Préparation des Aplysie Sensori-motrice cultures de cellules neuronales

Résumé

Des cultures primaires de Aplysie Sensori-motrices des neurones fournir une préparation modèle pour étudier la formation des synapses et la plasticité synaptique In vitro. Cette vidéo montre l'identification et la microdissection des neurones sensoriels et moteurs de Aplysie ainsi que les méthodes pour établir et maintenir sensori-motrices des neurones en culture.

Résumé

Le système nerveux de l'aplysie californica mollusque marin est relativement simple, composé d'environ 20 000 neurones. Les neurones sont de grande taille (jusqu'à 1 mm de diamètre) et identifiable, avec des tailles différentes, des formes, positions et les pigmentations et les corps cellulaires sont exposées à l'extérieur en cinq ganglions jumelé distribués dans tout le corps de l'animal. Ces propriétés ont permis aux enquêteurs de délimiter les circuits qui sous-tendent les comportements spécifiques chez l'animal ^1. La connexion monosynaptique entre les neurones sensoriels et moteurs est une composante centrale du réflexe de retrait des branchies chez l'animal, un simple réflexe de défense dans lequel l'animal se retire de ses branchies, en réponse à une stimulation tactile du siphon. Ce réflexe subit des formes d'apprentissage non-associatif et associatif, y compris la sensibilisation, l'accoutumance et le conditionnement classique. Un avantage particulier à l'étude de la plasticité synaptique, la synapse sensori-moteur peut être reconstituée dans la culture, où bien caractérisés stimuli suscitent des formes de plasticité qui ont des corrélats directe dans le comportement de l'animal ^2,3. Plus précisément, l'application de la sérotonine produit un renforcement synaptique qui, selon le protocole d'application, dure quelques minutes (à court terme de facilitation), heures (à moyen terme de facilitation) ou jours (facilitation à long terme). En revanche, l'application de la FMRFamide émetteur peptide produit un affaiblissement synaptique ou la dépression qui, selon le protocole d'application, peut durer de quelques minutes à plusieurs jours (dépression à long terme). La grande taille des neurones permet d'enregistrer l'électrode répétées forte de la force synaptique au cours des périodes de jours ensemble avec microinjection de vecteurs d'expression, et d'autres composés siRNA pour cibler des cascades de signalisation et les molécules et ainsi d'identifier les étapes moléculaires et cellulaires biologiques qui sous-tendent les changements de l'efficacité synaptique.

Un avantage supplémentaire du système de culture de l'aplysie vient du fait que les neurones de démontrer la spécificité des synapses dans la culture ^4,5. Ainsi, les neurones sensoriels ne forment des synapses avec eux-mêmes (autapses) ou avec d'autres neurones sensoriels, et ils ne forment des synapses avec des non-cibles identifiés dans les neurones moteurs de la culture. Les varicosités, les sites de contact synaptiques entre les neurones sensoriels et moteurs, sont assez grandes (2-7 microns de diamètre) pour permettre la formation des synapses (ainsi que des changements dans la morphologie synaptique) avec les neurones moteurs cible à être étudiés au niveau du microscope optique.

Dans cette vidéo, nous démontrons chaque étape de la préparation des cultures de neurones sensori-moteurs, y compris les adultes et les anesthésier aplysie juvénile, disséquant leurs ganglions, la digestion de la protéase du ganglion, l'enlèvement du tissu conjonctif par microdissection, l'identification des deux neurones sensoriels et moteurs et l'enlèvement de chaque type cellulaire par microdissection, le placage du neurone moteur, plus du neurone sensoriel et la manipulation des neurites sensoriels pour former le contact avec la culture des neurones moteurs.

Protocole

Préparation (voir la section des solutions à la fin du protocole pour la composition des solutions)

