32.11: Marquage et protéines de fusion

Les protéines sont impliquées dans plusieurs processus cellulaires et réactions biochimiques. L’analyse d’une protéine d’intérêt spécifique nécessite qu’elle soit isolée des autres protéines de la cellule. Ceci est réalisé en surexprimant le gène spécifique chez un hôte approprié pour produire de grandes quantités de la protéine cible. Une étiquette ou une étiquette est recombinée avec le gène pour produire une protéine de fusion contenant la protéine cible et l’étiquette. Les marqueurs de ces protéines de fusion peuvent ensuite être utilisés pour faciliter les processus de détection et de purification. Les marqueurs d’affinité, les marqueurs d’épitopes, les marqueurs rapporteurs, les marqueurs fluorescents et les marqueurs d’intein auto-épissés ne sont que quelques-uns des différents marqueurs de protéines disponibles.

Étiquette Glutathion S-transférase

La glutathion S-transférase (GST) est une protéine de 211 acides aminés couramment utilisée pour marquer les protéines recombinantes. Un vecteur d’expression comprenant le gène d’intérêt et la séquence d’ADN de GST est utilisé pour l’expression chez un hôte approprié, tel que E. coli. La protéine recombinante peut être marquée avec GST à son N-terminal ou à son C-terminal. L’étiquette GST augmente également la solubilité de la protéine de fusion par rapport à la protéine native non marquée. Étant donné que la GST est une enzyme, elle a une spécificité de liaison élevée à son substrat, le glutathion. Cette spécificité du substrat est utilisée pour purifier les protéines marquées GST par chromatographie d’affinité à l’aide d’une matrice de billes enrobées de glutathion.

Clivage de l’étiquette et auto-épissage

Bien que les marqueurs protéiques permettent de purifier la protéine cible, ils peuvent entraver l’analyse ultérieure des protéines. Dans de tels cas, les étiquettes sont clivées à l’aide d’enzymes protéolytiques. Étant donné que ces protéases ne se clivent qu’à des sites spécifiques, les protéines de fusion sont conçues avec de tels sites de clivage entre la protéine cible et l’étiquette. Une autre méthode utilise des segments de protéines auto-épissés, appelés inteines, qui épissent les marqueurs de la protéine cible sans enzymes supplémentaires. Dans cette méthode, un segment d’inteine est également recombiné dans la protéine de fusion, positionnée entre l’étiquette et la protéine cible. Ces éléments ne s’auto-épissent que dans certaines conditions telles que la présence de composés thiols ou un pH et une température spécifiques. Ainsi, l’épissage peut être spécifiquement induit après la purification de la protéine de fusion pour obtenir la protéine cible pure pour une analyse plus approfondie.