L'étude du comportement locomoteur complexes Drosophila melanogaster Dépend de la capacité à quantifier les changements dans les mouvements d'une mouche donné. Cet article montre comment faire cela en utilisant un système de suivi à haute résolution.
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Article de méthode
Suivi vidéo haute résolution de la locomotion chez les adultes Drosophila melanogaster
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les mouches de fournir un modèle important pour étudier le comportement complexe en raison de la pléthore d'outils génétiques disponibles pour les chercheurs dans ce domaine. Etudier le comportement locomoteur de
Protocole
Partie 1: L'alimentation et la gestion des mouches
- Les mouches doivent être cultivées dans des bouteilles contenant de la levure sans support standard. Vous aurez besoin d'un grand nombre de mouches, de sorte traverse besoin d'être mis en place en conséquence. Les mouches doivent être cultivées dans un 12-heures de lumière: obscurité du cycle à 25 º C.
- Les mouches doivent être recueillis peu après l'éclosion (1-3 jours). Les mouches peuvent être travaillé avec à ce stade en utilisant un diffuseur de dioxyde de carbone, et doivent être triés dans des éprouvettes contenant des milieux autoclavés ou sans levure. Nous utilisons les mâles seulement, stocké 10 à un tube à essai.
- Prévoyez au moins un ou deux jours après l'utilisation du dioxyde de carbone avant d'exécuter les expériences comportementales. Nous courons mouches dans notre test de comportement 3-5 jours suivants Eclosion.
- Les analyses devraient toujours être fait dans le même fenêtre de temps de deux à trois heures chaque jour pour éviter les problèmes de rythme circadien.
Partie 2: Mise en place du système de suivi dans un environnement contrôlé
- Toutes les expériences sont faites dans une salle de l'environnement qui maintient une température constante de 25 º C avec une humidité de 70%.
- Suspendre une caméra vidéo numérique sur la zone à être enregistrées (caméra vers le bas). Depuis notre logiciel de suivi de contraste à base, nous suspendons la caméra sur une boîte à lumière. La caméra enregistre des vidéos directement sur un ordinateur Dell via une connexion FireWire. Nous utilisons une caméra vidéo numérique SHARP, relié à un ordinateur Dell avec Windows MovieMaker (version Vista) pour l'acquisition vidéo.
- Impulsions d'air sera administré dans ce protocole, alors une source de flux d'air doivent être présents dans la salle. Utilisant des tubes en caoutchouc, connecter la source d'air à un filtre à charbon pour la filtration de l'air.
- Utilisant des tubes plus de caoutchouc, connectez l'autre côté de la filtre à charbon dans un erlenmeyer au moyen d'un bouchon de caoutchouc creux, et remplissez le flacon avec environ un demi-pouce d'eau. Ce sera humidifier l'air.
- Le flacon devrait également avoir une arme de poing, qui sera connecté à une valve en forme de Y via un tube en caoutchouc.
- Une branche de la Y-valve doit être connecté à un débitmètre. L'autre branche devrait fournir de l'air dans la chambre de la locomotion carrés.
Partie 3: Offrir des mouches dans la chambre de la locomotion
- La chambre de la locomotion carré est basé sur la conception de Wolf et al. 2002 1, avec l'ajout de bacs petite goutte pour empêcher les mouches de voler dans la chambre. La chambre doit être pris à part, et tous les composants doivent être soigneusement essuyées avec 70% d'éthanol et séché avant utilisation.
- Anesthésie immédiatement avant la réalisation d'une analyse comportementale peut potentiellement compromettre la performance. Pour éviter cela, les mouches sont frappa doucement dans la chambre en utilisant un entonnoir avec un petit point de vente. Pour faire une sortie de la bonne taille, attachez une pointe bleue pipette (pour P1000) à la fin d'un entonnoir. Utilisez des ciseaux pour couper la fin de la pointe de la pipette pour faire l'ouverture assez grande pour un avion pour passer à travers.
- Le haut de notre chambre est un petit morceau de plexiglas fixé par des vis sur les bords. Lorsque les vis sont retirées, les trous peuvent être utilisés pour fournir des mouches dans la chambre. Placez le dessus en plexiglass afin que le trou de la vis se trouve directement sur la chambre intérieure au lieu de l'endroit où se trouve une vis normalement. Prenez un tube à essai contenant les mouches et le placer à l'envers sur l'entonnoir, ce qui devrait ensuite être placé dans le trou de la vis.
- Ne déplacez pas l'entonnoir, ce qui pourrait blesser ou endommager les mouches. Au lieu de cela, doucement Bang toute la chambre, l'entonnoir et tous, jusqu'à ce que toutes les mouches sont à l'intérieur de la chambre. Cette frappe doit être fait sur un tapis de souris pour absorber le choc de ce baiser. Quand les mouches sont à l'intérieur, retirez l'entonnoir, et re-positionner le haut en plexiglas sur les lits à vis. Puis re-vis de la partie supérieure en plexiglas en place.
Partie 4: Exécution du test locomoteur
- Une fois que les mouches sont bien chargées, les laisser s'acclimater dans la chambre pendant 30 minutes. Cette période d'acclimatation devrait avoir lieu dans l'environnement contrôlé (25 ° C, humidité 70%), et la chambre doit être placé sur le dessus de la boîte à lumière (qui devrait être allumé). Éteindre les lumières autre pièce off.
- Après la période d'acclimatation, changer le Y-valve dans le système de circulation d'air de telle sorte que l'air ne écoulement vers le débitmètre. Allumez l'air, et la rampe de l'air jusqu'à la vitesse souhaitée (de 4,0 à 6,0 L / min). Nous utilisons généralement de 5,0 à 5,5 L / min, mais toute vitesse dans cette plage de travail.
