Spectroscopie UV-Vis des colorants

Source : Lara Al Hariri et Ahmed Basabrain de l’Université du Massachusetts Amherst, MA, États-Unis

1. AbsorbanceExpand

   Dans la première partie du laboratoire, vous utiliserez la spectroscopie d'absorption de la lumière ultraviolette et visible, ou spectroscopie d'absorption UV-Vis, pour analyser les caractéristiques d'absorption de la fluorescéine, du β-carotène et du colorant indigo. Pour effectuer une spectroscopie UV-Vis, vous allez placer une solution entre une source lumineuse et un photodétecteur. Les molécules absorberont la lumière à des longueurs d’onde qui correspondent aux énergies nécessaires pour exciter leurs électrons et diffuser ou transmettre le reste.

   Un spectre d’absorption représente la variation du nombre de photons de chaque longueur d’onde qui atteignent le détecteur. Une absorbance plus élevée correspond à moins de photons détectés de cette longueur d’onde. Vous prendrez d'abord un spectre du solvant pur, que l'instrument soustraira du spectre de la solution de colorant pour vous montrer uniquement les données d'absorbance du colorant. Cette référence s’appelle une ébauche de solvant.

   • Avant de commencer, enfilez une blouse de laboratoire, des lunettes de sécurité et des gants. note: Les solutions de β-carotène et d’indigo utilisent respectivement de l’hexane et du diméthylformamide, de sorte que vous travaillerez avec les colorants dans une hotte. Le DMF et l’hexane dégradent les gants en nitrile fins, alors changez vos gants si vous y trouvez du solvant.
   • Maintenant, obtenez une cuvette en quartz propre. Les cuvettes ont généralement deux côtés transparents et deux côtés texturés ou opaques. Tenez toujours la cuvette par les côtés texturés pour garder les côtés transparents propres.
   • Tout d'abord, vous allez analyser une solution de fluorescéine dans l'eau. Pour rendre votre solvant vierge, remplissez votre cuvette aux 3/4 environ avec de l’eau déminéralisée.
   • Maintenant, nettoyez les côtés transparents de la cuvette avec une lingette de laboratoire. Vérifiez que la cuvette ne contient pas de bulles d’air et tapotez doucement la cuvette pour les déloger.
   • Ensuite, amenez la cuvette au spectromètre. Ouvrez la chambre d’échantillonnage du spectromètre et nettoyez une dernière fois votre cuvette. Les taches et la poussière peuvent absorber ou réfléchir la lumière, ce qui introduira des erreurs dans les données.
   • Maintenant, insérez la cuvette dans le porte-échantillon de manière à ce que les côtés transparents soient alignés avec la source lumineuse. Fermez complètement la porte de la chambre d’échantillonnage. Suivez les instructions du logiciel de votre spectromètre pour configurer un balayage de l’absorbance de 200 à 800 nm et balayez votre cuvette en tant qu’ébauche de solvant.
   • Une fois le balayage terminé, videz la cuvette et utilisez de l’air comprimé pour retirer les grosses gouttes d’eau.
   • Ensuite, apportez-le à la hotte partagée et utilisez une pipette Pasteur propre pour remplir la cuvette aux 3/4 de la solution de fluorescéine 3 μM fournie.
   • Vérifiez la présence de bulles d’air dans la cuvette et retirez-les si nécessaire avant d’amener la cuvette au spectromètre. N’oubliez pas de nettoyer une dernière fois les côtés transparents avant de placer la cuvette dans la chambre d’échantillonnage. Ensuite, scannez la cuvette comme votre échantillon.
   • Une fois le balayage terminé, identifiez les longueurs d’onde absorbées par la fluorescéine. La longueur d’onde avec l’absorbance la plus élevée est appelée λ_max.
   • Enregistrez les longueurs d’onde des pics d’absorbance et la plage d’absorption globale dans votre cahier de laboratoire, puis sauvegardez les données.

     Tableau 1 : Absorbance et λ_max des colorants

     	Plage d’absorbance (nm)	λmax (nm)
     fluorescéine
     β-carotène
     indigo

     Cliquez ici pour télécharger le Tableau 1
   • Maintenant, videz votre cuvette dans les déchets aqueux et rincez-la à l’eau pour éliminer les traces de fluorescéine.
   • Vous analyserez ensuite le β-carotène, vous avez donc besoin d'une ébauche de solvant hexane. Rincez la cuvette à l’hexane plusieurs fois pour éliminer l’eau restante avant de la remplir aux 3/4 d’hexane pur.
   • Retirez les bulles d’air, nettoyez les côtés de la cuvette et placez-la dans le spectromètre. Assurez-vous que le balayage est réglé pour une absorbance de 200 à 800 nm, puis scannez la cuvette comme une ébauche de solvant.
   • Une fois le balayage terminé, videz la cuvette dans les déchets organiques et séchez-la à l’air comprimé.
   • Utilisez une pipette propre pour remplir la cuvette aux 3/4 de la solution de β-carotène de 3 μM fournie et retournez au spectromètre.
   • Nettoyez les côtés transparents de la cuvette, placez-la dans le spectromètre et scannez-la comme votre échantillon. Écrivez les longueurs d’onde des pics dans votre cahier de laboratoire et enregistrez les données.
   • Maintenant, analysez le colorant indigo. La solution d’indigo est dans du DMF, alors videz votre cuvette dans les déchets organiques et rincez les restes de β-carotène et d’hexane avec du DMF pur.
   • Remplissez la cuvette aux 3/4 de DMF pur, placez-la dans le spectromètre et assurez-vous que les paramètres de balayage sont les mêmes que précédemment. Exécutez le balayage à blanc de solvant, puis videz la cuvette dans les déchets organiques et séchez-la à l’air comprimé.
   • Utilisez une pipette propre pour remplir la cuvette aux 3/4 de la solution de colorant indigo de 3 μM fournie et scannez-la comme votre échantillon. Notez les informations d’absorbance et enregistrez vos données.
   • Enfin, videz votre cuvette dans les déchets organiques et rincez-la à l’acétone.
2. β button< class="expand">Expand

