Diversité microbienne et fongique

Notions clésPréparation de l’enseignantProtocole de l’étudiant
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Print Procedure Steps
  1. Examen des structures des colonies microbiennes ul class="lab-items">
  2. Pour commencer, récupérez les plaques de culture qui vous ont été allouées, puis retirez le Parafilm et le couvercle de l’une d’elles.
  3. Placez la plaque découverte sous un microscope de dissection, puis observez les communautés individuelles dans chaque quadrant de la plaque.
  4. Au fur et à mesure que les colonies sont identifiées, remplissez les propriétés de la colonie observée dans la colonne appropriée du tableau. Cliquez ici pour télécharger le Tableau 1
  5. Ensuite, répétez les observations pour chacune des deux autres espèces bactériennes.
  6. Pour effectuer une coloration de Gram de vos trois espèces bactériennes, étiquetez d’abord les extrémités de trois lames de microscope avec les initiales de chaque espèce de bactérie, vos initiales et la date. HYPOTHÈSES : Dans cette expérience, l’hypothèse expérimentale pourrait être qu’il est possible d’élucider différentes espèces et formes bactériennes en utilisant la coloration de Gram, et que les bactéries à Gram positif se colorent en violet cristallin tandis que les bactéries à Gram négatif apparaissent roses en raison de la contre-coloration à la safranine. L’hypothèse nulle pourrait être que tous les types de bactéries conserveront les deux colorants de manière égale, et que la coloration n’aidera pas à élucider leur espèce ou leur forme.
  7. Pour commencer la première coloration, fixez un clip à la lame pour faciliter la manipulation. Pour chaque frottis bactérien, n’oubliez pas de vous assurer d’utiliser une boucle d’inoculation nettoyée et stérilisée à la flamme.
  8. Placez deux boucles d’eau distillée stérile au centre de la lame.
  9. Après avoir stérilisé à nouveau la boucle, refroidissez la boucle en touchant plusieurs fois une partie non inoculée de la gélose.
  10. Ensuite, prélevez une petite quantité de culture d’une colonie isolée et mélangez-la avec l’eau sur la lame.
  11. Laissez la lame sécher à température ambiante et fixez thermiquement le frottis en le passant rapidement à travers une flamme.
  12. Une fois sec, pipetez plusieurs gouttes de violet cristallin sur la lame et laissez-le reposer pendant deux à trois minutes.
  13. Rincez soigneusement la lame à l’eau distillée en orientant le flux direct vers le haut de la lame, permettant à l’eau de s’écouler doucement vers le bas. Ne dirigez pas le débit d’eau directement vers le frottis.
  14. Ensuite, recouvrez la lame avec de l'iode de Gram, laissez-la reposer à nouveau pendant deux minutes, puis rincez doucement à l'eau distillée.
  15. Décolorez la lame avec de l’éthanol à 95 % jusqu’à ce que la tache ne disparaisse plus.
  16. Rincez immédiatement la lame à l’eau distillée. Cela limitera la sur-décoloration.
  17. Ensuite, ajoutez plusieurs gouttes de contre-colorant à la safranine et laissez agir 30 s. Cela tachera toutes les cellules à Gram négatif présentes.
  18. Rincez doucement la lame à l’eau distillée et séchez-la avec du papier absorbant.
  19. Après avoir coloré les deux autres lames de la même manière (étapes 6 à 17), observez chacune d’elles avec un microscope.
  20. Utilisez d’abord un objectif de faible puissance pour effectuer des ajustements grossiers. Lorsque vous avez trouvé une section idéale, passez aux grossissements les plus élevés.
  21. Après avoir procédé à une nouvelle imagerie et ajusté le frottis avec un objectif de puissance moyenne, ajoutez de l’huile d’immersion directement dans le frottis. REMARQUE : L’huile est nécessaire pour les objectifs de haute puissance qui fourniront les meilleures micrographies.
  22. Maintenant, utilisez des crayons de couleur pour dessiner les bactéries observées dans les cercles de grossissement appropriés et remplissez les caractéristiques observées dans la colonne appropriée, en notant la forme de la bactérie et si elle est Gram-positive, identifiée par une coloration violette plus foncée, ou Gram-négative, identifiée par une coloration rose. Cliquez ici pour télécharger le Tableau 2
  23. Enfin, répétez l’observation, le dessin et la caractérisation pour les deux autres lames bactériennes colorées.
  24. Examen des structures fongiques ul class="lab-items">
  25. Retirez la plaque de S. cerevisiae de l’incubateur et placez une goutte d’eau sur une lame de microscope.
  26. À l’aide d’une boucle d’inoculation stérilisée, étalez une pellicule de levure dans la goutte d’eau et placez une lamelle sur la lame.
  27. Placez la lame sous le microscope au grossissement le plus faible, en augmentant le grossissement jusqu’au réglage d’immersion dans l’huile pour voir les cellules de levure individuelles.
  28. Observez la forme et la structure générales de la levure et identifiez toutes les cellules qui subissent une reproduction asexuée par bourgeonnement.
  29. Maintenant, dessinez les cellules dans les cercles d’agrandissement appropriés.
  30. Lorsque vous avez fini d’observer la levure, remplacez la lame de S. cerevisiae par une lame d’apothécium d’Ascomycetes préparée et réglez le microscope sur le grossissement le plus bas.
  31. À l’aide de crayons de couleur, dessinez les structures à faible et fort grossissement, y compris les asques et les ascospores.
  32. Enfin, placez un champignon de Paris, Agaricus bisporus, sous le microscope de dissection et dessinez les caractéristiques, y compris le pileus, ou chapeau, les branchies, et le stipe, ou tige.
  33. Résultats
    • En utilisant la coloration des bactéries enregistrées dans le tableau, déterminez quelles espèces sont Gram-positif et lesquelles sont Gram-négatif.
    • Ensuite, examinez les formes enregistrées dans le tableau pour déterminer quelles espèces bactériennes sont le bacille, le coccus ou le spirille.
    • Comparez ensuite vos illustrations des cellules de levure à vos illustrations des cellules bactériennes. REMARQUE : Les levures de l’embranchement des Ascomycètes, telles que S. cerevisiae, peuvent se reproduire de manière asexuée, ce qui peut être observé par le bourgeonnement des cellules au microscope.
    • Enregistrer toutes les observations de bourgeonnement des cellules de levure. REMARQUE : Les ascomycètes peuvent également se reproduire sexuellement via la mitose et la formation de spores haploïdes.
    • Notez toutes les observations de formation de spores ou d’asques que vous avez observées dans le tableau.
    • REMARQUE : Les champignons de l’embranchement des Basidiomycota présentent des branchies clairement observables sous le pileus.
    • Enregistrer toute espèce fongique qui a montré des branchies sous le pileus.

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