et les changements de longueur d’onde de fluorescence observés.
Maintenant que vous comprenez les principes qui sous-tendent la frette, laissez &#39; s regarder un aperçu d’un protocole et plusieurs façons de présenter et interpréter les données.
</div> <div class="chapter_text" id="script_2"> avant l’expérience, les biomolécules d’intérêt, généralement des ADN ou des protéines, sont conçus avec des étiquettes fluorescentes, à l’aide de techniques de biologie moléculaire. façons courantes d’introduire la mis à jour le matériel génétique dans les cellules incluent la transfection et l’électroporation.
Puis, les cellules sont préparés pour la visualisation de la frette sur un microscope de fluorescence. par exemple, les molécules peuvent être immobilisées sur une diapositive pour frette de la molécule unique ou les échantillons sont chargés dans le puits pour le criblage à haut débit.
Puis, les lasers à excitation, le microscope et le matériel connexe sont préparés. (A) expériences de la frette impliquent souvent des lasers puissants ; (B) si approprié PPE et procédures de sécurité devaient être appliquées. l’échantillon est ensuite placé dans l’appareil et illuminé avec le laser excitation.
</div> <div class="chapter_text" id="script_3"> pour les expériences de comportement de la cellule de surveillance, couleur des images montrant des différences ou des changements dans l’intensité des émissions sont utilisés. Donneur et accepteur des intensités d’émission sont tracées ensemble pour suivre les réponse frette au fil du temps.
Frette données peuvent également être montées sur diverses fonctions pour des analyses plus complexes. Selon l’expérience, les données pourraient être présentées de multiples façons pour mieux représenter les résultats, faisant vous inquiétez pas un outil expérimental souple.
</div> <div class="chapter_text" id="script_4"> maintenant que vous avez &#39; re familier avec les bases de course et d’analyser une expérience de la frette, laissez &#39; s coup d’oeil à certaines applications de frette en recherche biochimie.
Frette peut être utilisé pour étudier les changements de conformation ou de processus cellulaires par marquage des parties de la protéine ou cellule prévues à se déplacer au sein de 10 nm de l’autre avec une paire de frette. Par exemple, capteurs de protéine sont préparés par marquage des récepteurs avec une paire de fluorophores. La réponse de la frette est surveillée direct par microscopie confocale. Variation de longueur d’onde d’émission et l’intensité indiquent des changements conformationnels.
Frette peut également être utilisé en préparant des molécules avec une paire de frette active et en détectant les variations de la réponse. Lorsque le substrat est clivé, frette est perturbé, provoquant une augmentation des émissions donneur et une diminution dans l’émission de l’accepteur. Les émissions sont analysées afin de déterminer les contributions par donneur et accepteur frette. Une fois que les facteurs d’émissions directes sont calculés pour les protéines fluorescentes cyan et jaunes, la concentration et les paramètres cinétiques du substrat peuvent être déterminées.
Cellules conçues pour exprimer les monomères contenant soit d’une fonction paire de frette comme &#39; capteurs &#39; pour les interactions entre les monomères. Si l’agrégation de ces monomères est induite, une réponse de la frette est observée. Ceci peut être utilisé pour étudier l’agrégation des protéines déclenchée par &#39; ensemencement &#39; de protéines mal repliées. Ici, les cellules ont été transduites avec des agrégats de la protéine d’intérêt, incubés et analysées avec écoulement cytometry.
</div> <div class="chapter_text" id="script_5"> vous &#39; ve juste regardé JoVE &#39; s-vidéo sur Förster Resonance Energy Transfer ou frette. Cette vidéo contenue les principes sous-jacents de la frette, préparation et analyse d’une expérience de la frette et quelques applications biochimiques.
Merci pour regarder !
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Transfert d'énergie par résonance de type Förster (FRET)

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) is a phenomenon used to investigate close-range biochemical interactions. In FRET, a donor photoluminescent ...

