15.9: Isolement de l'ADN

L’ADN des cellules est nécessaire pour de nombreuses applications de biotechnologie et de recherche, telles que le clonage moléculaire. Pour enlever et purifier l’ADN des cellules, les chercheurs utilisent diverses méthodes d’extraction de l’ADN. Bien que les spécificités des différents protocoles puissent varier, certains concepts généraux sont à la base du procédé d’extraction de l’ADN.

Le procédé

Tout d’abord, les cellules doivent être lysées — ouvertes — pour libérer l’ADN dans la solution. Les cellules peuvent être physiquement lysées à l’aide d’équipements tels qu’un homogénéisateur, un sonicateur ou un broyeur à billes, qui broient ou sinon appliquent de la force pour briser les cellules ouvertes. Souvent, des substances telles que du détergent sont ajoutées pendant la lyse pour perturber chimiquement les membranes cellulaires à base de lipides, ce qui aide à libérer l’ADN du noyau et de la cellule. La rotation dans une centrifugeuse sédimente les débris cellulaires vers le fond et le lysat, contenant le matériel cellulaire, est recueilli pour un traitement ultérieur.

L’ADN doit alors être séparé des autres molécules cellulaires, telles que l’ARN et les protéines. Par conséquent, des enzymes telles que la RNase et la protéinase K sont souvent ajoutées pendant ou après la lyse pour dégrader l’ARN et les protéines, respectivement. En outre, des solvants organiques tels que le phénol et le chloroforme sont couramment utilisés pour séparer l’ADN des protéines. Normalement, l’échantillon est vortexé avec du phénol-chloroforme, puis centrifugé pour séparer les phases aqueuse et organique dans le tube. La phase aqueuse au-dessus contenant l’ADN peut alors être pipettée, laissant derrière elle la protéine dans la phase organique.

Des sels sont souvent ajoutés lors de l’extraction de l’ADN pour stabiliser l’ADN et aider à le précipiter hors de solution. Une méthode standard de précipitation d’ADN consiste à ajouter de l’alcool glacé, comme l’éthanol ou l’isopropanol, à l’échantillon. Cela fait que l’ADN forme un précipité trouble blanc à l’intérieur du liquide dans le tube.

On fait ensuite tourner l’échantillon dans une centrifugeuse, ce qui a pour effet de rassembler le précipité de l’ADN au fond du tube comme un culot. Le culot est lavé en enlevant le liquide, en le lavant dans l’alcool et en le faisant tourner à nouveau. Après le lavage final, le culot est remis en suspension dans un tampon, créant une solution aqueuse d’ADN purifié qui est prête à être étudiée ou utilisée en biotechnologie.

L'extraction d'ADN est l'enlèvementet la purification de l'ADN des cellules. D'abord, les cellules sont lysées, ouvertes,généralement par une combinaison de perturbations physiqueset de traitements chimiques comme avec un détergentce qui dissout la cellule et les membranes nucléaires. Le contenu peut alors flotter librementdans la solution environnante.

Ensuite, l'ADN doit être séparédes autres molécules présentes. Des solvants organiques, comme le phénol et le chloroforme,sont couramment utilisés pour séparerles acides nucléiques des protéinesen raison de leur solubilité différente. En outre, les enzymes protéinase et RNasepeuvent être utilisées pour dégrader les protéines et l'ARN,laissant l'ADN intact.

Le sel est généralement ajouté à l'échantillonce qui stabilise les groupes phosphate chargés négativementdans la structure de l'ADN,et après l'ajout d'alcool glacé,précipite l'ADN hors de la solution. Le précipité blanc est recueillien le faisant tourner dans une centrifugeuseoù il se dépose au fond du tube. Après lavage et re-suspensiondans une solution tampon,l'ADN extrait peut enfin être utilisé en rechercheou en biotechnologie.