What is the purpose of the sand layer in column chromatography?

The sand layer, placed 0.5 cm above the cotton plug, prevents silica gel from passing through the plug into your collected fractions. This protective barrier ensures that only the separated dyes are collected in pure fractions, maintaining the integrity of your samples throughout the separation process.

Why does column chromatography use two different eluents for separating food dyes?

Using ethanol first elutes erioglaucine, which has lower affinity for silica gel, while water elutes tartrazine more effectively due to its higher polarity. This two-solvent approach saves time and minimizes solvent waste while maintaining fraction purity, compared to using a single eluent throughout the entire separation.

How do you prepare the silica gel slurry for column chromatography?

Weigh 5 grams of silica gel powder and mix it with 18 mL of 95% ethanol in a beaker. Stir with a glass rod until the texture is consistent and resembles batter with no dry patches or clumps. The slurry should flow easily to avoid clogging the funnel or trapping air bubbles in the column.

What flow rate should you maintain when eluting dyes through the column?

Adjust the stopcock so the solvent level decreases approximately 1 mL every 15 to 20 seconds. Maintain at least 1 cm of solvent above the silica gel at all times by periodically refilling the column. This controlled solvent flow rate ensures proper separation and prevents band broadening during the elution process.

How do you apply the green food dye to the silica gel column?

Use a clean pipette to gently apply 5 to 7 drops of the dye solution evenly across the top of the silica gel. If necessary, add a few drops of ethanol to keep the silica gel covered. Allow the dye to soak in before beginning the elution process with your chosen eluent.

What do the different colors of fractions tell you about dye affinity for silica gel?

The blue erioglaucine elutes with ethanol, indicating lower affinity for silica gel, while yellow tartrazine requires water, indicating higher affinity. This separation demonstrates that tartrazine binds more strongly to silica gel than erioglaucine does, which is why different solvents are needed to elute each dye effectively.

Why is it important to avoid stopping the column chromatography for extended periods?

Stopping for more than 1 minute at a time causes compound bands to start broadening, which reduces separation quality and makes it harder to collect pure fractions. Continuous flow maintains sharp band definition and ensures efficient separation of the dyes throughout the elution process.

Chromatographie en colonne

Notions Préparation de l'instructeur Protocole étudiant

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La chromatographie sur colonne est une technique qui utilise une colonne garnie pour séparer les composés en fonction de leurs interactions avec une phase stationnaire, qui se présente généralement sous la forme de billes microscopiques. Les espaces entre les billes sont remplis de solvant. L’ouverture de la colonne permet au solvant de s’écouler à travers la phase stationnaire. Lorsqu’un mélange est appliqué sur le dessus de la colonne garnie, suivi d’une plus grande quantité de solvant, le mélange passe à la phase mobile et s’écoule à travers la phase stationnaire.

Chaque composant du mélange interagit avec la phase stationnaire d’une manière différente. Certains composants ont de faibles interactions avec la phase stationnaire et se déplacent donc rapidement dans la colonne, tandis que d’autres ont de fortes interactions avec la phase stationnaire et se déplacent donc plus lentement. Cela sépare les différents composés en bandes, qui sont collectées en petites fractions. Cela permet la purification de chaque composé.

Alors, quels types de propriétés peuvent être utilisés pour séparer les mélanges ? L’une des propriétés les plus couramment utilisées est la polarité. Pour cela, le gel de silice, qui est une forme de dioxyde de silicium, est souvent utilisé comme phase stationnaire. Le gel de silice interagit avec les composés par des interactions dipôle-dipôle et une liaison hydrogène par le biais des groupes -OH qui se forment à sa surface. Ainsi, les composés polaires interagissent fortement avec la phase stationnaire, tandis que les composés non polaires interagissent faiblement.

D’autres propriétés qui peuvent être exploitées pour la séparation comprennent la taille, la charge et l’hydrophobie. Une façon courante de charger la phase stationnaire dans la colonne est de la transformer en suspension de la phase stationnaire et du solvant. Ensuite, la phase stationnaire est remplie en faisant circuler plus de solvant à travers la colonne pour compacter la boue. Il est essentiel que la phase stationnaire soit emballée uniformément sans bulles d’air, canaux vides ou zones sèches. Ceux-ci peuvent perturber le flux et provoquer un mélange de bandes.

Lors du choix d’une colonne, le diamètre est basé sur le volume de l’échantillon à séparer. L’échantillon doit recouvrir le haut de la colonne d’une couche mince et uniforme. Une couche d’échantillon plus épaisse conduit à des bandes plus larges. La longueur de la colonne dépend de la façon dont les composés se séparent sur la phase stationnaire. Les composés ayant des affinités similaires pour la phase stationnaire nécessitent une longue colonne pour une séparation adéquate. Cependant, un mélange de composés ayant des affinités très différentes pour la phase stationnaire peut être séparé sur une colonne plus courte.