1. Préparer des boîtes de culture. Manteau en verre de plat ainsi Mattek la culture à fond de verre avec de la poly-L-lysine (made in borate de sodium). Ajouter suffisamment pour couvrir complètement le verre bien et laissez reposer> 1h (peut être laissé toute la nuit). Enlever soigneusement la poly-L-lysine par un rinçage à l'eau de mer artificielle (ASW) 4-5 fois. Après avoir retiré le dernier rinçage, ajouter 2 ml de 50% L15 (complété par les sels et contenant de la L-glutamine à une concentration finale de 2 mM) / hémolymphe de 50%. Ce milieu de culture doit être dans le plat pendant au moins une heure avant de cellules placage, de sorte que les manteaux hémolymphe le plat.
2. Nettoyer les outils et les plats Sylgard avec l'éthanol, les rincer abondamment à ddH ₂ 0 puis les placer pour> 1 h sous une lumière UV dans le capot de la culture.
3. Préparer électrodes forte pour la microdissection des neurones. L'utilisation d'un extracteur de microélectrodes (par exemple, Sutter Flaming Brown P-97), tirez électrodes pipette en verre avec 1,5 mm de diamètre extérieur, de 0,86 à 1,12 mm de diamètre intérieur et 100 mm de longueur (par exemple AM ​​# 628000 catalogue système; Instruments de précision mondiale TW150-4, 1,55 / 1,12). Utiliser les paramètres qui produisent une électrode avec une pointe longue et effilée amende de haute résistance telle qu'il n'y ait aucun apport capillaire de liquide lorsqu'il est placé dans une solution. La présence d'un ménisque du liquide signifie que la pointe de l'électrode d'endommager des neurones lors de l'isolement. Le livre de Sutter électrode fournit des lignes directrices pour la mise en place d'excellents programmes de l'électrode. Nous utilisons un filament boîte, et une seule étape tirez pour générer des électrodes de la culture.
4. Préparer la solution anesthésique (0,35 M MgCl2), milieu de culture (L15 complété par les sels et hémolymphe), et la solution de protéase (1% de la protéase de type IX, Sigma, 1 unité / mg, à une concentration finale de 10 unités / ml).
5. Animaux: l'usage des adultes 80-100 g aplysie pour l'isolation des neurones sensoriels et des neurones moteurs EPA. Utilisez juvénile 1-4 g aplysie pour l'isolement de L7 neurones moteurs. Retirez délicatement les animaux provenant des réservoirs d'eau de mer, et de maintenir dans l'eau de mer (dans le bécher, un seau ou un sac en plastique) pour pas plus de 30 minutes avant le début de l'anesthésie et la procédure de la culture.

Procédure de la Culture

A. La culture pleural neurones sensoriels de 80 à 100 g aplysie

1. Anesthésier les animaux pour l'enlèvement des ganglions: Injecter 0,35 M MgCl ₂ dans les adultes aplysie (80-100 g) en utilisant une seringue de 60 ml avec une aiguille de calibre 18 pouces 1.5. Entrez le pied de l'animal à un angle d'environ 35 degrés, et ne pas entrer trop profondément. L'objectif est d'injecter dans le hemocoel de l'animal sans pénétrer les organes internes. L'animal doit devenir très distendu et détendue.
2. Disséquer les ganglions: Pin l'animal anesthésié sur un plat de dissection, avec un axe (18 aiguilles de calibre fonctionnent bien pour les animaux g 80-100) à la tête et la queue, et le pied vers le haut. Maintenez le pied avec une pince à griffes et à traverser la peau et des tissus conjonctifs sous-jacents sur toute la longueur du pied (de la tête à la queue) avec une paire de ciseaux chirurgicaux. Epingler les deux côtés vers le bas. En utilisant une pince et de ciseaux, couper l'œsophage et tirer vers le côté afin d'exposer les ganglions. En utilisant une pince fine et des ciseaux fins, découpez les ganglions pédieux pleural (les neurones sensoriels sont dans les ganglions de la plèvre). Laisser une bonne quantité de nerfs car cela rend plus facile à cerner les ganglions après le traitement de la protéase.
3. Digestion protéasique des ganglions: Placez les ganglions de la protéase en solution (10 mg / ml de 1 unité / mg dans L15) dans un incubateur réglé à 34,5 ° C (34-35 ° C est correct) pour 2 heures et 15 minutes. Utilisation de la pointe fine pince à transférer et laver les ganglions de ASW à trois reprises. Gardez les ganglions de L15. Notez que le temps d'incubation peut varier de protéase. Le but est de permettre aux tissus conjonctifs pour être facilement enlevés. Si elle est trop difficile à desheath les ganglions, sans endommager les neurones, d'augmenter le temps d'incubation de la protéase. Si elle est extrêmement facile à desheath les ganglions, et les neurones sont «mous», réduire le temps d'incubation de la protéase.
4. Dégainage les ganglions: Transfert de la protéase digère ganglions à un 60 mm ou un plat de 35mm contenant Sylgard et L15. Voir sous un stéréomicroscope (avec éclairage halogène externe), retirer la pédale ganglions et épingler les ganglions de la plèvre dans le plat Sylgard dans le bon sens en utilisant broches insectes et d'une pince fine. Avec la pince fine et une paire de ciseaux chirurgicaux Vanna, soulevez délicatement le tissu conjonctif et le couper afin d'exposer la grappe sensorielle. Soyez prudent de ne jamais toucher ni endommager le soma des neurones. Retirez tout excès de tissu conjonctif de l'antenne et ajouter plus de support, en veillant à ne jamais exposer le ganglion desheathed à l'air. Le cluster sensorielle est composé d'environ 200 neurones regroupés de 40-50 microns de diamètre. Régler une épingle pour faire un "post" à une courte distance de la Ganglionique (dans le champ de vision).
5. Isolement des neurones: Utilisation de long, l'électrode forte culture en verre, tirez la identifié les neurones un par un, en touchant le corps de la cellule juste à côté du centre (ne pas empaler) et lentement et régulièrement en tirant le corps cellulaire, de concert avec l'axone, loin de la ganglionnaires. Tapoter doucement contre la goupille de déloger les neurones de l'électrode.
6. Neurones Placage: Utiliser un Pipetman (P10) pour transférer les neurones individuels de l'antenne Sylgard à une boîte de culture. Avant de transférer les neurones, un milieu de culture de pipette dans la pointe de telle sorte que le bout de plastique est recouvert d'hémolymphe (cela empêche les neurones de coller à la plastique). Prenez grand soin d'éviter d'exposer les neurones à des bulles d'air ou à des forces extrêmes (très doucement reprendre et de supprimer les neurones de la pipetteman). Distribuer les neurones uniformément dans le plat. Utiliser une électrode forte doucement droites les processus et les robinet vers le bas.
7. Incubation: Laissez les plats sur la platine du microscope à la température ambiante pendant au moins 3 heures. Nous faisons régulièrement les laisser toute la nuit. Assurez-vous que la platine du microscope est perturbé durant cette période. Couvrir le stade avec une feuille d'aluminium pour protéger de la lumière. Doucement les transférer à un incubateur à 18 ° C.
8. Les cultures devraient adhérer à l'antenne un délai d'environ 3 heures et la croissance des neurites nouvelle devrait être visible dans les heures 6-12 environ. La croissance des neurones sensoriels isolés atteint un plateau par DIV 3 ou 4. Notez que les neurones sensoriels isolés de biche pas autapses forme ou synapses chimiques avec l'autre, bien qu'ils ne forment des jonctions électriques fossé.

