Préparation Cell Block de cytologie avec une prédominance de cellules individuellement épars

Introduction:

Ceci est une vidéo décrivant la méthode pour la préparation Shidham bloc cellulaire du liquide à base de cytologie (LBC) spécimen à l'aide HistoGelTM (Thermo Scientific) (HG). Par rapport à d'autres approches aléatoires, les suivantes sont les deux caractéristiques essentielles de ce protocole pour la préparation de blocs de cellules à partir de spécimens relativement aux seules hypocellulaires dispersés cellules perdent (1-5).

1. Ce protocole comporte des mesures pour concentrer les cellules le long du plan parallèle à la surface de coupe du bloc cellulaire.
2. Il inclut également une intégration comme une balise sombre de AV-marqueur (figure 1b), qui sert à deux fins suivantes:
   1. Pour visualiser le niveau auquel les cellules sont concentrées. La zone du bloc de cellules avec les cellules d'intérêt aujourd'hui pourrait être visualisé par l'histotechnologist lorsque la balise de couleur foncée est exposé pendant la coupe. Cette capacité à surveiller les empêche de couper à travers le niveau avec la plupart des cellules, ou ne pas couper trop superficielle dans le niveau avec la plus forte concentration de cellules de l'échantillon.
   2. Pour servir comme point de référence de localisation dans la section du bloc cellulaire de série sur les différentes diapositives. Ce point de référence agit comme un phare pour aider à localiser les cellules ou groupes de cellules pour l'évaluation d'un modèle immunoréactivité coordonner avec l'approche SCIP (6,7).

PROTOCOLE (figure 2)

Préparation de l'échantillon.

1. Transférer le spécimen résiduelle LBC cytologie cervicale à un tube de verre à fond plat (15mm de diamètre x 45mm) (figure 2.1 à 2.4). Placez le tube de verre dans un tube en plastique plus grand transporteur (28 x 85mm) et centrifugeuse. Retirer le tube à fond de verre du tube transporteur et éliminer le surnageant.
2. Le tube de verre est alors plafonné (pour éviter les déversements d'eau de chauffage dans l'étape suivante) et replacé dans un grand tube à fond plat en plastique porteuse
3. Le tube en plastique support contenant le tube de verre est alors plafonné, placé dans une centrifugeuse (avec des tasses et non orientable coupes à angle fixe de sorte que les cellules tomber perpendiculairement au fond plat du tube de verre), et tournant à 1805 G (3000 RPM, Rayon-17cm de rotor) pendant cinq minutes (figure 2.5).
4. Les tubes sont ensuite retirés à la verticale de la centrifugeuse et le tube de verre plus petit est retiré avec une pince à partir du tube en plastique plus grand transporteur, sans perturber le culot de cellules sédimentées.
5. Le tube en verre avec spécimen est non plafonnés et le surnageant est vidé en prenant soin de ne pas perturber la couche plane de cellules sédimentent au fond (figure 2.6).