Le transfert d’énergie par résonance Fürster, ou FRET, est un transfert d’énergie non radiatif entre des molécules électroluminescentes, et est souvent utilisé pour étudier les interactions biochimiques à courte portée. La FRET ne se produit que lorsque les molécules fluorescentes sont espacées à moins de 10 nm les unes des autres. L’analyse FRET peut être combinée à d’autres techniques pour obtenir des informations structurelles détaillées. Cette vidéo présentera les principes sous-jacents du FRET, résumera un protocole et une présentation de données, et discutera de certaines applications biochimiques. Une molécule photoluminescente telle qu’un fluorophore est excitée en absorbant le rayonnement électromagnétique à une longueur d’onde dans son spectre d’absorption. En se détendant, il émet de la lumière à une longueur d’onde dans son spectre d’émission. Pour plus d’informations sur la fluorescence, consultez la vidéo de JoVE sur la microscopie à fluorescence. Différents fluorophores absorbent et émettent de la lumière à différentes longueurs d’onde, qui se chevauchent fréquemment. Si le spectre d’émission d’un fluorophore chevauche de manière significative le spectre d’absorption d’un autre fluorophore, le « donneur » libérera un photon virtuel, qui est absorbé par l’accepteur. Lorsqu’un donneur excité se trouve à moins de 10 nm d’un accepteur, l’énergie est transférée du donneur à l’accepteur par des interactions dipôle-dipôle. La libération d’énergie par l’émission de lumière du donneur diminue en conséquence. Pendant ce temps, l’accepteur excité émet de la lumière à sa longueur d’onde d’émission. La réponse FRET est évaluée en termes d’efficacité, ou le pourcentage d’énergie libérée du donneur par FRET plutôt que par la fluorescence ou d’autres processus radiatifs. L’efficacité dépend fortement de la distance entre le donneur et l’accepteur, ce qui permet à la FRET d’agir comme une règle « moléculaire » ou « spectroscopique ». En biochimie, le FRET est souvent utilisé qualitativement pour observer les changements de conformation des molécules en surveillant les fluorophores lorsqu’ils entrent et sortent de la plage FRET les uns des autres. De même, les fonctions cellulaires peuvent être étudiées avec des molécules contenant une paire FRET. Si la molécule marquée est clivée par l’activité enzymatique, le FRET s’arrête et la longueur d’onde de fluorescence observée change. Maintenant que vous comprenez les principes qui sous-tendent le FRET, examinons une vue d’ensemble d’un protocole et quelques façons de présenter et d’interpréter les données. Avant l’expérience, les biomolécules d’intérêt, généralement de l’ADN ou des protéines, sont modifiées à l’aide de marqueurs fluorescents, à l’aide de techniques de biologie moléculaire. Les moyens courants d’introduire le matériel génétique modifié dans les cellules comprennent la transfection et l’électroporation. Ensuite, les cellules sont préparées pour la visualisation FRET sur un microscope à fluorescence. Par exemple, les molécules peuvent être immobilisées sur une lame pour le FRET à molécule unique, ou les échantillons sont chargés dans des puits pour un criblage à haut débit. Ensuite, les lasers d’excitation, le microscope et l’équipement associé sont préparés. (A) Les expériences FRET impliquent souvent des lasers puissants ; (B) l’utilisation d’EPI et de procédures de sécurité appropriés doit être utilisée. L’échantillon est ensuite placé dans l’instrument et éclairé par le laser d’excitation. Pour les expériences de surveillance du comportement des cellules, des images couleur montrant les différences ou les changements d’intensité d’émission sont utilisées. Les intensités d’émission du donneur et de l’accepteur sont tracées ensemble pour suivre la réponse FRET au fil du temps. Les données FRET peuvent également être adaptées à diverses fonctions pour des analyses plus complexes. Selon l’expérience, les données peuvent être présentées de plusieurs façons pour représenter au mieux les résultats, ce qui fait du FRET un outil expérimental flexible. Maintenant que vous connaissez les bases de l’exécution et de l’analyse d’une expérience FRET, examinons certaines applications de FRET dans la recherche en biochimie. La FRET peut être utilisée pour étudier les changements conformationnels ou les processus cellulaires en marquant les parties de la protéine ou de la cellule qui se déplacent à moins de 10 nm les unes des autres avec une paire FRET. Par exemple, les capteurs de protéines sont préparés en marquant les récepteurs avec une paire de fluorophores. La réponse FRET est surveillée en direct par microscopie confocale. La variation de la longueur d’onde et de l’intensité de l’émission indique des changements conformationnels. Le FRET peut également être utilisé en préparant des molécules avec une paire FRET active et en observant les changements dans la réponse. Lorsque le substrat est clivé, le FRET est perturbé, ce qui entraîne une augmentation des émissions du donneur et une diminution de l’émission de l’accepteur. Les émissions sont analysées pour déterminer les contributions par donateur, accepteur et FRET. Une fois que les facteurs d’émission directe sont calculés pour les protéines fluorescentes cyan et jaune, la concentration et les paramètres cinétiques du substrat peuvent être déterminés. Les cellules conçues pour exprimer des monomères contenant l’une ou l’autre des paires FRET fonctionnent comme des « capteurs » pour les interactions entre ces monomères. Si l’agrégation de ces monomères est induite, une réponse FRET est observée. Cela peut être utilisé pour étudier l’agrégation de protéines déclenchée par l’ensemencement de protéines mal repliées. Ici, les cellules ont été transduites avec des agrégats de la protéine d’intérêt, incubées et analysées par cytométrie en flux. Vous venez de regarder la vidéo de JoVE sur le transfert d’énergie de résonance Fürster, ou FRET. Cette vidéo contenait les principes sous-jacents du FRET, la préparation et l’analyse d’une expérience FRET, ainsi que quelques applications biochimiques. Merci d’avoir regardé !