   Dans la deuxième moitié du laboratoire, vous utiliserez la spectroscopie UV-Vis pour établir un lien entre l'intensité et la concentration de l'absorbance et de l'β-carotène en mesurant les absorbances de 5 solutions de β-carotène de différentes concentrations. Cela vous permettra de créer une courbe d’étalonnage de l’absorbance en fonction de la concentration de β-carotène et de dériver l’équation décrivant cette relation.

   • Pour commencer, créez un tableau dans votre cahier de laboratoire avec des colonnes pour la concentration de β-carotène et l’absorbance à 450 nm.

     Tableau 2 : Absorbance du β-carotène

     test	Concentration (μM)	Absorbance à λmax (450 nm)
     1	1.9
     2	3.7
     3	7.5
     4	11
     5	15

     Cliquez ici pour télécharger le Tableau 2
   • Ensuite, procurez-vous une cuvette propre et remplissez-la aux 3/4 d’hexane comme ébauche de solvant.
   • Retirez toutes les bulles d’air, nettoyez les côtés transparents de la cuvette et placez-la dans le spectromètre. Configurez un balayage d’absorbance de 200 à 800 nm et scannez la cuvette comme ébauche de solvant.
   • Une fois le balayage terminé, videz la cuvette dans les déchets organiques et séchez-la à l’air comprimé.
   • Ensuite, utilisez une pipette propre pour remplir la cuvette aux 3/4 de la solution de β-carotène de 1,9 μM, qui est la solution la moins concentrée.
   • Nettoyez les côtés de la cuvette, insérez-la dans le spectromètre et scannez-la comme un échantillon.
   • Lorsque le balayage est terminé, affiche l’intensité d’absorbance du pic à 450 nm. Enregistrez-le dans votre cahier de laboratoire comme absorbance pour la solution de 1,9 μM.
   • Maintenant, videz la cuvette dans les déchets organiques, rincez-la à l’hexane et séchez-la à l’air comprimé.
   • Utilisez une pipette propre pour remplir la cuvette aux 3/4 de la solution de β-carotène de 3,7 μM. Nettoyez les côtés de la cuvette, insérez-la dans le spectromètre et scannez-la comme un autre échantillon.
   • Lorsque le balayage est terminé, notez l’absorbance du pic à 450 nm. Répétez cette opération pour les solutions restantes, en travaillant de la concentration la plus faible à la plus élevée. Sauvegardez vos données lorsque vous avez terminé.
   • Enfin, videz la cuvette dans les déchets organiques et nettoyez-la avec de l’acétone.
3. ResultsExpand

   Tout d’abord, regardez les spectres des trois colorants. La fluorescéine dans l’eau absorbe la lumière bleue et violette, avec une absorbance maximale à 490 nm. Il n’absorbe pas la lumière rouge et n’absorbe qu’une partie de la lumière jaune et verte. En conséquence, la fluorescéine solide est rouge et les solutions de fluorescéine sont généralement jaunes à vertes.

   β-carotène absorbe également la lumière bleue et violette. L'absorbance maximale du β-carotène dans l'hexane est de 450 nm, et vous verrez un autre pic important à 478 nm. La forte absorption de la lumière violette explique en partie pourquoi le β-carotène apparaît orange.

   L’indigo dans le DMF absorbe la lumière UV et la lumière rouge, orange et jaune, avec un pic distinct à 611 nm. Ainsi, le colorant indigo réfléchit principalement la lumière bleue et violette, ce qui lui donne sa couleur caractéristique.

   • Maintenant, faites la courbe d’étalonnage pour la concentration de β-carotène. Tracez les valeurs d’absorbance du β-carotène à 450 nm de la seconde moitié du laboratoire en fonction des concentrations des solutions.
   • Ensuite, appliquez une ligne de tendance et trouvez l’équation linéaire qui correspond aux données. Selon la loi de Beer-Lambert, dans cette équation, y est l’absorbance, x est la concentration et la pente est le produit du coefficient d’atténuation molaire pertinent et de la longueur du trajet.
   • Vérifiez votre équation. Réorganisez-le pour résoudre la concentration et remplissez l’absorbance du β-carotène à 450 nm à partir de la première partie du laboratoire. La concentration calculée doit être proche de 3 μM/L.