- Une fois la vitesse désirée est atteinte, passer le Y-vanne de sorte que l'air circule dans la chambre de locomotion. Temps de cette impulsion de l'air pendant 15 secondes, et puis brusquement son tour l'air éteint. Lorsque vous tournez l'air éteint, allumez l'appareil photo au mode d'enregistrement. (Cette partie prend la pratique de faire tout à la fois).
- Arrêtez l'enregistrement après l'heure désirée et SAVE. Nous enregistrons 30 essais seconde à 10 images par seconde (au moins 8 essais par génotype).
Partie 5: Analyse des vidéos
- Nous utilisons lesDynamic System Image Analysis (DIAS) 3.2 pour le logiciel de suivi de mouvement 2. Pour utiliser ce logiciel, nous avons d'abord convertir nos vidéos en un format de fichier AVI avec Quicktime 7.5.5.
- Pour suivre les mouches basée sur le contraste, nous utilisons le «Seuil Autotrace par" la fonction. Nous utilisons ensuite le "Chemin du Faire trace" afin de numériser ces traces.
- Pour la sortie de la vitesse instantanée de chaque volée, nous utilisons le "calculer les paramètres" pour fonction de produire un fichier de base (DIAS-spécifique). En utilisant cette fonction, nous avons également lisser les données en utilisant un "5,15,60,15,5" Lissage de Tukey fenêtre.
- Une fois que cette information est délivrée comme un fichier de base, il peut être ouvert dans Microsoft Excel. Nous utilisons un script Matlab pour compiler les vitesses instantanées dans Excel et calculer les paramètres supplémentaires nécessaires à la compréhension dynamique des mouvements et la structure combat.
Les résultats représentatifs:
La figure 1 montre des traces d'organismes représentatifs du type sauvage Canton S (figure 1, le panneau de gauche) et les mouches nulles pour le gène dCASK qui ont été générés par le croisement de deux grandes suppressions qui se chevauchent (Df (3R) X307 et Df (3R) X313) (figure 1 , panneau de droite). mouches nulle dCASK ont déjà été montré pour avoir l'aide de problèmes locomoteurs paradigme de Buridan 3, et dans notre paradigme, par rapport à Canton S, ils montrent fortement diminué locomotion. Nous effectuons toujours des organismes de type sauvage d'abord pour s'assurer que les conditions et le comportement sont dans la fourchette normale pour un jour donné. Nous avons observé des écarts de réponses standard en moins de 5% des journées d'essais. Ces différences peuvent généralement être attribués à des problèmes avec les paramètres de notre environnement contrôlé.
Figure 1. DIAS généré des traces de deux mouches Canton S de type sauvage (ci-dessus, à gauche) et Null dCASK locomoteur déficient mouches générés par des suppressions qui se chevauchent (ci-dessus, à droite). Les traces représentent ce qui est vu dans les vidéos enregistrées. Les deux traces photos contrain 8-10 mouches fonctionner pendant 30 secondes dans l'épreuve de poursuite vidéo suite à une impulsion de l'air.
Figure 2. Mouches de type sauvage ont été exécutés dans le test locomoteur (ci-dessus) après une impulsion de l'air (barres pourpres) et sans une impulsion d'air (en bleu). Dans tous les paramètres calculés par le programme d'analyse, il n'y avait aucune différence significative entre les deux conditions (déterminé par deux queues test t de Student). Cela démontre que, suite à une impulsion de l'air, les mouches locomote normalement dans notre configuration.
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Discussion
Dans notre configuration, une impulsion d'air assez fort mouvement s'arrête transitoirement voler. Lorsque l'impulsion de l'air se termine, les mouches sont libérés de cet état stationnaire et locomote normalement, comme le montre la figure 2. Parce que cette impulsion d'air synchronise de manière efficace la locomotion de la population, nous l'utilisons pour commencer le procès, de sorte que nous pouvons également étudier le début du mouvement suite à un stimulus élan révolutionnaire. Le dosage ...
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Remerciements
Ce travail a été soutenu par les Instituts nationaux de la santé de subvention R01 GM54408 attribué à LC Griffith. Nous tenons à remercier Fred Wolf pour son aide dans la conception de notre chambre carrée et la mise en place de notre test, Frank Mello à la boutique de Brandeis University machines pour la construction de notre chambre, et Dan Valente et Tim Lebestky pour des conversations utiles concernant les questions d'analyse.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires | |
|---|---|---|---|---|
| Chambre carrée | Outil | Atelier mécanique | N/A | Conception d'après Wolf et al. 20021 |
| Appareil photo numérique | Appareil photo | Sharp | ViewcamZ VL-23 | |
| Débitmètre | Outil | Cole-Parmer | SY-32003-12 | |
| Boîte lumineuse | Outil | DNASTAR | Seq-Easy | |
| Filtre au charbon actif | Outil | Fisher Scientific | 09-744-37 | |
| DIAS 3.2 | Logiciel | Soll technologies | N/A | www.solltechnologies.com |
Références
- Wolf, F. W., Rodan, A. R., Tsai, L. T. High-Resolution Analysis of Ethanol-Induced Locomotor Stimulation in Drosophila. J Neurosci. 22 (24), 11035-11044 (2002).
- Soll, D. R. The use of computers in understanding how animal cells crawl. International review of cytology. 163, 43-104 (1995).
- Martin, J. R., Ollo, R. A new Drosophila Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase (Caki) is localized in the central nervous system and implicated in walking speed. The EMBO journal. 15 (8), 1865-1876 (1996).
- Levine, J. D., Funes, P., Dowse, H. B. Resetting the Circadian Clock by Social Experience in Drosophila melanogaster. Science. 298, 2010-2012 (2002).
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Réimpressions et autorisations