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fret as a molecular ruler in cells

Föster resonance energy transfer, or FRET, is a way to study close-range biochemical interactions using light-emitting molecules. A donor fluorophore can pass energy to an acceptor fluorophore when their emission and absorption spectra overlap. This transfer happens only when the pair is very close together, usually within 10 nm.

Because FRET depends on distance, it is often called a molecular or spectroscopic ruler. The strength of the signal is measured as FRET efficiency, which describes how much donor energy is transferred instead of being released as fluorescence. Researchers use this relationship to learn about biomolecular structure and interactions.

FRET is often used to follow conformational changes in proteins and other cell molecules. It can also help monitor cellular processes when fluorophores move in and out of FRET range. If an enzyme cuts a labeled molecule, FRET stops, and the emission pattern changes.

To run a FRET experiment, the biomolecules of interest, usually DNA or proteins, are engineered with fluorescent tags. Modified genetic material is commonly introduced into cells by transfection or electroporation. The samples are then prepared for visualization on a fluorescence microscope, either by immobilizing molecules on a slide for single-molecule FRET or by loading them into wells for high-throughput screening.

The microscope, lasers, and related equipment are prepared before the sample is illuminated. FRET experiments often use powerful lasers, so proper PPE and safety procedures are important. The sample is then analyzed as donor and acceptor signals are recorded.

FRET data can be shown in different ways depending on the experiment. Color images may show changes in emission intensity in live-cell studies. Donor and acceptor intensities can also be plotted over time, and the results may be fitted to functions for more complex analysis.

FRET has several biochemical applications. Protein sensors can be built by labeling receptors with a FRET pair and tracking changes with confocal microscopy. FRET can also be used to study enzyme reactions that alter protein structure, and the emissions can be analyzed to separate donor, acceptor, and FRET contributions.

Another use is monitoring monomer aggregation in cells. Cells can be designed to express monomers that contain one part of a FRET pair, and aggregation produces a measurable FRET response. This approach can help study protein aggregation triggered by seeding with misfolded proteins, using transduced cells followed by incubation and flow cytometry.