L'inclusion de la coordonnée de référence AV-marqueur et plus de gel

1. Une balise noire AV-marqueur (environ 2 mm x 2 mm taille, plane surface, fragment de couleur foncée, le matériel sectionnable) (figure 3) est ajouté comme un poteau indicateur sur le tube de verre (Figure 2.7).
2. Liquéfier une aliquote de HG en le fondant au micro-ondes pendant 10 secondes à puissance moyenne.
3. Ajouter 0,5 ml de HG fondu pour le tube, mélanger avec le sédiment rapidement, et il récapitulation (figure 2.8) (Passez à l'étape suivante rapidement sans laisser le HG pour commencer à se solidifier).
4. Ajoutez environ 2,5 ml d'eau tiède (45 ° C) de l'eau dans le tube en plastique de support (Figure 2.9).
5. Le tube de verre plus petit plafonné est placé à l'intérieur du tube en plastique avec de l'eau tiède. (Cette étape est nécessaire pour garder le HG de se solidifier au cours des prochaines étapes) (Figure 2.9).
6. Le tube en plastique transporteur est placé dans la centrifugeuse (avec des tasses et non orientable coupes à angle fixe de sorte que les cellules tomber perpendiculairement au fond plat du tube de verre), et tournant à 1805 G (3000 RPM, le rayon-17cm de rotor) pour cinq minutes. Le but de cette étape de centrifugation est de pousser le marqueur AV et pour concentrer les cellules dans une couche proche de la surface de coupe du bloc cellulaire de paraffine finale embarqués (figure 1d).
7. Les tubes sont ensuite retirés doucement et verticalement à partir de la centrifugeuse en prenant soin de ne pas perturber la couche sédimentée mince avec des cellules de l'échantillon dans le fond.
8. Le tube en plastique est plus non plafonnés et le tube de verre plus petit est retiré verticalement par une pince sans déranger la couche de sédiments de cellules spécimen.
9. Le petit tube de verre est réfrigéré en position verticale pendant 15 minutes pour refroidir et se solidifier l'HG (figure 2.11).

Retrait du bloc cellulaire comme un bouton de gel avec un spécimen pour le traitement final

1. Le disque HG solidifié, avec la couche de concentré / sédiments spécimens au fond est délogé du tube de verre à fond plat en injectant formol à 10% grâce à une aiguille de calibre 23 avec la seringue (figure 2.12).
2. L'aiguille est insérée sur le côté du tube à la périphérie du disque de HG solidifié avec éprouvette (figure 2.12).
3. Le needle est tournée sur le côté du tube tout en formol est lentement poussé par la seringue. Il en résulte la séparation de la touche HG avec balise de couleur foncée AV-marqueur et le spécimen concentré dans ce fond plat de la du tube de verre (figure 2.12).
4. Le bloc de cellules (bouton de gel avec des cellules spécimen) est ensuite placé dans une cassette étiquetés et soumis pour le traitement des tissus à préparer des blocs de paraffine cellulaire embarqué (figure 2.13).

Intégration et la coupe de l'échantillon

1. Le disque est inclus dans la paraffine avec le côté sombre de marqueur balise bas que la surface de coupe (figure 1).
2. Le bloc est sectionné jusqu'à ce que la couleur foncée AV-marqueur comme un phare est exposée et visible.
3. Trois à quatre sections microns sont coupés de ce niveau qui devrait contenir la plupart des cellules dispersées individuellement à partir du spécimen.
4. Les coupes sont recueillies sur la lame de verre pour la coloration de loin, la coloration immunohistochimique, ou d'autres tests comme indiqué. Les protocoles de ces essais, y compris le type de diapositives à utiliser pour le montage des sections peuvent varier. Généralement pour immunocoloration, des lames recouvertes sont utilisés pour l'empêcher de flotter et de perte de sections de la glisse lors des étapes immunomarquage.

Abréviations utilisées (par ordre alphabétique): CISH, chromogène tests d'hybridation in situ; FISH, fluorescent tests d'hybridation in situ; FFPE, fixés au formol et inclus en paraffine; FNA, aspiration à l'aiguille fine; HG, HistoGel ™ (Thermo Scientific); LBC, liquide cytologie; réaction PCR polymerase chain;

Figure 1. La structure du bloc cellulaire préparé par le protocole de Shidham.

Figure 2. Le résumé des différentes étapes de préparation du bloc cellulaire spécimen LBC par le protocole de Shidham.

Figure 3. Préparation d'AV-marqueur de pelures de banane.

Figure 4. Comparaison des blocs de cellules et sections, avec et sans AV-marqueur.

Figure 5. Comparaison des cellularité des sections du bloc cellulaire avec et sans AV-marqueur.