B. Préparation du neurone sensoriel cocultures-neurone moteur

Les neurones sensoriels forment synapse avec les neurones moteurs cible dans la culture. Les neurones moteurs les plus couramment utilisés sont les neurones moteurs EPA et le neurone moteur L7, à partir du ganglion abdominal. Les neurones moteurs EPA sont isolés de l'adulte (80-100 g) l'aplysie, et il ya environ 20 neurones moteurs EPA par ganglion abdominal. Le L7 du neurone moteur est isolé juvénile (1-4 g) les animaux, et il n'ya qu'un seul L7 par ganglions abdominaux. EPA neurones moteurs sont de 40-50 microns de diamètre, sont intercalés entre les neurones sensoriels LE près de la racine du nerf siphon sur la surface ventrale des ganglions de l'abdomen, et sont caractérisées par un spot pigment foncé subtile dans chaque soma. Le L7 du neurone moteur est de 100 à 150 microns de diamètre et est présente sur la surface dorsale du ganglion, sur le bord milieu du côté gauche du ganglion. Alors qu'il est plus économique d'utiliser l'EFT neurones moteurs, la grande taille du neurone moteur L7 est avantageux pour certaines expériences. Le L11 du motoneurone, également sur la surface dorsale gauche du ganglion abdominal, caudale à L7, est un neurone moteur et non ciblées peuvent être efficacement utilisé comme un contrôle avec lequel le neurone sensoriel fasciculates mais ne forme pas des synapses chimiques.