FRET as a Molecular Ruler in Cells

dialysis: diffusion based separation

Dialysis for Buffer Exchange in Biochemistry

Dialysis is a common biochemistry technique for buffer exchange and desalting. It separates molecules by diffusion through a semipermeable membrane, which lets small molecules pass while holding larger biomolecules inside the sample. The membrane is the key part of the setup. Its pores create a molecular weight cutoff, so a membrane such as a 10 kDa membrane usually keeps molecules larger than 10 kilodaltons inside. This cutoff is not exact, because membranes have a range of pore sizes.

enzyme assays and kinetics

Measuring Enzyme Reaction Rates

Enzyme reaction rates can be measured with assays that track how substrate or product levels change over time. Enzymes are proteins, or sometimes RNAs, that speed up chemical reactions by lowering the activation energy needed to start them. They act on a specific substrate and help form a product that supports life processes. Enzymatic reactions are often described in three steps. First, the substrate binds to the enzyme active site and forms an enzyme-substrate complex. That complex can fall...

maldi-tof mass spectrometry

How MALDI-TOF Reads Biomolecules

MALDI-TOF mass spectrometry reads biomolecules by using a laser, a matrix, and a time-of-flight analyzer. MALDI, or matrix-assisted laser desorption ionization, helps fragile molecules keep their structure while they are moved into the mass analyzer. The analyzer then separates compounds based on size and charge. In MALDI, the sample is mixed into a matrix, usually an organic compound with aromatic and conjugated double bonds. A laser pulse strikes the spot, and the matrix absorbs most of the...

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Tandem Mass Spectrometry for Biomolecule Analysis

Tandem mass spectrometry is used to isolate a biomolecule and break it into smaller pieces so its makeup can be studied. Because biomolecules often have large, complex structures, it can be hard to identify their molecular composition and sequence from a single measurement. By linking mass spectrometers in series, the technique first selects one ion and then analyzes the fragments it produces. The process starts with an ion source that converts the sample into ions. A mass analyzer then...

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Protein Crystals for Structure Analysis

Protein crystals help scientists study protein structure and function. A crystal is a solid lattice made from purified protein molecules. These crystals are useful in structural biology because they reveal details that methods like mass spectrometry and SDS-PAGE cannot show on their own. Protein crystallization is paired with recombinant protein expression and x-ray diffraction to support this work. The process starts with a large amount of very pure protein. Researchers often make that...

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Protein Purification with SEC and IMAC

Protein purification with size-exclusion chromatography and affinity chromatography helps isolate biomolecules from complex mixtures. These methods are common in biochemistry because purified samples are needed before a biomolecule’s properties and activity can be studied. The video focuses on the principles behind size-exclusion chromatography, affinity chromatography, and immobilized metal affinity chromatography, or IMAC. Size-exclusion chromatography, or SEC, separates molecules by size. A...

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Protein Mapping with 2D Gel Electrophoresis

Protein mapping with 2D gel electrophoresis separates complex protein mixtures across two steps. The method combines isoelectric focusing, or IEF, with sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, or SDS-PAGE. Together, these methods can resolve thousands of biomolecules from a single sample by their isoelectric point and molecular weight. The first dimension is IEF. Each protein has an isoelectric point, or pI, which is the pH where its net charge is zero. Proteins are loaded...

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Tracking Cell Chemistry with Metabolic Labels

Metabolic labeling tracks cell chemistry by using chemical analogs that cells take up and build into biomolecules. These labels help scientists follow biochemical changes and modifications inside cells. The labeled products can then be studied with tools such as SDS-PAGE and NMR to learn more about metabolic pathways. Several labeling strategies are shown here. Isotopic labeling uses analogs that match the natural molecule but contain uncommon isotopes, such as carbon-13 and nitrogen-15 in an...

