32.8: Principes de la chromatographie sur colonne

La technique de chromatographie a été inventée pour la première fois en 1901 par Michael S. Tswett, un botaniste russe, pour séparer les pigments végétaux à l’aide de solvants organiques. De plus, en 1941, Archer John Porter Martin et R. L. M. Synge ont modifié la technique en tapotant du gel de silice dans une colonne. Un mélange d’acides aminés a ensuite été séparé sur la colonne garnie en utilisant un mélange de chloroforme et d’eau comme phase mobile. Il s’agissait du premier rapport sur la chromatographie sur colonne. À l’heure actuelle, la chromatographie sur colonne est une technique largement utilisée pour séparer divers types de composés d’un mélange d’échantillons.

Facteurs influençant l’efficacité de la séparation des protéines

Divers paramètres tels que le matériau de la colonne, l’emballage et les conditions de fonctionnement telles que les débits et la température déterminent l’efficacité de la séparation par chromatographie sur colonne.

Le choix du matériau de la colonne ou de la matrice détermine l’étendue de l’interaction avec l’échantillon. Le matériau de la matrice doit être serré et uniformément dans la colonne. Les bulles d’air, les débris, les grosses particules et les précipités interfèrent avec l’écoulement uniforme du solvant à travers la colonne, affectant son efficacité de séparation. La colonne doit également être exempte de particules.

L’échantillon injecté dans la colonne doit être clair et exempt d’agrégats qui pourraient obstruer la colonne, entravant l’écoulement du solvant. Le débit de solvant affecte également la séparation. Des débits de solvants très élevés ou très faibles entraînent une séparation inefficace des composés et des préparations impures. Des taux très élevés peuvent également perturber l’empilement de la colonne, affectant l’efficacité du processus. De plus, la composition du tampon d’élution est également un facteur important. Il doit être non corrosif et compatible avec l’échantillon ainsi qu’avec le matériau de la colonne afin d’éviter la précipitation ou la dissolution in situ.

Un autre paramètre de fonctionnement, la température, joue également un rôle important dans le processus. Il décide de la stabilité de l’échantillon, du matériau de la colonne et du tampon de solvant. De plus, une température constante dans toute la colonne résout efficacement les composés. Une fois le processus de séparation terminé, les colonnes doivent être soigneusement lavées en passant à plusieurs reprises un solvant approprié afin d’éviter la contamination de l’échantillon lors des cycles suivants. De temps en temps, le solvant est passé dans une colonne dans le sens inverse pour éliminer tout matériau obstrué.

Limitations

Bien qu’il s’agisse d’une technique très largement utilisée, la méthode présente encore certaines limites. C’est une méthode qui prend beaucoup de temps car les débits doivent être plus lents pour une meilleure résolution des composés. De plus, de grandes quantités de solvants très purs nécessaires dans la phase mobile rendent le processus coûteux. Cela augmente également le coût de mise à l’échelle lorsque des rendements plus élevés de composés purs sont nécessaires.

La chromatographie sur colonne est une technique biochimique utilisée pour séparer les composés en fonction de leurs propriétés physiques et chimiques.

Il comporte deux composants principaux : la phase stationnaire solide ou matrice et la phase mobile liquide ou solvant.

La colonne matricielle est chargée d’un échantillon, tel qu’un mélange de protéines. Le solvant est ensuite utilisé pour transporter l’échantillon à travers la colonne.

À l’intérieur de la colonne, la matrice agit comme un maillage moléculaire filtrant les protéines en fonction de leur taille ou de leur interaction avec la matrice. Les protéines plus grosses ont tendance à se déplacer plus rapidement que les protéines plus petites, ce qui entraîne une séparation basée sur la taille.

De plus, les protéines d’un échantillon peuvent interagir avec la matrice. Les interactions faibles permettent aux protéines de passer rapidement, tandis que les interactions fortes retiennent les protéines dans la colonne.

Un changement progressif du pH ou de la force ionique du solvant modifie les interactions des protéines avec la matrice et aide à éluer les protéines en fractions distinctes.