1. Anesthésier les animaux pour l'enlèvement des ganglions. Pour les neurones moteurs de l'EPA, faites comme décrit pour pleural neurones sensoriels. Pour L7 neurones moteurs, injecter 0,35 M MgCl ₂ dans juvénile aplysie (1-4 g) en utilisant une seringue de 10 ml avec une aiguille de calibre 21.
2. Disséquer les ganglions abdominaux: Pin l'animal anesthésié sur un plat de dissection comme décrit ci-dessus (en utilisant des aiguilles de calibre 21 pour les jeunes animaux). En utilisant une pince fine et des ciseaux fins, découpez les ganglions abdominaux.
3. Digestion protéasique des ganglions: Ceci est fait comme décrit pour pleural neurones sensoriels, sauf que le temps de digestion est réduite à 1 h 45 min pour des ganglions juvénile (1-4 g) les animaux.
4. Dégainage les ganglions: Transfert de la protéase digère ganglions à un plat de 35 ou 60 mm contenant Sylgard et L15. Voir sous un stéréomicroscope (avec éclairage halogène externe), dans les ganglions dans le plat Sylgard dans le bon sens en utilisant broches insectes et d'une pince fine. Avec la pince fine et une paire de ciseaux chirurgicaux Vanna, soulevez délicatement le tissu conjonctif et le couper afin d'exposer les corps cellulaires des neurones. Pour isoler les neurones moteurs EPA, broche le ganglion de sorte que la surface ventrale est tournée vers le haut, et avec une pince tirer sur la gaine de tissu conjonctif pour exposer toute la moitié du ganglion contenant de l'EPA neurones moteurs (à votre droite), l'desheath parties restantes du ganglion, enlever tout le tissu conjonctif du plat et ajouter plus de L15. Pour isoler le L7 ou L11 du neurone moteur, la broche le ganglion de sorte que la surface dorsale est orientée vers le haut, et avec une pince tirer sur la gaine de tissu conjonctif pour exposer la moitié du ganglion contenant à la fois L7 et L11 (à votre gauche). Soyez prudent de ne jamais toucher ni endommager le soma des neurones. Placez une épingle pour faire un "post" à une courte distance du ganglion (dans le champ de vision).
5. Isolement de neurones: les neurones Retirer avec une électrode forte que celle décrite pour les neurones sensoriels. Les neurones EPA sont differentiated à partir de neurones sensoriels LE voisins sur la base d'une tache de pigment foncé dans leurs petits corps cellulaires. Le neurone L7 peut être différencié du neurone L11 abord parce que la L11 est caudale à L7, L11, car le corps cellulaire est plus de forme oblongue alors que le corps cellulaire L7 est plus rond et parce que l'axone L11 tend à la branche en deux près de la cellule corps.
6. Neurones Placage: Utiliser un Pipetman (P10) pour transférer les neurones individuels de l'antenne Sylgard à une boîte de culture tel que décrit pour les neurones sensoriels.
7. Jumelage avec les neurones sensoriels: Laissez les neurones moteurs adhérer à la boîte de culture pendant au moins 1 heure. Puis ajoutez les neurones sensoriels isolés avec un Pipetman, la prestation de chaque neurone sensoriel à côté d'un neurone moteur plaqué. L'utilisation d'un verre de forte électrode attentivement redresser l'axone des neurones sensoriels, et coaxiale le corps de cellules sensorielles à une position à côté du neurone moteur, à une distance égale ou légèrement inférieure à la longueur de l'axone des cellules sensorielles. Utilisation de l'électrode de verre, câble coaxial de l'axone sensoriel pour entrer en contact avec le neurone moteur, très doucement à l'aide du côté de l'électrode conique d'avoir enfin l'axone sensoriel contact physique avec l'axone du neurone moteur. Ne pas soulever la boîte de culture, mais plutôt glissent doucement le plat le long de la platine du microscope.
8. Laissez les plats sur la platine du microscope à la température ambiante pendant au moins 3 heures et le transfert dans un incubateur à 18 ° C comme décrit pour les neurones sensoriels.
9. Les cultures devraient adhérer à l'antenne un délai d'environ 3 heures et la croissance des neurites nouvelle devrait être visible dans les heures 6-12 environ. Les neurones sensoriels forment synapses glutamatergiques avec les neurones moteurs très rapidement - dès que la cellule sont assez adhérente pour effectuer l'enregistrement d'électrode forte (3-5 heures), une post-synaptiques excitateurs potentiels peuvent être enregistrées. Connectivité synaptique continue à augmenter jusqu'à DIV 3, et est ensuite stable jusqu'en DIV7. Les neurones doivent montrer neurites élaborée lors de un à trois premiers jours de culture.