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Detecting Protein-DNA Binding by EMSA

Electrophoretic mobility shift assay, or EMSA, is a biochemical method used to detect binding between proteins and nucleic acids. It is also called a gel shift assay. The test compares how a labeled nucleic acid moves through a gel before and after it binds a protein. EMSA is used to see whether a specific protein binds to a specific nucleic acid. First, the nucleic acid is labeled to make a probe. The transcript describes radioactive phosphorus-32 as a common label. The probe is then mixed...

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Measuring protein concentration with absorbance is a key step in many biochemical assays. Photometric methods use the fact that samples with more light-absorbing material transmit less light. Because concentration and absorption are directly related, this makes it possible to measure an unknown sample. The core idea comes from the Beer-Lambert Law. This law states that the concentration of a light-absorbing species is proportional to its absorbance. The video also introduces the Bradford assay...

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Sucrose Gradient Separation in an Ultracentrifuge

Sucrose gradient separation in an ultracentrifuge is a lab method for isolating cell parts and biomolecules. It uses differences in density to make particles sink or rise in a liquid. A high-speed ultracentrifuge speeds up this process so components can be separated without destroying them. The basic idea starts with a suspension, which is particles mixed in a liquid solvent. Particles that are denser than the solvent sediment, while less dense particles float. A rotor inside the...

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Protein Interaction Capture Methods in Cells

Co-immunoprecipitation and pull-down assays are laboratory methods used to capture stable protein-protein interactions. Protein-protein interactions help control many biological functions, but many of them have not yet been identified. These assays are related to immunoprecipitation, which isolates a target protein from a mixed sample using an antibody. In co-immunoprecipitation, or CoIP, an antibody binds the target protein, and that protein is already attached to another protein that the...

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Membrane Proteins in Liposome Models

Membrane proteins can be moved into liposome models so their function can be studied outside a cell. Reconstitution means restoring an isolated biomolecule to a working form. For membrane proteins, that usually means placing a purified protein into an artificial lipid membrane. Cell membranes are made mainly of phospholipids and membrane proteins. The phospholipids form a bilayer with hydrophilic phosphate heads facing water and hydrophobic fatty acid tails facing inward. Some membrane...

f&#246;rster resonance energy transfer (fret)

Föster resonance energy transfer, or FRET, is a way to study close-range biochemical interactions using light-emitting molecules. A donor fluorophore can pass energy to an acceptor fluorophore when their emission and absorption spectra overlap. This transfer happens only when the pair is very close together, usually within 10 nm. Because FRET depends on distance, it is often called a molecular or spectroscopic ruler. The strength of the signal is measured as FRET efficiency, which describes...

surface plasmon resonance (spr)

SPR Biosensors for Tracking Binding Kinetics

Surface plasmon resonance, or SPR, is a way to track biomolecular binding on a label-free biosensor. It is used to measure molecular affinity, kinetics, specificity, and concentration. The method works with a thin metal layer on a prism, where changes in reflected light reveal interactions in real time. SPR sensors use a thin layer of a noble metal on the face of a prism. Light is reflected from the prism-metal interface into a photodetector. At one specific angle, called the surface plasmon...

biochemistry

Cette collection présente des méthodes de purification couramment utilisées, comme la chromatographie d'affinité, ainsi que des méthodes analytiques, comme le MALDI-TOF. En outre, les vidéos présentent des méthodes permettant d'évaluer l'interaction et la fonction des biomolécules, telles que la co-immunoprécipitation et le marquage métabolique.

Learn how FRET uses donor and acceptor fluorophores to measure distance, track protein changes, and study enzyme activity in cells.

FRET as a Molecular Ruler in Cells | JoVE K12

Life Science

Structure and Function

HS-LS1-1.

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Matter and Energy in Organisms and Ecosystems

HS-LS1-6.

Inheritance and Variation of Traits

HS-LS3-1.

Overview

Principles of FRET

Performing the FRET Experiment

Data Presentation and Analysis

Applications

Summary

Travelling Waves

A wave is a disturbance that propagates from its source, repeating itself periodically, and is typically associated with simple harmonic motion. ...