Cell blocks are a valuable tool for evaluation of various cytology specimens (1). Most importantly, in addition to the architectural details of the specimen, cell blocks allow for evaluation of ancillary studies such as immunocytochemistry, fluorescent/chromogenic in-situ hybridization tests (FISH/CISH) and in-situ PCR. A variety of methods for preparation of cell block are described. However, most of these are suitable for non-gynecologic cytology specimens which contain relatively many cells and with tissue microfragments such as in FNA aspirates and some serous fluids such as effusions (1,3,4,5).

Because cell blocks primarily provide the opportunity for immunocytochemical evaluation, their processing should preferably be similar to that of the formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues. Ultimately the results obtained after immunocytochemical evaluation of cell block sections are compared to those with the published literature performed predominantly on FFPE tissue sections. Any alterations in the protocol potentially compromise and nullify the validity of the results obtained on cell blocks processed through different fixatives and reagent sequences other than that used for routine FFPE. Some commercial techniques may have the drawback of processing through a protocol of exposure to other fixative-reagent exposure.

Various methods of cell block preparation are available for specimens with a significant quantity of sediment and tissue fragments. Principally, the concentrated sediments are supported by some gel or coagulation principle. The maneuverable button is then embedded in paraffin after processing like the surgical pathology specimens/biopsies.

The gels used include gelatin, agar, fibrinogen/plasma-thrombin, and other commercial gels such as HG. The methods of concentration vary from simple pelleting of the sediment by centrifugation to concentration of cells along various types of membranes. Examples include: Milipore, collodin (Celloidin) bags or scraping the cells from the cytology smears on glass slides (1). We also evaluated a variety of gels by trying different combinations of agar and gelatin. None of the combinations achieved the a firm enough consistency to obtain an easily maneuverable disc of solidified gel with embedded cells from the specimen in one piece. HG showed appropriate consistency and in our experience the immunostaining results on HG cell block sections have been excellent.

Liquid based cytology (LBC) specimens for cervicovaginal cytology are generally less cellular than non-gynecologic specimens as mentioned above. In addition, the gynecologic LBC specimens predominantly contain individual scattered exfoliated superficial cells from cervicovaginal mucosa. Due to this, appropriate cellularity within the cell block sections may not be achieved without a special approach. As these singly scattered cellular components in the the block cannot be seen by the histotechnologist during section cutting, the level at which the cells start appearing in the sections cannot be appreciated and may be missed, either by cutting past the level with most cells or not cutting deep enough into the level with highest concentration of sample cells (Figure 4). Shidham’s protocol addresses both of these issues using HG as embedding medium and conventional lab equipments (2) (Figure 2).

This protocol involves following two major features (Figure 1):

1. Concentration and alignment of singly scattered cells in a narrow plane adjacent and parallel to the cutting surface of the cell block (Figure 5).
2. Inclusion of a beacon-like dark AV-marker as a signpost. This is critical for achieving following features:
   1. Identifying and monitoring the level at which the cells are concentrated in the cell block. The exposure of the dark colored signpost highlights the level at which most of the singly scattered cells in the cell block are expected to be located (Figure 4). This prevents the overcutting (cutting past the level with most cells) or undercutting (not cutting deep enough into the level with highest concentration of sample cells) in to the cell block and allow selection of the sections from the level in the cell block corresponding with highest concentration of cells.
   2. The dark colored signpost in the sections also serves as a reference point to survey and identify exactly the same cells in different serial sections of the cell block on different slides (Figure 4). This is critical while interpreting and evaluating the coordinate properties such immunoprofile of particular cells by the SCIP approach to follow the same cells in different sections (6,7).

Although our protocol is standardized and reported for liquid based cervical cytology specimens, it can also be used to enhance diagnostic yield of many other non-gynecologic specimens such as effusion fluids, FNA, brushings, cyst contents etc. In addition the AV marker would facilitate improved application of SCIP approach during immunohistochemical evaluation of cell block sections of these specimens. The embedding medium may be replaced by other reagents with appropriate modifications at relevant steps. HG may be replaced by plasma (Fibrinogen) to be gelled by Thrombin at room temperature (1).