C. Préparation d'hémolymphe

Hémolymphe est utilisée comme un facteur de croissance dans la culture aplysie (analogue à l'utilisation de sérum de veau fœtal en culture de cellules de mammifères). Il est recueilli à partir de grande taille (500 g-1 kg) des animaux, et le meilleur moment pour recueillir l'hémolymphe (anecdotique) est au cours du printemps (mi-Mars à Juin). Swaddle l'animal dans un sous-tapis jetables sorte que seule une petite partie de l'animal est exposé, nettoyer cette portion de la peau avec de l'éthanol, puis maintenez tandis qu'une autre personne utilise une lame de rasoir stérile pour faire une incision dans la zone exposée. Pressez l'animal de sorte que les jets hémolymphe dans un bécher propre, en s'assurant qu'il ne touche pas la peau sale de l'animal. L'hémolymphe remplit le hemocoel de l'animal (par exemple, l'animal est essentiellement un sac d'hémolymphe). Remballer l'animal une fois ou deux, faire une incision de nouvelles et presser difficiles à recueillir hémolymphe autant que possible (à frais virés dans un bécher de nouveaux afin que, si elle est contaminée, la première collection est encore utilisable). Hémolymphe de chaque animal doit être gardé séparément (par exemple, ne hémolymphe piscine à partir de différents animaux). Spin l'hémolymphe à 2000 xg pendant 10 min pour éliminer les cellules sanguines. Aliquoter le surnageant en aliquots de 10 ml, l'étiquette par un animal et stocker à -80 ° C. Notez que l'hémolymphe conservés à -20 ° C forme un précipité dans le milieu. Une partie aliquote de nouvelles d'hémolymphe doit être utilisé chaque fois un milieu de culture est préparé, et l'aliquote doivent être décongelés juste avant la préparation du milieu. Ne pas recongeler après décongélation.

Discussion

La bonne préparation des aplysie sensori-motrices des cultures a une courbe d'apprentissage assez lent, car il implique le développement de la motricité fine associée à la microdissection et la manipulation des neurones individuels vue à travers un stéréomicroscope. Dans notre expérience, il faut environ 1-3 semaines de pratique pour obtenir saine isolées neurones sensoriels en culture et une semaine supplémentaire 1-3 pour apprendre à paire neurones sensoriels avec les neurones moteurs. Nous avons régulièr...

Matériaux

Solutions nécessaires pour la culture

1. 0,35 M MgCl _2, stockées à température ambiante, utilisée pour l'anesthésie.
2. Poly-L-lysine solution, Sigma: P-1524, PM> 300000, faite en sodium borate 0,1 M pH8.2 à 0.5mg/ml solution. Vortex bien et stériliser par filtration à travers un filtre de 0,22 um, le stocker à ° 4C. Ne pas de gel-dégel.
3. Poudre de milieu L-15 (Leibovitz) (Sigma: L4386) complété par les sels comme ci-dessous pour faire 1 litre
   

   L-15 en poudre	13,8 g
   NaCl	15,4 g
   D-glucose	6,24 g
   MgSO 4 7H 2 0	6.45g
   KCl	350 mg
   NaHCO 3	170 mg
   MgCl 2 6H 2 O	5,49 g
   CaCl 2, 2H 2 O	1.43g
   HEPES	3.53g

   Ajouter ddH20 à 1 litre. Le pH devrait être d'environ 7.4 à 7.5, ajouter 10ml de 100X Pen / Strep solution, et le filtre de stériliser à travers un filtre 0,22 m. Entreposer à 4C0 pour les plus de 1 mois.
4. Solution de digestion de protéase: 1% de protéase IX (1unit/mg) est faite dans L15 (complété avec des sels comme ci-dessus) ou en ASW immédiatement avant usage, stérilisée par filtration à travers un Millipore 0,22 m. 5mls devrait être suffisant pour les ganglions de deux animaux (assurez-vous que les ganglions sont complètement immergés dans une solution de protéase). Sigma a déclaré qu'ils vont cesser de vendre de protéase IX. Une protéase de substitution est: dispase II (Roche Applied Science catalogue # 04942078001).
5. Le milieu de culture. Immédiatement avant la préparation des cultures, décongeler un aliquot de 10 ml d'hémolymphe et le mélanger avec 10 ml de L15 (complété avec des sels ci-dessus) pour faire un milieu de culture 20mls. Ajouter 200 pi de 200mm L-Glutamine, bien mélanger et à utiliser pour préparer des cultures. Ce milieu doit être préparé à chaque fois les cultures sont faites.
6. Eau de mer artificielle peut être faite de Instant Ocean (Aquarium Systems, Mentor, OH) ou comme suit: 450 mM NaCl, 10 mM de KCl, 30 mM MgCl ₂ (6H ₂ O), 20 mM MgSO _4, 10 mM de CaCl ₂ (2H ₂ O), 10 mM HEPES, avec un pH ajusté à 7,4.