Activité enzymatique
-
- Pour commencer, il faut déterminer la ligne de base de la réaction de l’enzyme peroxydase. Préparez le substrat en ajoutant 7 ml d’eau distillée dans un tube à essai propre, puis ajoutez 0,2 ml de gaïacol. Remarque : Le gaïacol est un indicateur de changement de couleur qui devient plus jaune-orange au fur et à mesure que la réaction enzymatique progresse.
- Ensuite, ajoutez 0,3 mL de 0,1 % H2O2.
- À l’aide d’un marqueur, étiquetez le substrat du tube à essai, puis recouvrez le tube d’un morceau de film d’étanchéité.
- En maintenant le couvercle en place, retournez le tube quatre fois pour mélanger le contenu du tube.
- Dans un deuxième tube à essai, ajoutez 6,0 mL d’eau distillée et 1,5 mL de peroxydase de navet et étiquetez ce tube « Enzyme ».
- Recouvrez ce tube d’un nouveau morceau de film d’étanchéité et mélangez ces solutions par quatre inversions comme décrit précédemment (étape 4).
- Lorsque les deux tubes ont été mélangés, placez une minuterie sur la paillasse, à côté du support du tube à essai, puis versez le contenu du tube de substrat dans le tube d’enzyme, en faisant attention de ne pas renverser de liquide.
- Ensuite, versez tout le volume du tube enzymatique dans le tube de substrat pour bien mélanger les solutions et recouvrez le tube de substrat avec un autre morceau de film d’étanchéité.
- Mettez le tube à essai dans le rack et démarrez la minuterie.
- Observez la couleur dans le tube de substrat à 0, 1, 2, 3, 4 et 5 minutes, après le mélange.
- Pour quantifier le changement relatif de couleur et la vitesse de la réaction, faites correspondre la couleur observée à la couleur la plus proche de la norme. REMARQUE : Prendre une photo de l’intensité de couleur observée à chaque point d’échantillonnage peut faciliter l’enregistrement des résultats.
- Enregistrez les couleurs que vous voyez dans le tableau. Cliquez ici pour télécharger le Tableau 1
- Étude de l’effet du pH sur l’activité de la peroxydase
- HYPOTHÈSES : Dans cet exercice, l’hypothèse expérimentale est que la vitesse de réaction atteindra un maximum ou un optimum à un pH neutre moyen et que ces taux seront supérieurs ou à peu près égaux à la vitesse de base. L’hypothèse nulle est qu’il n’y aura pas de différences dans les vitesses de réaction entre les traitements de base et les traitements de pH.
- Tout d’abord, étiquetez six tubes à essai propres pour chacun des six niveaux de tampon de pH 3 à 8 et le mot « Enzyme ».
- Ensuite, ajoutez 6 mL des solutions tampons de pH correspondantes fournies par votre instructeur à chacun des tubes à essai.
- Ensuite, ajoutez 1,5 mL de peroxydase de navet dans chaque tube, en prenant soin de ne pas contaminer le compte-gouttes avec la solution tampon.
- Recouvrez les tubes d’enzymes d’un film d’étanchéité et retournez doucement chaque tube pour mélanger le contenu du tube.
- Comme décrit dans l’expérience de réaction de base, fabriquez les substrats pour ces réactions en ajoutant 7 mL d’eau distillée, 0,2 mL de gaïacol et 0,3 mL de 0,1 % H2O2 à six nouveaux tubes à essai propres.
- Ensuite, étiquetez six tubes à essai propres supplémentaires avec les niveaux de pH 3 à 8 et le mot « Solution » et préparez une minuterie.
- Pour travailler rapidement, versez un tube de substrat et un tube de pH dans le tube de solution correspondant. Répétez cette étape pour chacun des différents niveaux de pH.
- Ensuite, recouvrez les tubes d’un film d’étanchéité et mélangez chaque tube avec quatre inversions. Placez chaque tube dans un support de tubes, au fur et à mesure qu’ils sont mélangés.
- Observez la couleur dans chaque tube à l’instant 0 et démarrez immédiatement le minuteur. Continuez à observer la couleur dans chaque tube à chaque minute d’intervalle, jusqu’à 5 minutes.
- À chaque intervalle, utilisez le code couleur de la norme pour enregistrer les couleurs observées dans votre table.
- Étude de l’effet de la température sur l’activité de la peroxydase
- HYPOTHÈSES : Dans cet exercice, l’hypothèse expérimentale est que la vitesse de réaction atteindra un optimum au-dessus de la température ambiante, soit 23 °C, mais en dessous du taux de dénaturation enzymatique et que ce maximum sera supérieur au taux de référence. L’hypothèse nulle est qu’il n’y aura pas de différences dans les vitesses de réaction entre les traitements de référence et les traitements thermiques.
- Remplissez un bécher de 800 ml à mi-chemin du sommet avec de la glace et versez de l’eau froide dans le bécher pour créer un bain de glace. Étiquetez ce bécher comme « Glace ».
- Ensuite, étiquetez quatre nouveaux béchers de 600 ml avec les mêmes températures que vos tubes de substrat et ajoutez 150 ml d’eau du robinet à chacun.
- À l’aide d’une plaque chauffante et d’un thermomètre, amenez les béchers à 25, 35, 45 et 60 °C, selon leurs étiquettes.