Wave Parameters

The simplest mechanical waves are associated with simple harmonic motion and repeat themselves for several cycles. These simple harmonic waves can be ...

Equations of Wave Motion

Mathematically, the motion of a wave can be studied using a wavefunction. Consider a string oscillating up and down in simple harmonic motion, having a ...

Graphing the Wave Function

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Velocity and Acceleration of a Wave

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Speed of a Transverse Wave

The speed of a wave depends on the characteristics of the medium. For example, in the case of a guitar, the strings vibrate to produce the sound. The ...

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Problem-Solving: Tuning of a Guitar String

In the case of stringed instruments like the guitar, the elastic property that determines the speed of the sound produced is its linear mass density or ...

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Kinetic and Potential Energy of a Wave

All forms of waves carry energy; this is directly visualized in nature. For instance, the waves of earthquakes are so intense that they can shake huge ...

Energy and Power of a Wave

The total energy associated with a wavelength is the sum of the potential energy and the kinetic energy. The average rate of energy transfer associated ...

Interference and Superposition of Waves

When two waves of the same nature occur in the same region simultaneously, they result in interference. Interference of waves implies that the net effect ...

Reflection of Waves

When a wave travels from one medium to another, it gets reflected at the boundary of the second medium. A common example of this is when a person yells at ...

Propagation of Waves

When a wave propagates from one medium to another, part of it may get reflected in the first medium, and part of it may get transmitted to the second ...

Standing Waves

Sometimes waves do not seem to move; rather, they just vibrate in place. Unmoving waves can be seen on the surface of a glass of milk kept in a ...

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Modes of Standing Waves - I

A close look at earthquakes provides evidence for the conditions appropriate for resonance, standing waves, and constructive and destructive interference. ...

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Modes of Standing Waves: II

The starting point for expressing the modes of standing waves is understanding the boundary conditions that the waves must follow. The boundary conditions ...

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Sound Waves

Sound waves can be thought of as fluctuations in the pressure of a medium through which they propagate. Since the pressure also makes the medium&#39;s ...

Sound as Pressure Waves

Sound waves, which are longitudinal waves, can be modeled as the displacement amplitude varying as a function of the spatial and temporal coordinates. As ...

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Perception of Sound Waves

The human ear is not equally sensitive to all frequencies in the audible range. It may perceive sound waves with the same pressure but different ...

Speed of Sound in Solids and Liquids

Most solids and liquids are incompressible&#8212;their densities remain constant throughout. In the presence of an external force, the molecules tend to ...

Speed of Sound in Gases

The speed of sound in a gaseous medium depends on various factors. Since gases constitute molecules that are free to move, they are highly compressible. ...

Shock Waves

While deriving the Doppler formula for the observed frequency of a sound wave, it is assumed that the speed of sound in the medium is greater than the ...

Echo

The human ear cannot distinguish between two sources of sound if they happen to reach within a specific time interval, typically 0.1 seconds apart. More ...

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Use mathematical representations to support a claim regarding relationships among the period, frequency, wavelength, and speed of waves traveling and transferring energy (amplitude, frequency) in various media.

HS-PS4-1.

Using GIS to Investigate Urban Forestry

Source: Laboratories of Margaret Workman and Kimberly Frye - Depaul University
Urban forests broadly include urban parks, street trees, landscaped ...

Evaluate questions about the advantages of using a digital transmission and storage of information.

HS-PS4-2.

concept-of-resonance-and-its-characteristics

Concept of Resonance and its Characteristics

If a driven oscillator needs to resonate at a specific frequency, then very light damping is required. An example of light damping includes playing piano ...

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Sound Waves: Resonance

Resonance is produced depending on the boundary conditions imposed on a wave. Resonance can be produced in a string under tension with symmetrical ...

Sound Waves: Interference

Sound waves can be modeled either as longitudinal waves, wherein the molecules of the medium oscillate around an equilibrium position, or as pressure ...

