Spectroscopie UV-Vis des colorants

Lorsque la lumière atteint une substance, une partie est absorbée par celle-ci, tandis que le reste est soit réfléchi, soit transmis à travers elle. La couleur de la substance, telle que nous la percevons, dépend des longueurs d’onde qu’elle est le plus susceptible de refléter. Par exemple, un morceau de tissu que nous voyons comme bleu contient un colorant qui réfléchit fortement la lumière bleue et absorbe fortement la lumière orange et rouge.

Les colorants sont généralement des composés conjugués, ce qui signifie qu’ils ont une alternance de liaisons doubles et simples. Les électrons peuvent se déplacer librement dans le système conjugué. Les colorants de couleurs différentes doivent varier dans les longueurs d’onde de la lumière qu’ils absorbent. Lorsque nous regardons quelques exemples, nous voyons que la longueur d’onde absorbée augmente avec la quantité de conjugaison.

Alors, comment la longueur d’onde est-elle liée au degré de conjugaison ? Considérons les niveaux d’énergie moléculaire. Nous pouvons considérer les électrons délocalisés comme occupant des orbitales moléculaires, ou MO. Une molécule absorbe la lumière avec l’énergie exacte nécessaire pour exciter un électron vers une orbitale moléculaire de plus haute énergie. La transition la plus probable se fait de l’orbitale moléculaire occupée la plus élevée, appelée HOMO, à l’orbitale moléculaire inoccupée la plus basse, ou LUMO. Ainsi, nous nous attendons à ce que la longueur d’onde la plus absorbée corresponde à l’écart d’énergie HOMO – LUMO.

Les molécules avec peu ou pas de conjugaison ont généralement un grand écart HOMO-LUMO. Ils absorbent la lumière UV et réfléchissent toute la lumière visible, de sorte qu’ils apparaissent blancs ou incolores. Les liaisons conjuguées stabilisent les molécules en abaissant leurs niveaux d’énergie, en particulier à haute énergie. Plus le degré de conjugaison est élevé, plus l’écart HOMO – LUMO est petit et plus la longueur d’onde absorbée est grande. Les métaux et les substitutions affectent également l’écart.

Prenons un exemple. Le rétinol a un petit système conjugué, tandis que la chlorophylle a a un grand système avec de l’azote et du magnésium. Le rétinol absorbe à 325 nm, tandis que la chlorophylle a absorbe à 430 et 662 nm. Comme prévu, l’écart d’énergie du rétinol est plus important.

Nous pouvons étudier l’absorption à l’aide d’un spectrophotomètre UV et lumière visible, ou spectrophotomètre UV-Vis. Un spectrophotomètre se compose d’une source lumineuse, d’un moyen de contrôler les longueurs d’onde que l’échantillon reçoit et d’un détecteur de lumière. L’échantillon est généralement une solution transparente. L’absorbance peut être mesurée à une longueur d’onde spécifique ou mesurée sur une gamme de longueurs d’onde, car les composés absorbent souvent à plus d’une longueur d’onde. De plus, nous voyons une gamme de longueurs d’onde pour chaque transition car les molécules sont dans des orientations et des états vibratoires différents.

Pendant la mesure, la lumière est absorbée, passe à travers sans entrer en contact avec les molécules ou rebondit sur un solvant ou une molécule composée. Nous ignorons la petite quantité de lumière qui rebondit vers l’arrière. Parfois, la lumière qui pourrait être absorbée par une molécule rebondit sur celle-ci à la place. Nous décrivons la capacité d’une substance à transmettre une longueur d’onde spécifique avec un coefficient d’atténuation molaire unique. Alors que l’absorbance change avec la concentration, le coefficient d’atténuation molaire ne change pas.

Après la mesure, le spectrophotomètre compare la lumière reçue et la lumière d’origine dans un rapport appelé transmittance. L’absorbance est le logarithme de transmission négatif en base 10. Si le spectrophotomètre a l’absorbance du solvant, il le soustrait pour ne montrer que le composé. Les résultats sont généralement affichés en fonction de l’absorbance en fonction de la longueur d’onde. La longueur d’onde à laquelle le composé absorbe le plus est appelée lambda max. Si nous calculions le coefficient d’atténuation molaire pour chaque longueur d’onde, il serait le plus élevé à lambda max.

Le coefficient d’atténuation molaire, l’absorbance, la concentration de l’échantillon et la longueur du trajet, qui est la distance parcourue par la lumière à travers l’échantillon, sont liés par la loi de Beer-Lambert. Si nous connaissons trois variables, nous pouvons calculer la quatrième.

Dans cet atelier, vous analyserez les caractéristiques d’absorption de la fluorescéine, du bêta-carotène et du colorant indigo à l’aide d’un spectrophotomètre UV-Vis. Vous utiliserez ensuite la loi de Beer-Lambert pour créer une courbe d’étalonnage du β-carotène, puis déterminerez la concentration de la solution de β-carotène.