- Préparez cinq autres paires de substrats et de tubes enzymatiques, comme décrit pour la réaction de référence, en utilisant de l’eau distillée dans le tube enzymatique, au lieu d’un tampon de pH.
- Étiquetez les tubes de substrat comme « Glace », « 25 °C », « 35 °C », « 45 °C » et « 60 °C ».
- Lorsque tous les bains-marie ont atteint leur température appropriée, mélangez le substrat et les solutions enzymatiques en versant d’abord le contenu de chaque tube de substrat dans un tube d’enzyme, puis en versant à nouveau le contenu du tube d’enzyme dans le tube de substrat.
- Recouvrez les tubes de substrat d’un film d’étanchéité et observez les couleurs au temps 0.
- Ensuite, placez les tubes dans leurs bains de bécher correspondants, en fonction de l’étiquette de température donnée à chaque tube et démarrez une minuterie.
- Pour chaque intervalle de 1 minute, retirez les tubes de l’eau et notez leur couleur, en utilisant le stabdard comme référence.
- Ensuite, placez-les dans leurs bains jusqu’à ce que chaque point temporel, jusqu’à 5 minutes, ait été enregistré.
- Résultats
- Pour déterminer la base de référence de la réaction, tracez graphiquement le changement d’intensité de couleur en fonction du temps. REMARQUE : Le nombre d’unités dont la couleur a augmenté au cours de la période de 5 minutes servira de taux de réaction de référence pour la comparaison relative.
- Maintenant, tracez graphiquement la différence d’intensité de couleur par rapport aux niveaux de pH utilisés dans la première expérience.
- Ajoutez la ligne de base pour comparaison, puis déterminez si la vitesse de réaction optimale était supérieure, inférieure ou égale à la ligne de base.
- À l’aide de ce graphique, déterminez le pH optimal pour la réaction. Remarque : La réaction peut ne pas se produire à chaque pH. Le pH optimal pour l’enzyme peroxydase est généralement de l’ordre de 6 à 7. En exposant l’enzyme à un substrat avec différents niveaux de pH, vous remarquerez une baisse de la vitesse de réaction à mesure que le pH de l’enzyme devient plus basique, ce qui rend l’enzyme plus instable.
- Enfin, tracez graphiquement la différence d’intensité de couleur au fil du temps pour les différentes températures utilisées dans la deuxième expérience, en utilisant la même base de référence.
- À l’aide de ce graphique, déterminez la température optimale pour la réaction et comparez-la à la ligne de base. REMARQUE : La réaction peut ne pas se produire à toutes les températures. Dans cette expérience, la réaction semble plus efficace autour de 45 °C, et au-dessus de cela, l’enzyme peroxydase commence à se dénaturer. Pour cette raison, il ne doit pas produire de changement de couleur dans le bécher à 60 °C. La vitesse de réaction ralentira ou s’arrêtera également dans le bain de glace, car il n’y a pas assez d’énergie pour que l’enzyme catalyse la réaction.
View the full transcript and gain access to JoVE Lab Manual videos
Q1: What is guaiacol and why is it used in the peroxidase enzyme experiment?
Guaiacol is a color-changing indicator that becomes progressively more yellow-orange as the peroxidase enzyme reaction progresses. It allows researchers to visually track enzyme activity by observing the color intensity change over time, making it possible to quantify the relative reaction rate by comparing observed colors to a standard reference.
Q2: How do you prepare the substrate and enzyme solutions for the baseline peroxidase reaction?
The substrate is prepared by combining 7 mL distilled water, 0.2 mL guaiacol, and 0.3 mL of 0.1% hydrogen peroxide in a test tube. The enzyme solution contains 6.0 mL distilled water and 1.5 mL turnip peroxidase. Both are mixed separately by four inversions, then combined and mixed again before timing begins.
Q3: What is the optimal pH range for peroxidase enzyme activity?
The optimal pH for peroxidase enzyme activity is typically in the range of 6 to 7, representing a mid-range neutral pH. As pH becomes more basic, enzyme stability decreases and reaction rates drop significantly. Testing pH levels 3 through 8 reveals this optimal range through color intensity measurements.
Q4: Why does peroxidase enzyme activity decrease at high temperatures?
At high temperatures, the peroxidase enzyme begins to denature, losing its three-dimensional structure and catalytic ability. Above 45 degrees Celsius, the enzyme becomes increasingly unstable and produces little to no color change. At 60 degrees Celsius, the enzyme is sufficiently denatured that the reaction does not occur.
Q5: What is the optimal temperature for peroxidase enzyme activity in this experiment?
The peroxidase enzyme shows maximum efficiency around 45 degrees Celsius in this experiment. This temperature balances sufficient molecular energy for catalysis with enzyme stability. Below this temperature, reaction rates are slower, and above it, enzyme denaturation significantly reduces activity and color production.
Q6: How does temperature affect enzyme reaction rates at low temperatures?
At low temperatures, such as in an ice bath, the reaction rate slows or stops because there is insufficient molecular energy for the enzyme to catalyze the reaction effectively. Reduced thermal energy limits enzyme-substrate collisions and the rate of product formation, resulting in minimal or no observable color change.
Q7: How do you quantify enzyme activity changes in this peroxidase experiment?
Enzyme activity is quantified by graphing color intensity changes against time or experimental conditions. The baseline reaction establishes a reference rate measured in color units over five minutes. Comparing pH and temperature treatments to this baseline reveals how environmental factors affect reaction rates and enzyme efficiency.