Interference: Path Lengths

Consider two sources of sound, that may or may not be in phase, emitting waves at a single frequency, and consider the frequencies to be the same.
Two ...

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The Wave Nature of Light

The nature of light has been a subject of inquiry since antiquity. In the seventeenth century, Isaac Newton performed experiments with lenses and prisms ...

The Electromagnetic Spectrum

The electromagnetic spectrum consists of all the types of electromagnetic radiation arranged according to their frequency and wavelength. Each of the ...

The Quantum-Mechanical Model of an Atom

Shortly after de Broglie published his ideas that the electron in a hydrogen atom could be better thought of as being a circular standing wave instead of ...

Quantum Numbers

It is said that the energy of an electron in an atom is quantized; that is, it can be equal only to certain specific values and can jump from one energy ...

Interference and Diffraction

Source: Yong P. Chen, PhD, Department of Physics &#38; Astronomy, College of Science, Purdue University, West Lafayette, IN
Interference and diffraction ...

Photoelectric Effect

Source: Yong P. Chen, PhD, Department of Physics &#38;&#38; Astronomy, College of Science, Purdue University, West Lafayette, IN
Photoelectric effect ...

Reflection and Refraction

Source: Derek Wilson,&#160;Asantha Cooray, PhD, Department of Physics &#38; Astronomy, School of Physical Sciences, University of California, Irvine, CA
...

Evaluate the claims, evidence, and reasoning behind the idea that electromagnetic radiation can be described either by a wave model or a particle model (quantum theory), and that for some situations one model is more useful than the other.

HS-PS4-3.

Electric Charge in a Magnetic Field

Source: Andrew Duffy, PhD, Department of Physics, Boston University, Boston, MA
This experiment duplicates J.J. Thomson's famous experiment at the end of ...

Electromagnetic Fields

Electric fields generated by static charges, often referred to as electrostatic fields, are characteristically different from electric fields created by ...

Electromagnetic Waves

James Clerk Maxwell formulated a single theory combining all the electric and magnetic effects scientists knew during that time, calling the phenomena his ...

Electromagnetic waves are categorized according to their wavelengths and frequencies, giving the electromagnetic spectrum. These waves are classified as ...

Plane Electromagnetic Waves I

The existence of combined electric and magnetic fields that propagate through space as electromagnetic (EM) waves is the most significant prediction of ...

Plane Electromagnetic Waves II

Consider a plane wavefront traveling in position x-direction with a constant speed. This wavefront can be utilized to obtain the relationship between ...

propagation-speed-of-electromagnetic-waves

Propagation Speed of Electromagnetic Waves

Electromagnetic waves are consistent with Ampere&#39;s law. Assuming there is no conduction current Ampere&#39;s law is given as:


Consider a plane ...

Electromagnetic Waves in Matter

Electromagnetic waves can travel in the vacuum as well as in matter. For example light, which is an electromagnetic wave, can travel through air, water, ...

Energy Carried By Electromagnetic Waves

Anyone who has used a microwave oven knows there is energy in electromagnetic waves. Sometimes, this energy is obvious, such as in the summer sun&#39;s ...

Intensity Of Electromagnetic Waves

The energy transport per unit area per unit time, or the Poynting vector, gives the energy flux of an electromagnetic wave at any specific time. For a ...

Momentum And Radiation Pressure

An object absorbing an electromagnetic wave would experience a force in the direction of propagation of the wave. This force occurs because ...

Cardiac Magnetic Resonance Imaging

Source: Frederick W. Damen and Craig J. Goergen, Weldon School of Biomedical Engineering, Purdue University, West Lafayette, Indiana
In this video, high ...

an-introduction-to-drosophila-melanogaster

An Introduction to Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster, also known as the fruit fly, is a powerful model organism widely used in biological research that has made significant ...

Evaluate the validity and reliability of claims in published materials of the effects that different frequencies of electromagnetic radiation have when absorbed by matter.

HS-PS4-4.

FRET as a Molecular Ruler in Cells

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