Dans cet atelier, vous explorerez la chromatographie sur colonne en emballant et en préparant d’abord une colonne de gel de silice. Ensuite, vous utiliserez votre colonne pour séparer les composants colorés dans un colorant alimentaire vert.

Print Procedure Steps

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Source : Lara Al Hariri et Ahmed Basabrain de l’Université du Massachusetts Amherst, MA, États-Unis

colorant alimentaire
Dans cette expérience, vous allez utiliser la chromatographie sur colonne pour séparer les colorants alimentaires verts en leurs colorants bleus et jaunes, appelés érioglaucine et tartrazine. Tout d'abord, vous utiliserez de l'éthanol à 95 % pour éluer le colorant avec une affinité plus faible pour le gel de silice. Ensuite, vous allez rincer le deuxième colorant de la colonne avec de l'eau. Pour récupérer les colorants purifiés, vous collecterez chaque bande de colorant au fur et à mesure qu’elle quitte la colonne. Ces volumes collectés sont appelés fractions.
- Pour commencer, enfile une blouse de laboratoire, des lunettes de sécurité et une paire de gants en nitrile.
- Apportez une colonne ou une burette à la zone d’approvisionnement centrale. Obtenez un morceau de coton ou de laine de verre et pressez-le dans le haut de votre colonne. Utilisez un fil ou une tige longue à extrémité émoussée pour le pousser vers le bas afin de boucher la colonne juste au-dessus du robinet d’arrêt. note: Le coton doit être stable, mais ne le tassez pas trop densément, car le solvant doit le traverser facilement. Assurez-vous que le robinet d’arrêt peut tourner librement sans s’accrocher à la prise.
- Fixez une burette clamp à un support de laboratoire et fixez la colonne à la verticale avec environ 4 pouces d’espace en dessous. Assurez-vous que le robinet d’arrêt est fermé.
- Étiquetez un bécher de 100 ml comme « déchet » et placez-le sous la colonne.
- Ensuite, mesurez 1 g de sable dans un bateau de pesée taré et ramenez-le sur la paillasse.
- Ensuite, marquez la colonne à environ 0,5 cm au-dessus du haut du bouchon de coton.
- Placez un petit entonnoir en haut de la colonne et versez suffisamment de sable à travers l’entonnoir pour qu’il y ait une couche de 0,5 cm de profondeur sur le bouchon. Cela empêchera le gel de silice de passer à travers le bouchon dans vos fractions.
- Retirez l’entonnoir et tapotez doucement la colonne pour répartir uniformément le sable.
- Maintenant, préparez vos éluants. Étiquetez un bécher de 50 ml et un cylindre gradué de 50 ml comme étant de l’eau.
- Mesurez 50 mL d’eau déminéralisée avec le cylindre gradué et versez-le dans le bécher.
- Ensuite, étiquetez un autre bécher de 50 ml et une bouteille graduée de 50 ml comme 'éthanol'. Mesurez 50 ml d’éthanol à 95 % et versez-le dans ce bécher.
- Maintenant, procurez-vous 4 ou 5 pipettes Pasteur propres et une poire de pipette. Pipetez doucement 7 à 8 ml d’éthanol le long des parois intérieures de la colonne. Cette couche de solvant vous permettra de verser cette boue de gel de silice dans la colonne sans perturber le sable.
- Ouvrez le robinet d’arrêt et vidangez ~1 mL d’éthanol dans le bécher à déchets pour évacuer l’air du robinet d’arrêt et pour confirmer que le solvant s’écoule facilement à travers le bouchon. Assurez-vous qu’il n’y a pas de plaques sèches dans le sable et le bouchon et tapotez doucement le côté de la colonne pour éliminer les bulles d’air emprisonnées.
- Ensuite, placez un entonnoir propre en haut de la colonne et étiquetez un troisième bécher de 50 ml « boue de gel de silice dans de l’éthanol ».
- Pesez soigneusement 5 g de poudre de gel de silice et versez-la dans votre bécher étiqueté.
- Ensuite, apportez le gel de silice, une tige de verre et votre cylindre gradué d’éthanol à la hotte de distribution d’éthanol.
- Mesurez 18 ml d’éthanol à 95 % et versez-le dans le bécher. Mélangez le mélange avec la tige de verre jusqu’à ce que la texture soit consistante et qu’il ne reste plus de plaques sèches ou de grumeaux de poudre. Cela prend généralement ~1 min. Remarque : La boue doit être épaisse, comme de la pâte, mais elle doit toujours s’écouler facilement. Si la boue est trop rigide, elle pourrait obstruer l’entonnoir ou piéger des bulles d’air dans la colonne.
