Article de méthode

Gibberella zeae ascospores production et la collecte d'expériences sur biopuces.

DOI :

10.3791/115

⸱

30 novembre 2006

 , 
1Cereal Disease Laboratory, USDA, 2University of Minnesota/ Agroinnova, University of Torino, 3Cereal Disease Laboratory, University of Minnesota

Dans cet article

Résumé

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Pour étudier les processus de développement des ascospores dans Gibberella zeae, une procédure de collecte dans des conditions stériles est filmé afin de générer le plus haut niveau de l'information pour la description du protocole. Ceci devrait faciliter la reproductibilité de l'expérience, un aspect crucial lorsqu'il est plein des tests d'expression du génome profil sont mis en œuvre.

Résumé

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Fusarium graminearum Schwabe (téléomorphe Gibberella zeae) est un agent pathogène des plantes causant la gale sur le blé et l'orge qui réduit le rendement des récoltes et la qualité du grain. F. graminearum provoque aussi pourrit tige et épi de maïs et est un producteur de mycotoxines telles que les trichothécènes qui contaminent grain et sont nocifs pour les humains et le bétail (Goswami et Kistler, 2004). Le champignon produit deux types de spores. Les ascospores, les propagules résultant de la reproduction sexuée, sont la principale source de l'infection primaire. Ces spores sont forcément déchargé de périthèces matures et dispersées par le vent (Francl et al 1999). Les infections secondaires sont principalement causées par macroconidies qui sont produites de manière asexuée sur la surface de la plante. Pour étudier les processus de développement des ascospores dans ce champignon, une procédure pour leur collection en grande quantité dans des conditions stériles a été nécessaire. Notre protocole a été filmé afin de générer le plus haut niveau de l'information pour comprendre et reproductibilité; aspects cruciaux quand il est plein de profils d'expression génétique du génome sont générés et interprétés. En particulier, la variabilité de la germination des ascospores et l'activité biologique sont dépendants de la manipulation préalable de la matière. L'utilisation de la vidéo pour documenter chaque étape de production d'ascospores est proposé afin d'accroître la normalisation, se conformer aux exigences plus strictes pour l'analyse des microréseaux. La procédure ne requiert que du matériel de laboratoire standard. Des mesures sont indiquées pour prévenir la contamination et la synchronisation de l'heure faveur des ascospores.

Protocole

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  1. Agar Carotte (Klittich et Leslie, 1988) a été préparé en 9 cm de diamètre des boîtes de Petri.
  2. Un cube de 2 mm d'agar contenant du mycélium frais cultivés sur Potato dextrose agar a été appliquée au centre de chaque boîte de Pétri.
  3. Les cultures ont été cultivées à 25 ° C et une photopériode de 12 h à 96 heures.
  4. Un ml de solution aqueuse à 2,5% de Tween 60 a été appliqué à la surface de la culture (Trail et communes, 2000) et la propagation à travers la culture avec une tige en plastique, en appuyant délicatement.
  5. Tir périthèces ascospores développés 7-10 jours après ce traitement d'induction lorsqu'il est maintenu dans un environnement très humide à 25 ° C avec la photopériode mêmes.
  6. Collecte de Spore est effectué en changeant le couvercle de la plaque de Petri, laissant périthèces à tirer pour un temps limité (par exemple 12 heures) dans l'obscurité.
  7. L'eau stérile est ajouté au couvercle, la suspension par les ascospores doucement l'eau en mouvement sur la surface.
  8. Les ascospores sont recueillis dans des tubes Falcon stériles, lavées et utilisées pour une analyse ultérieure.

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Discussion

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Le protocole présenté ici est basé sur les procédures utilisées précédemment pour la production de périthèces pour Fusarium spp. (Klittich et Leslie, 1988; Trail et communes, 2000). Normalisation de la procédure par laquelle une grande quantité d'ascospores (suffisant pour l'analyse des microréseaux) ont été générés était essentielle pour la reproductibilité de l'expérience. Il a été rapporté que les différences des facteurs environnementaux, l'âge et le substrat peut changer le caractère biologique des ascospores (Beyer et ...

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Remerciements

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Les auteurs remercient Karen Hilburn pour le soutien technique excellente. Ce projet a été soutenu par l'Initiative Nationale de la Recherche de l'USDA Cooperative State Research, Education and Extension Service (Prix # 2004-35604-14327). Matias Pasquali est soutenu par Branco Weiss Bourse. Le blé américain et l'Initiative tavelure L'orge est également reconnu pour le soutien continu de recherche.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Boîte de Pétri 9 cm de diamètreTool
Tween 60 (20 %)Réactif
Gélose à la carotte (20 % p/v carottes bio et 1,5 % p/v agar) Réactif

Références

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  1. Beyer, M., Verreet, J. A. Germination of Gibberella zeae ascospores as affected by age of spores after discharge and environmental factors. , (2005).
  2. Francl, L., Shaner, G., Bergstrom, G., Gilbert, J., Pedersen, W., Dill-Macky, R., Sweets, L., Corwin, B., Jin, Y., Gallenberg, D., Wiersma, J. Daily inoculum levels of Gibberella zeae on wheat spikes. Plant Disease 83,662-666. , (1999).
  3. Goswami, R. S., Kistler, H. C. Heading for disaster, Fusarium graminearum on cereal crops. Molecular Plant Pathology 5,515–525. , (2004).
  4. Klittich, C. J. R., Leslie, J. F. Nitrate reduction mutants in Fusarium moniliforme (Gibberella fujikuroi. Genetics. 118, 417-2013 (1998).
  5. Trail, F., Common, R. Perithecium development in Gibberella zeae, a light microscopy study. , (2000).
  6. Tschantz, A. T., Horst, R. L., Nelson, P. E. A substrate for uniform production of perithecia in Gibberella zeae. Mycologia. , 67-1101 (1975).
  7. Tschanz, A. T., Horst, R. K., Nelson, P. E. The effect of environment on sexual reproduction of Gibberella zeae. , (1976).

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Mots-clés

Spores fongiquesCollecte de sporesConditions st rilesD charge des p rithecesPathog ne du blInfection de l orgeContamination du ma s

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