- Une fois que la poudre est complètement en suspension dans l’éthanol, apportez-la à votre paillasse. Remuez la bouillie jusqu’à ce que sa texture soit à nouveau consistante et versez-la immédiatement dans la colonne.
- Tapotez doucement les côtés de la colonne pendant que le gel de silice se dépose pour éliminer les bulles d’air.
- Rincez le bécher avec 1 ou 2 mL d’éthanol et versez le rinçage dans la colonne. Ensuite, retirez l’entonnoir et mettez-le de côté.
- Pipette l’éthanol à l’intérieur de la colonne pour éliminer les particules collées aux parois. Ensuite, égouttez le solvant jusqu’à ce que le ménisque soit à peine au-dessus du haut du gel de silice.
- Maintenant, utilisez un cylindre gradué de 5 ou 10 ml pour obtenir environ 0,8 ml de la solution de colorant alimentaire vert.
- Utilisez une pipette propre pour appliquer doucement 5 à 7 gouttes de la solution de colorant uniformément sur le dessus du gel de silice. Si nécessaire, ajoutez quelques gouttes d’éthanol pour garder le gel de silice couvert.
- Pendant que vous attendez que le colorant pénètre, étiquetez deux béchers propres de 50 ml comme 'fraction d’éthanol' et 'fraction d’eau'. Remplacez le bécher de déchets sous la colonne par le bécher à fraction d’éthanol.
- Ensuite, remplissez la colonne d’éthanol, en pipetant le premier mL le long des parois internes pour éviter de perturber le gel de silice.
- Ensuite, ouvrez le robinet d’arrêt à mi-chemin et ajustez-le jusqu’à ce que le niveau de solvant diminue de ~1 mL toutes les 15 à 20 s.
- Remplissez périodiquement la colonne pour maintenir l’écoulement de l’éthanol. Assurez-vous qu’il y a au moins 1 cm de solvant au-dessus du gel de silice à tout moment.
- Surveille les bandes jaune et bleue lorsqu’elles se séparent. note: Si vous devez vous éloigner, fermez le robinet d'arrêt afin que la colonne ne s'assèche pas pendant votre absence. Évitez de vous arrêter plus de 1 minute à la fois car les bandes composées commenceront à s’élargir. Il faut généralement environ 20 à 35 minutes pour que le colorant qui se déplace le plus rapidement quitte la colonne.
- Une fois que vous avez collecté tout le colorant qui se déplace le plus rapidement dans le bécher à fraction d’éthanol, fermez le robinet d’arrêt, mettez la fraction d’éthanol de côté et placez le bécher de déchets sous la colonne.
- Égouttez le solvant jusqu’à ce que le ménisque soit juste au-dessus du haut du gel de silice. Ensuite, remplacez le bécher à déchets par le bécher à fraction d’eau.
- Utilisez une pipette propre pour remplir le haut de la colonne avec de l’eau déminéralisée. Ensuite, ouvrez le robinet juste assez pour laisser l’eau s’écouler dans la colonne à un débit d’environ 1 mL toutes les 15 à 20 s.
- Remplissez la colonne d’eau si nécessaire jusqu’à ce que la deuxième bande de couleur ait complètement quitté la colonne. Cela prend généralement encore 15 à 25 minutes. Ensuite, fermez le robinet d’arrêt et remplacez le bécher à fraction d’eau par le bécher à déchets.
- Maintenant, vidangez complètement la colonne et laissez le robinet d’arrêt ouvert.
- Notez les couleurs des fractions d’éthanol et d’eau dans votre cahier de laboratoire.
  Tableau 1 : Chromatographie sur colonne des colorants alimentaires
  
  Couleur Contenance (mL)
  Fraction d’éthanol
  Fraction d’eau
  Cliquez ici pour télécharger le Tableau 1
- Versez les fractions dans les cylindres gradués correspondants de 50 mL et notez le volume de chaque fraction. Ensuite, fermez le robinet d’arrêt et amenez la colonne vers une hotte.
- Fixez la colonne à la verticale dans le capot pour que le gel de silice puisse sécher. Votre instructeur vous dira soit comment nettoyer la colonne, soit s’en occupera après le laboratoire.
- Maintenant, jetez les fractions collectées et les restes d’éthanol, d’eau et de solution de colorant dans le drain et nettoyez le reste de votre verrerie comme d’habitude.
- Jetez les pipettes Pasteur usagées dans les déchets de verre. Jetez les essuie-tout usagés et le bateau de pesée dans la poubelle du laboratoire et nettoyez la paillasse avant de partir.
Results